高危角膜移植大鼠排斥反應及VEGF-C/D表達的研究

王啟明，趙心悅，王　智

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·實驗論著·

高危角膜移植大鼠排斥反應及VEGF-C/D表達的研究

王啟明，趙心悅，王智

Abstract

?AIM: To investigate the expression and the significance of VEGF-C/D in rat cornea after alkali burning as well as the role of lymphangiogenesis in the high-risk corneal transplantation rejection.

?METHODS: The model of alkali burn corneal was made.Different times corneas were taken to electron microscope for vascularization,and examined the expression of VEGF-C/D and VEGFR-3 in l,3,5,7,14,28d.The other rat cornea after alkali burn were divided into four parts to penetrate keratoplasty,containing only blood vessels in the cornea (group A),angiogenesis and lymphangiogenesis (group B),lymphangiogenesis degenerating period (group C),angiogenesis degenerating period (group D).In addition,there are also normal groups (group N) to compare the RI values and survival time of corneal graft.

?RESULTS: Electron microscopy showed that,when the first 7d rat cornea appeared neovascularization after alkali burn,but not lymphangiogenesis.The occurrence of new blood vessels and lymphatic in 2wk.There were no obvious lymphangiogenesis in 5wk and the angiogenesis gradually subside in 8 wk.The expression of VEGF-C/D and VEGFR-3 in the corneas of rats were up-regulated in the third days after the injury,and reached its peaks at 5d.The average survival time of group N,A,B,C,D were (14.25±0.62)d,(9.35±1.02)d,(5.06±1.13)d,(8.71±0.83)d,(9.44±1.05)d after transplant cornea.Compared to the rest of the group,group B plant average survival time significantly shortened (P<0.05),while compared with group B,the survival time of A,C,D groups were significantly longer (P<0.05).

?CONCLUSION: VEGF - C/D and VEGFR-3 are expressed significantly after corneal alkali burn.New lymphatic vessels can accelerate high-risk corneal transplantation immune rejection.

目的：探討鼠角膜堿燒傷后VEGF-C/D的表達和意義，以及新生淋巴管在高危角膜移植后排斥反應中的作用。

方法：制作角膜堿燒傷模型，取不同時間段角膜進行電鏡觀察,觀察角膜血管化情況；采用免疫組織化學方法檢測l、3、5、7、14、28d角膜組織VEGF-C/D及VEGFR-3的表達；并在角膜中僅有血管(A組)，同時存在新生血管及新生淋巴管(B組)，新生淋巴管消退期(C組)，角膜新生血管消退期(D組)以及正常組(N組)進行穿透性角膜移植，比較不同角膜植片的排斥反應指數(rejection index，RI)值及存活時間。

結果：電鏡觀察發現，在堿燒傷后第7d時鼠角膜出現新生血管，未出現新生淋巴管，在堿燒傷2wk時出現新生血管的同時出現淋巴管，5wk時無明顯的新生淋巴管，8wk時新生血管逐漸消退；大鼠角膜組織中VEGF-C/D及VEGFR-3的表達從第3d開始明顯上升，并于第5d達到最高峰。角膜移植后N、A、B、C、D組的植片平均存活時間分別為14.25±0.62、9.35±1.02、5.06±1.13、8.71±0.83、9.44±1.05d。組間比較發現，B組植片平均存活時間顯著性縮短(P<0.05)，A、C、D的存活時間均顯著性延長(P<0.05)。

結論：角膜堿燒傷后存在VEGF-C/D及VEGFR-3的高表達，而且新生淋巴管能加速高危角膜移植后的免疫排斥反應。

角膜移植；新生血管；淋巴管；堿燒傷；免疫排斥

引用：王啟明，趙心悅，王智.高危角膜移植大鼠排斥反應及VEGF-C/D表達的研究.國際眼科雜志2016;16(10):1812-1815

0　引言

據統計，全世界因角膜病而導致雙眼盲目者約1千萬，我國約占盲目總人數的15.38%。角膜移植術是角膜盲的唯一復明手段。但是免疫排斥是導致植片失敗的最主要原因[1]。角膜血管化是其首要的“高危”因素，盡管術后運用各類免疫抑制類藥物，仍有超過49%的角膜植片不可避免地發生了免疫排斥；而在眼化學傷類血管化的角膜上行角膜移植，其排斥率甚至高達90%[2]。因此深入探討高危角膜移植術后免疫排斥反應的機制，能夠有效地提高其預后，具有實際的臨床意義。在角膜免疫中，角膜新生血管與新生淋巴管共同構成了角膜的“免疫雙臂”。然而相對于新生血管的研究，角膜新生淋巴管的研究尚屬于起步階段。目前，雖然對角膜淋巴管新生的機制尚未完全闡明，但VEGF-C/D-VEGFR3是公認的、首要的調控因子。我們在前期研究的基礎之上，分別在淋巴管生長的不同時期行角膜移植，以明確淋巴管在“高危”角膜移植免疫排斥中的決定性作用，并對VEGF-C/D的表達進行研究。

1　材料和方法

1.1材料選擇健康無眼病雄性SD大鼠81只，Wistar大鼠15只作為角膜移植供體(供體眼為雙眼)，體質量180～230g。隨機取13只SD大鼠作為正常角膜組(N組)，剩余SD大鼠為堿燒傷實驗組。制備角膜Ⅲ級燒傷程度，立即用100mL生理鹽水沖洗角膜及結膜囊至眼表pH值接近7.0。ELISA試劑盒購于上海一研生物科技有限公司。利用抗原免疫動物獲得的羊抗大鼠LYVE-1多克隆抗體、羊抗大鼠VEGFR-3多克隆抗體及羊抗大鼠VEGF多克隆抗體購自上海翔升生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1角膜堿燒傷模型的制備方法角膜堿燒傷模型的制備方法[3]：水合氯醛(350mg/kg)全身麻醉后，制備直徑約3mm Whatman的圓形濾紙在1μmol/L的NaOH中浸透20s，取出濾紙用干燥紙片吸除多余濾液，貼于角膜中央燒灼30s。移去濾紙后立即用無菌生理鹽水沖洗結膜囊，以氯霉素眼液滴眼。正常組大鼠麻醉后，用生理鹽水沖洗結膜囊,氯霉素眼液滴眼。

1.2.2電鏡觀察從堿燒傷實驗組中抽取30只大鼠，每組5只，于第3、7d，2、3、5、8wk取角膜做電鏡觀察，正常組取5只作為對照。無菌條件下距角膜緣內1mm處平行角膜緣環形剪取角膜，2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定2h，1%鋨酸固定2h，蒸餾水洗后，用50%、70%、80%、90%、100%丙酮逐級常規脫水，包埋，制超薄切片后，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察。

1.2.3VEGF-C/D和VEGFR-3表達從堿燒傷實驗組抽取18只(36眼)，分成6組，每組3只(6眼)，分別于第1、3、5、7、14、21、28d按上述方法去角膜組織后，用10%中性福爾馬林液中固定24h，常規逐級脫水，用二甲苯透明，浸蠟后包埋；正常組取3只作為對照。采用免疫組織化學染色法。免疫組織化學染色：石蠟切片進行脫蠟和水化及阻斷后，用免疫試劑盒進行檢測，具體操作步驟依照試劑盒說明。光鏡下表現為細胞質內表現出基本均勻的棕黃色或棕褐色顆粒狀反應為陽性表達。VEGF-C/D、VEGFR-3表達采用常規二步法檢測，免疫組織化學計算機圖像分析，方法為：每個角膜取5張切片，顯微鏡下低倍視野尋找到染色清晰、背景良好的區域，每張切片于在×400下各隨機采集10幅圖像并采用ImageProPlus6 圖像分析軟件分析，計算5張切片的平均光密度，以此作為陽性細胞的平均光密度。

1.2.4穿透性角膜移植的方法[4-5]受體大鼠于術前用水合氯醛(350mg/kg)全身麻醉后，用10g/L阿托品眼水散瞳，手術顯微鏡下嚴格無菌操作。首先于供體角膜中央區鉆取直徑為3mm植片，置于Optisol液中備用。用直徑3mm環鉆鉆取受體大鼠中央區角膜后，制備植床，將供體角膜植片置于植床。以10-0尼龍絲線間斷縫合8針，線結暴露不包埋。術后用妥布霉素滴眼液滴眼。

1.2.5角膜移植后觀察病理變化從燒傷實驗組中抽取20只大鼠，每組5只，于角膜堿燒傷后僅出現新生血管(A組)，角膜新生血管及新生淋巴管達到高峰(B組)，角膜新生淋巴管消退期(C組)及角膜新生血管消退期(D組)進行穿透性角膜移植。正常組取5只為對照(N組)。鉆取角膜組織后，于10%中性福爾馬林液中固定24h，制備角膜蠟塊后，作4μm厚連續切片，梯度酒精脫水，伊紅及蘇木素染色，顯微鏡下觀察角膜組織中的細胞浸潤、新生血管及組織水腫的情況。

1.2.6角膜移植后觀察指標術后每天在裂隙燈顯微鏡下觀察術眼角膜。參照Holland等[6]制定的標準，以混濁、水腫和新生血管 3 項指標進行評分。混濁指標：0分為完全透明，1分為植片輕度混濁，2分為混濁較重，虹膜紋理模糊可見，3為虹膜血管窺不清，但瞳孔輪廓可見；4分為瞳孔輪廓不清。水腫指標：0分為無水腫，1分為中度水腫，2分為伴有植片增厚的顯著水腫。新生血管評分：1分為新生血管在任何象限伸入達到植片半徑的25%以內；2分為新生血管達到植片半徑的50%以內；3分為新生血管達到植片半徑的75%以內；4分為新生血管達到植片中央。3 項評分之和定為當日的排斥反應指數(RI)。當 RI≥5時或混濁一項達到 3 分時視為排斥反應發生。

2　結果

2.1堿燒傷后電鏡檢測正常對照組大鼠所取的角膜組織內未發現血管和淋巴管，在堿燒傷第7d時基質層出現新生血管，但未出現新生淋巴管，而在堿燒傷2wk基質層出現新生血管的同時出現新生淋巴管。新生血管細胞外有完整的基底膜，外周常可見周細胞。管腔內常可見紅細胞；而淋巴管無周細胞，基底膜不完整，管腔內無紅細胞。3wk時新生血管與新生淋巴管同時達到高峰，但新生淋巴管角較新生血管早發生退化，5wk時已無明顯的新生淋巴管，8wk時新生血管逐漸消退(圖1)。

2.2角膜VEGF-C/D和VEGFR-3的表達免疫組織化學顯示正常對照組大鼠角膜僅有極弱的VEGF-C/D的陽性表達。角膜堿燒傷后，其表達開始逐漸增強。第3d角膜基質層有明顯的VEGF-C/D的陽性表達，在第5d時達到高峰，主要表達于角膜的上皮層，表達的陽性顆粒多位于浸潤的炎細胞及管腔周圍，燒傷后14、21d表達逐漸降低，到28d末時表達極弱，與正常對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。正常大鼠角膜中VEGFR-3表達極其微弱，3d時開始明顯增加，5d表達達高峰，此后表達開始逐漸下降，至28d末表達極弱。但與正常對照組相比，差異具有統計學意義(P<0.05，表1，圖2、3)。

圖1大鼠角膜堿燒傷2wk電鏡檢測A，B：血管可見管腔內有紅細胞；C，D：淋巴管(C圖可見淋巴細胞內皮核)。

2.3角膜排斥反應的顯微鏡檢測本實驗在正常組(N組)，角膜堿燒傷后1wk(僅出現新生血管，A組)，3wk(角膜新生血管及新生淋巴管達到高峰，B組)，5wk(角膜新生淋巴管消退期，C組)及8wk(角膜新生血管消退期，D組)進行穿透性角膜移植。角膜移植后均出現過混濁、水腫，幾天后開始透明，可能為手術創傷所致。角膜移植后7d，N組植片中僅有少量炎癥細胞浸潤，但植片透明，瞳孔清晰可見。A組植片有一定數量炎癥細胞浸潤，上皮層水腫，輕度混濁，RI 為1.32±0.45；B組植片中大量的炎癥細胞浸潤，基質層有水腫，大量的角膜新生血管侵入植片，新生血管累及角膜的3～4個象限，部分血管生長已達瞳孔中央，RI 為7.52±0.61。C組和D組植片中有一定數量的炎癥細胞浸潤，角膜新生血管侵及植片的1～2個象限，RI分別為4.32±0.1和3.21±0.35。各組之間比較，N組角膜中血管的生長速度及密度最低，而B組最高。N組的存活時間為14.25±0.62d，與N組相比，A組(9.35±1.02d)、B組(5.06±1.13d)、C組(8.71±0.83d)、D組(9.44±1.05d)均顯著性縮短(P<0.05)，與B組相比，A、C、D的存活時間均顯著性延長(P<0.05)。對各組的存活率進行比較，可知 A、C、D三組植片的存活率與B組比較均較高，差異有統計學意義(P<0.05)，A、C、D組比較，差異無統計學意義(P>0.05，圖4、5)。

3　討論

角膜堿燒傷是一種常見的眼科疾病，常能引起角膜上皮缺損、基質炎性細胞浸潤、水腫、混濁，致角膜血管化，破壞角膜免疫赦免狀態，還降低了其后角膜移植的成功率[7]。之前的研究多側重于角膜新生血管，近年來對角膜淋巴管的研究逐漸重視。研究表明VEGF-C/D及VEGFR-3是調控淋巴管新生的重要信號途徑之一。VEGF-C/D是VEGF家族成員之一，是特異性的淋巴管生長因子，能夠選擇性地促進淋巴管增生，增強淋巴管的通透性[8]。VEGFR-3時是VEGF-C/D的配體之一，研究表明其能維持淋巴管系統的穩定。VEGFR-3與VEGF-C/D結合后通過 MAPK途徑引起淋巴管的內皮細胞增殖以及分化等一系列生物學行為的發生[9]。

本實驗大鼠角膜堿燒傷后VEGF-C/D及VEGFR-3在角膜中有一個動態的過程，第3d角膜基質層有明顯的陽性表達，在第5d時達到高峰，還伴隨著淋巴管的生成，則表明VEGF-C/D與VEGFR-3有可能是角膜堿燒傷后淋巴管生成的重要原因之一。

時間VEGF-C/DVEGFR-30d0.087±0.0120.081±0.0131d0.165±0.0140.122±0.0173d0.241±0.0110.235±0.0115d0.416±0.0190.411±0.0137d0.287±0.0080.291±0.01914d0.179±0.0150.194±0.01421d0.136±0.0110.145±0.01028d0.115±0.0060.108±0.005

圖2堿燒傷后不同時間點VEGF-C/D和VEGFR-3表達的動態變化。

圖3角膜堿燒傷3d 后VEGF-C/D(A)和VEGFR-3(B)的表達A：VEGF-C/D；B：VEGFR-3。

圖4角膜植片不同時期的RI變化曲線A：燒傷后1wk；B：燒傷后3wk；C：燒傷后5wk；D：燒傷后8wk。

圖5各組大鼠的角膜植片存活曲線。

免疫排斥反應是角膜移植失敗的主要原因。正常角膜中沒有血管以及淋巴管，因此能維持角膜處于相對的免疫赦免狀態[10]。然而，血管化角膜中存在著新生淋巴管，這意味著在血管化角膜中進行角膜移植能夠誘發免疫排斥反應。

我們發現在堿燒傷第7d時基質層出現新生血管，但未出現新生淋巴管，而在堿燒傷2wk基質層出現新生血管的同時出現新生淋巴管，3wk時新生血管與新生淋巴管同時達到高峰，5wk時已無明顯的新生淋巴管，8wk時新生血管逐漸消退。說明新生淋巴管和血管的生長并不完全平行而出現了“分離生長”[11]。因此在角膜的不同時期進行角膜移植，發現B組植片存活時間顯著縮短，說明角膜新生血管及淋巴管在高危角膜移植的免疫排斥反應中起重要作用。而A、C、D三組植片之間無統計學意義，說明相比較新生血管而言，新生淋巴管在角膜移植反應中所起的作用更為顯著。

總之，本研究觀察了角膜堿燒傷后新生血管及淋巴管的情況，并對VEGF-C/D及VEGFR-3的表達進行了初步探討，而且對高危角膜移植中淋巴管的作用進行了研究，為角膜移植免疫排斥反應提供一個新的研究思路。

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Study of high-risk corneal transplantation rejection and the expression of VEGF-C/D

Qi-Ming Wang,Xin-Yue Zhao,Zhi Wang

Department of Science and Technology Project in Hubei Province (No.2015CFB622)

Qi-Ming Wang.Department of Ophthalmology,Union Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430000,Hubei Province,China.zrl13530912001@163.com

2016-04-26Accepted：2016-09-06

corneal transplantation; corneal neovascularization; corneal lymphangiogenesis; alkali burn; immune rejection

湖北省科學技術廳資助項目(No.2015CFB622)

(430000)中國湖北省武漢市，華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院眼科

王啟明，博士，主治醫師，研究方向：眼角膜病變。

王啟明.zrl13530912001@163.com

2016-04-26

2016-09-06

Department of Ophthalmology,Union Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430000,Hubei Province,China

Wang QM,Zhao XY,Wang Z.Study of high-risk corneal transplantation rejection and the expression of VEGF-C/D.Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci) 2016;16(10):1812-1815

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.10.06