結(jié)膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷中PMNs浸潤的變化

宋東宇，高明宏，崔珊珊

?

·實(shí)驗(yàn)研究·

結(jié)膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷中PMNs浸潤的變化

宋東宇1，高明宏2，崔珊珊1

1Department of Ophthalmology,Chaoyang Central Hospital,Chaoyang 110016,Liaoning Province,China;2Department of Ophthalmology,the General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,Liaoning Province,China

Abstract

?AIM: To study the infiltration of polymorphonuclear neutrophils (PMNs) after conjunctival flap covering in alkali-burned cornea.

?METHODS: Rabbit cornea alkali-burned model was made,then 50 rabbits were randomly divided into the experimental group (n=25) and the control group (n=25).At the same time the surgery of conjunctival flap covering was given to rabbits of the experimental group.The condition developing of alkali-burned cornea was observed by slit lamp biomicroscopy,and took photos in two groups.The infiltration of PMNs was identified by hematoxylin eosin (HE) staining in different periods.

?RESULTS:The quantity of PMNs increased on the 3d,reached the lower level on 7d,shown a peak on the 14d,then decreased gradually.PMNs level of the experimental group was significantly lower than that in the control group,and the difference of 3,14 and 21d was significant (P<0.05).

?CONCLUSION: During the wound healing process,alkali-burned cornea has close relation with the infiltration of PMNs.The treatment of conjunctival flap covering for the severe alkali-burned cornea was found to have good effect.

目的：研究結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)治療角膜堿燒傷的療效及損傷修復(fù)中多形核中性白細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)的浸潤情況。

方法：選取50只兔，隨機(jī)分為兩組，每組25只，即實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，并建立兔角膜堿燒傷模型。實(shí)驗(yàn)組在角膜堿燒傷后當(dāng)天行結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)。裂隙燈下觀察兩組角膜病損恢復(fù)情況并照相。采用蘇木素-伊紅(HE)染色切片后測定兩組角膜堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)PMNs的浸潤量值。

結(jié)果：PMNs在角膜堿燒傷后的3d開始升高，大量浸潤角膜，7d略有下降，14d上升達(dá)到最大峰值，之后逐漸降低，早期分布在燒傷部位角膜基質(zhì)內(nèi)，后期則與潰瘍浸潤面積相一致。實(shí)驗(yàn)組PMNs的計(jì)數(shù)均明顯低于對(duì)照組，且角膜堿燒傷后的3、14和21d的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：結(jié)膜瓣遮蓋治療重度角膜堿燒傷的療效確切，角膜的病理損傷和修復(fù)與PMNs的浸潤密切相關(guān)。

結(jié)膜瓣；角膜堿燒傷；多形核中性白細(xì)胞

引用：宋東宇，高明宏，崔珊珊.結(jié)膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷中PMNs浸潤的變化.國際眼科雜志2016;16(10):1824-1827

0　引言

角膜堿燒傷是一種病損較重且難以治療的化學(xué)性眼外傷，由于堿能溶解脂肪和蛋白質(zhì)，易于浸潤至角膜深層，造成嚴(yán)重的角膜潰瘍?nèi)芙猓陂g發(fā)生了復(fù)雜的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致大量多形核中性白細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)浸潤，進(jìn)而導(dǎo)致眾多損傷因子、蛋白酶類破壞角膜組織。在治療中，角膜堿燒傷后損傷修復(fù)的機(jī)制復(fù)雜，如何抑制炎癥反應(yīng)，如何認(rèn)識(shí)炎癥反應(yīng)在角膜損傷中的分子機(jī)制，尚需研究。本實(shí)驗(yàn)通過在體動(dòng)物角膜模型的建立，探究結(jié)膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷的手術(shù)療效及 PMNs在損傷修復(fù)過程中的浸潤時(shí)相，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康日本白兔50只(沈陽藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，12月齡，體質(zhì)量2.0～2.5kg，雌雄各半，右眼為實(shí)驗(yàn)眼，實(shí)驗(yàn)前裂隙燈下眼部檢查無病變，按體質(zhì)量和性別隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各25只，相同條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中，動(dòng)物的使用遵循國家科技部頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2主要儀器裂隙燈顯微鏡(SL-6E，Topcon)、手術(shù)顯微鏡(SN.MD-2，日本)、恒溫水浴箱(ZD600，杭州)、凈化工作臺(tái)(SW-CJ-IFD，江蘇)、振蕩器(JHYC-3，北京)、切片機(jī)(HM325，德國)、漂烘處理儀(PHY-3，廣東)、圖像分析儀(Image8000，澳大利亞)、生物顯微鏡(CK×53，Olympus)和Image Plus5.0圖像分析系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1兔角膜堿燒傷模型的建立應(yīng)用8.0mm直徑角膜環(huán)鉆鉆取數(shù)張圓形單層濾紙片(確保濾紙片大小一致)，浸潤于1.0mol/L NaOH溶液中至飽和，撈取備用。固定實(shí)驗(yàn)兔，右眼表面麻醉，應(yīng)用20g/L丙美卡因眼液點(diǎn)眼3次，開瞼器開瞼后，將備用的濾紙片置于兔中央角膜區(qū)，使濾紙片與角膜表面充分貼附，1min后迅速取下，立即用大量生理鹽水沖洗角結(jié)膜表面及上下結(jié)膜穹隆部5min，5g/L阿托品眼用凝膠涂患眼。依據(jù)全國眼外傷職業(yè)病學(xué)組通過的標(biāo)準(zhǔn)使兔角膜達(dá)到Ⅲ級(jí)堿燒傷程度，按此方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各25只兔右眼均進(jìn)行角膜堿燒傷模型的建立。

1.2.2結(jié)膜瓣遮蓋手術(shù)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組25只兔的右眼均在角膜堿燒傷模型建立的當(dāng)日行結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)，具體方法如下：兔腹腔內(nèi)注射10g/L戊巴比妥鈉45mg進(jìn)行全身麻醉，注意進(jìn)針深度避免損傷腹腔臟器，麻醉滿意后右眼上置開瞼器，注射生理鹽水將球結(jié)膜與下方筋膜組織分離，手術(shù)顯微鏡下沿角膜緣360°環(huán)形切開球結(jié)膜，將結(jié)膜與筋膜充分分離至穹隆部，刮除殘存的周邊角膜上皮層，用游離的結(jié)膜瓣完整覆蓋角膜，10-0手術(shù)縫線連續(xù)對(duì)位縫合結(jié)膜瓣。同時(shí)刮除對(duì)照組右眼角膜堿燒傷后周邊殘存的上皮組織。手術(shù)操作均由同一技術(shù)熟練的實(shí)驗(yàn)人員完成。

1.2.3治療用藥和處理堿燒傷后3d內(nèi)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兔右眼均給予藥物治療，阿托品眼用凝膠，1次/d；小牛血去蛋白提取物眼用凝膠，3次/d。分別于3、7、14、21和28d隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各5只兔，腹腔注藥麻醉后對(duì)右眼進(jìn)行裂隙燈檢查及眼前節(jié)照相，通過耳緣靜脈注入5mL空氣窒息處死。

1.2.4標(biāo)本獲取和處理處死兔后，用力擠壓眶周使眼球突出，快速摘除右眼球，沿角鞏膜緣環(huán)形切取角膜，實(shí)驗(yàn)組注意保留角膜表面的結(jié)膜瓣，甲醛溶液固定，酒精梯度脫水，二甲苯溶液透色，常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，脫蠟后常規(guī)蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色。400倍顯微鏡下觀察HE染色切片，胞核藍(lán)色深染的為PMNs。

2　結(jié)果

2.1裂隙燈顯微鏡下觀察兔右眼瞼紅腫逐漸消退，初期眼球表面大量粘稠分泌物，燒傷的角膜中央可見邊界欠清的灰白色潰瘍病灶，深達(dá)基質(zhì)層，眼內(nèi)結(jié)構(gòu)窺視不清。14d對(duì)照組角膜潰瘍面積及深度最重，周邊生長大量新生血管，角膜潰瘍?nèi)芙庾顬閲?yán)重；14d實(shí)驗(yàn)組結(jié)膜瓣水腫，與角膜緊密附著，呈淺灰白色，縫線處愈合良好，結(jié)膜瓣下隱約可見角膜潰瘍?nèi)芙廨^輕；28d對(duì)照組角膜潰瘍病灶大面積瘢痕化，表面大量新生血管，透明度差；28d實(shí)驗(yàn)組結(jié)膜瓣已大部分溶解變薄，角膜病灶趨于結(jié)膜化，瘢痕較輕，新生血管較少，潰瘍愈合良好，角膜透明度明顯優(yōu)于同期對(duì)照組。角膜堿燒傷后的溶解高峰出現(xiàn)在堿燒傷后的14d(圖1)。

2.2HE染色切片觀察在顯微鏡400倍下觀察HE染色切片，胞核藍(lán)色深染的為PMNs。角膜堿燒傷后，3d對(duì)照組潰瘍病灶區(qū)上皮缺失，上皮下可見PMNs，基質(zhì)層水腫增厚，膠原纖維已見紊亂；3d結(jié)膜瓣遮蓋的實(shí)驗(yàn)組損傷明顯減輕，PMNs較少，基質(zhì)的膠原纖維尚清晰平整，結(jié)膜瓣尚未與角膜表層粘合溶解，易于脫離。對(duì)照組14d，堿燒傷的角膜上皮層部分恢復(fù)，細(xì)胞水腫，基質(zhì)增厚，板層纖維斷裂溶解，特別是壞死區(qū)、潰瘍區(qū)及鄰近潰瘍的上皮細(xì)胞下可見大量PMNs浸潤，大量新生血管，膠原纖維排列明顯紊亂；而結(jié)膜瓣遮蓋14d的實(shí)驗(yàn)組結(jié)膜瓣已與角膜基質(zhì)大部分融合，基質(zhì)層細(xì)胞排列較整齊，水腫增厚較輕，且均勻增厚，膠原纖維排列紊亂較輕，結(jié)膜瓣下炎性細(xì)胞及基質(zhì)層中新生血管較少(圖2)。

2.3PMNs的量值經(jīng)檢驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，滿足方差齊性，實(shí)驗(yàn)組PMNs數(shù)密度值明顯低于對(duì)照組(F=18.31，P=0.000)，PMNs數(shù)密度值隨時(shí)間延長出現(xiàn)明顯波動(dòng)(先上升后下降)(F=41.15，P=0.000)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組PMNs數(shù)密度值均低于對(duì)照組，組間均數(shù)比較用兩樣本t檢驗(yàn)(表1)，3、14和21d差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的PMNs數(shù)密度值相互比較用SNK-q檢驗(yàn)(表2)，可見不同時(shí)間點(diǎn)PMNs數(shù)密度值變化明顯(P<0.05)，堿燒傷后3d即有大量PMNs產(chǎn)生，7d時(shí)有所下降，之后明顯提升且在14d時(shí)達(dá)到高峰，14d后逐漸降低，在28d降至接近燒傷7d時(shí)水平。

3　討論

結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)在臨床治療中經(jīng)常用于治療重度角膜潰瘍及燒傷，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道較少，其手術(shù)靈活簡單，無需復(fù)雜的手術(shù)設(shè)備及器械，不受材料的制約，且治療費(fèi)用低，術(shù)后療效好。手術(shù)技巧在于結(jié)膜瓣應(yīng)薄而均勻，少含或不含下方的筋膜組織，避免出現(xiàn)結(jié)膜孔洞，結(jié)膜瓣應(yīng)充分遮蓋角膜病灶，術(shù)中張力較大時(shí)應(yīng)淺層鞏膜固定。本實(shí)驗(yàn)在術(shù)中徹底清除了殘存的角膜上皮層，避免結(jié)膜瓣與角膜病灶不融合，為了達(dá)到同等實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)照組也刮除了殘存的角膜上皮層。在臨床治療中應(yīng)徹底清除所有的角膜病灶區(qū)的壞死組織后再行遮蓋術(shù)，而本文未清除角膜病灶，以利于與對(duì)照組在同等條件下進(jìn)行對(duì)比觀察。值得注意的是兔角膜的直徑較大，應(yīng)充分圓周分離結(jié)膜瓣，必要時(shí)切除第三眼瞼才能達(dá)到全角膜遮蓋的治療目的。

圖1裂隙燈顯微鏡觀察角膜堿燒傷情況A：堿燒傷后14d； B：結(jié)膜瓣遮蓋后14d；C：堿燒傷后28d；D：結(jié)膜瓣遮蓋后28d；A與B比較，C與D比較，均可見堿燒傷后的對(duì)照組較結(jié)膜瓣遮蓋的實(shí)驗(yàn)組角膜表面新生血管更多，角膜透明度更差。

圖2HE染色切片觀察PMNs的表達(dá)和新生血管(×400)A：堿燒傷后3d；B：結(jié)膜瓣遮蓋后3d；C：堿燒傷后14d；D：結(jié)膜瓣遮蓋后14d。三角示PMNs，箭頭示新生血管；A與B比較，C與D比較，均可見堿燒傷后的對(duì)照組較結(jié)膜瓣遮蓋的實(shí)驗(yàn)組PMNs和新生血管增多，角膜基質(zhì)纖維更為紊亂。

表2兔角膜組織中不同時(shí)間點(diǎn)PMNs數(shù)密度值的組內(nèi)相互比較

組內(nèi)比較實(shí)驗(yàn)組qP對(duì)照組qP3d與7d0.8302>0.056.6104<0.013d與14d22.1376<0.0117.4789<0.013d與21d16.2404<0.0113.7110<0.013d與28d1.7833>0.058.2960<0.017d與14d22.9678<0.0124.0892<0.017d與21d17.0705<0.0120.3213<0.017d與28d0.9531>0.051.6856>0.0514d與21d5.8972<0.013.7679<0.0514d與28d23.9209<0.0125.7749<0.0121d與28d18.0237<0.0122.0070<0.01

結(jié)膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷及抑制PMNs浸潤的機(jī)制尚不明確，通過遮蓋的結(jié)膜瓣人為造成“角膜上皮化”，機(jī)械性保護(hù)角膜創(chuàng)面，減弱溶解酶、鐵蛋白酶和膠原蛋白酶的溶解作用，減弱眼表炎性分泌物的應(yīng)激刺激，加速了損傷修復(fù)的進(jìn)程，促進(jìn)了結(jié)膜瓣與角膜潰瘍區(qū)的溶解愈合。結(jié)膜瓣含有豐富的血液和淋巴液，與燒傷角膜的密切接觸，可將結(jié)膜固有營養(yǎng)物質(zhì)，包括細(xì)胞修復(fù)成分和生長因子運(yùn)送到角膜病灶區(qū)，提高了局部抗炎能力，抑制了PMNs的浸潤，控制了潰瘍的發(fā)展，促進(jìn)上皮和基質(zhì)的愈合。在角膜潰瘍病灶區(qū)炎細(xì)胞浸潤部位，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)明顯增強(qiáng)，表明VEGF與炎性細(xì)胞主要是PMNs關(guān)系密切，VEGF促進(jìn)了角膜病灶區(qū)新生血管的生成[1]，這與我們?cè)诮Y(jié)膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷中抑制PMNs的浸潤中同時(shí)也減少了新生血管生成的結(jié)果相一致。在我們的實(shí)驗(yàn)中，不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組PMNs的浸潤量值均低于對(duì)照組，且3、14d和21d差異明顯具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組角膜的恢復(fù)情況及透明度明顯優(yōu)于對(duì)照組，證實(shí)了結(jié)膜瓣遮蓋在抑制PMNs浸潤的同時(shí)促進(jìn)了堿燒傷角膜的潰瘍愈合。

McCulley將化學(xué)性眼部燒傷的病程分為4個(gè)時(shí)期，分別是燒傷期(燒傷當(dāng)時(shí))、急性期(0～7d)、修復(fù)早期(1～3wk)和修復(fù)晚期(3wk以上)[2-3]，本實(shí)驗(yàn)研究的是角膜燒傷期、急性期和修復(fù)早期三個(gè)時(shí)相。我們通過建立動(dòng)物模型，對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行手術(shù)干預(yù)治療，并作組間和組內(nèi)比較，觀察急性期及修復(fù)早期堿燒傷角膜的組織學(xué)改變及潰瘍病灶中PMNs的浸潤時(shí)相。角膜堿燒傷后3d即有大量PMNs浸潤，而7d有所下降，高峰出現(xiàn)在傷后的14d，此時(shí)是角膜潰瘍活躍期，PMNs量值最大，且SNK-q檢驗(yàn)中第14d組與其他各組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，角膜溶解的病理損傷過程與PMNs的浸潤密切相關(guān)，這與Sosne等[4]研究一致。在位置分布規(guī)律上，早期PMNs分布在病灶邊緣角膜上皮及基質(zhì)內(nèi)，角膜表面少量浸潤；后期PMNs浸潤面積與潰瘍部位一致，這與Peebo等[5]的研究相符。有研究表明角膜堿燒傷后，潰瘍病灶表層大量PMNs生成，浸潤角膜基質(zhì)層并不斷吞噬壞死組織，直至引起PMNs的細(xì)胞溶酶體破裂，溶酶體酶大量進(jìn)入角膜病灶區(qū)，溶解角膜膠原蛋白，其中以金屬蛋白酶對(duì)角膜基質(zhì)層損傷較重，而金屬蛋白酶MMP-9主要來源于PMNs[6]。在我們以往的研究中也表明PMNs與MMP-9的浸潤具有一致性，PMNs還能分泌蛋白溶解酶原激活因子，產(chǎn)生大量纖維蛋白溶解酶來降解纖維蛋白和纖維連接蛋白，使部分修復(fù)的潰瘍創(chuàng)面再次病損溶解[3]。我們通過結(jié)膜瓣遮蓋病損潰瘍的角膜，抑制了PMNs的浸潤，減輕了角膜病損區(qū)的炎性反應(yīng)，減弱了與PMNs密切相關(guān)的金屬蛋白酶和蛋白溶解酶原激活因子對(duì)角膜病灶的損傷，從而有利于堿燒傷角膜的損傷恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)PMNs浸潤時(shí)相的研究，有利于指導(dǎo)臨床治療用藥，傷后3d即需廣譜抗生素眼水控制炎癥細(xì)胞PMNs的浸潤，進(jìn)而減少金屬蛋白酶和蛋白溶解酶原激活因子的分泌，有效地控制潰瘍的進(jìn)展。在角膜堿燒傷后的1wk內(nèi)，可以適量地應(yīng)用類固醇激素眼水，而7～21d是角膜堿燒傷后的潰瘍期，類固醇會(huì)通過降低膠原合成，抑制角膜基質(zhì)的修復(fù)。

本研究中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均未應(yīng)用抗生素眼液，有利于證實(shí)結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)控制角膜堿燒傷炎癥反應(yīng)的療效，闡明炎癥反應(yīng)中PMNs的浸潤時(shí)相，指導(dǎo)臨床治療。而在臨床治療中，除了炎性反應(yīng)的損傷因素外，角膜堿燒傷是多因素的損傷過程，如何有效防治角膜潰瘍?nèi)芙狻⑿律芑屠w維化，尚待深入研究。

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Changes in infiltration of polymorphonuclear neutrophils in alkali-burned cornea of conjunctival flap covering

Dong-Yu Song1,Ming-Hong Gao2,Shan-Shan Cui1

Shan-Shan Cui.Department of Ophthalmology,Chaoyang Central Hospital,Chaoyang 122000,Liaoning Province,China.song1567eye@163.com

2016-06-30Accepted：2016-09-01

conjunctival flap; alkali-burned cornea; polymorphonuclear neutrophils

1(122000)中國遼寧省朝陽市中心醫(yī)院眼科；2(110016)中國遼寧省沈陽市，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院眼科

宋東宇，男，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，研究方向：角膜病的基礎(chǔ)與臨床。

崔珊珊，女，畢業(yè)于中國醫(yī)科大學(xué)，研究生學(xué)歷，主任醫(yī)師，眼科主任，研究方向：眼表疾病與白內(nèi)障.song1567eye@163.com

2016-06-30

2016-09-01

Song DY,Gao MH,Cui SS.Changes in infiltration of polymorphonuclear neutrophils in alkali-burned cornea of conjunctival flap covering.Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci) 2016;16(10):1824-1827

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.10.09