三唑酮對青鳉魚和大型溞不同測試終點的毒性效應評價

劉 娜,金小偉,王業耀,,張鈴松,呂怡兵,楊 琦

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三唑酮對青鳉魚和大型溞不同測試終點的毒性效應評價

劉 娜1,金小偉2*,王業耀1,2,張鈴松3,呂怡兵2,楊 琦1

(1.中國地質大學(北京)水資源與環境學院,北京 100083；2.中國環境監測總站,北京 100012；3.中國環境科學研究院,環境基準與風險評估國家重點實驗室,北京 100012)

以青鳉魚和大型溞為代表性水生生物,研究三唑酮對其不同測試終點的慢性毒性效應.結果顯示,以生存、生長、繁殖為測試終點,青鳉魚的NOEC分別為76,60,5μg/L,基于大型溞蛻皮次數、生長和繁殖的NOEC分別為25,100,200μg/L.由此可見,青鳉魚比大型溞對三唑酮的毒性更敏感.比較不同測試終點,青鳉魚的繁殖類指標最敏感,其次是生長、生存;相比大型溞的繁殖以及幼溞的生長,其幼溞的蛻皮次數指標更為敏感.因此,低劑量長期暴露下三唑酮會對水生生物的繁殖能力造成一定的損傷,評價其水生態安全應全面考慮不同生物種群的不同測試終點,尤其是魚類繁殖毒性效應.

三唑酮；青鳉魚；大型溞；NOEC；慢性毒性；繁殖毒性

三唑酮()又名粉銹寧、百里通,屬于內吸性殺菌劑,是甾醇脫甲基抑制劑(DMI),對小麥、玉米、果蔬、花卉等作物的上銹病、白粉病均有較高的防治效果[1],是目前應用最廣泛的廣譜殺菌劑之一.三唑酮不僅水溶性大(20℃時在水中的溶解度為260mg/L)[2],穩定性強(22℃時在水中的半衰期大于1年),而且具有良好移動性和易吸附,可以通過地表徑流和地下水滲透進入水生環境中,在環境中持久累積[3].調查顯示,三唑酮在我國的使用量有逐年增長的趨勢,大量殘留藥物在土壤中吸附和解吸后,通過雨水的淋溶作用進入水體,造成水體污染.美國環保局(USEPA)利用暴露分析模型,估計在地表水中三唑酮的預期環境濃度為41μg/L[4].目前我國尚缺乏關于三唑酮地表水檢出濃度的報道,《雜環類農藥工業水污染物排放標準》(GB21523-2008)規定三唑酮原藥生產企業廢水處理設施總排放口的排放標準為5mg/L[5].盡管有研究顯示三唑酮對生物的急性毒性毒性相對較低,屬于低毒或中毒范圍[4],目前的暴露水平可能不會引起水生生物的快速死亡,但急性毒性效應不能反應環境中的真實染毒情況.2006年世界自然基金會(WWF)將三唑酮列入90種具有內分泌—生殖干擾效應的農藥及其代謝產物名單[6],生物在水中長期接觸有可能引起除致死效應外的其他毒性效應[7-8],如子代數量減少或畸形.研究表明,三唑酮能抑制異戊烯途徑衍生物—植物內源激素赤霉素(GA)的生物合成,改變植物激素的平衡,從而調節植物的生長和發育[9],表現出抑制浮萍的根系生長和個體繁殖[10].然而目前對三唑酮慢性毒性效應的研究較少,且主要集中在哺乳動物和陸生植物,對水生生物的研究相對匱乏.

由于有毒物質的生物毒性效應因試驗材料的不同而存在較大差異[11],大部分國家規定在進行水生態風險評價或水質基準推導時需要多種水生物種的慢性毒性值[12],例如,USEPA要求8種以上不同物種(三門八科)的最大可接受濃度值,OECD要求至少5種不同種類物種的慢性無觀察效應濃度(no observed effect concentration, NOEC).此外,在對三唑酮所產生的環境效應進行評估時,污染物效應評估是進行危害認定和風險水平判別的重要部分,而選擇合適的毒性評估終點是準確評估的關鍵[13].因此,進一步研究三唑酮對不同生物類群的影響,篩選出具有代表性的效應終點是十分必要的.浮游動物和魚類是水域生態系統的重要組成部分,研究浮游動物和魚類在三唑酮暴露水體中的生理生態變化,對科學評估水域生態系統健康具有重要的意義.青鳉魚()和大型溞()對水質、環境變化特別敏感,是國際上通用的標準模式生物,廣泛應用于生態毒理學研究的各個方面[14],在推導水生態基準時可以賦予和本土物種相同的權重.

本研究以三唑酮為測試物質,以國際通用模式生物青鳉魚和大型溞為代表性水生生物,主要進行了對青鳉魚的28d慢性毒性試驗和大型溞的21d慢性毒性試驗.研究三唑酮對不同生物類群及不同測試終點的慢性毒性效應,包括對青鳉魚幼魚的生存和生長、成魚的繁殖、大型溞F0代21d慢性毒性(體長、蛻皮次數、生小溞數)以及F1代生存的影響.旨在通過慢性NOEC值來評價三唑酮對青鳉魚和大型溞毒性效應的影響,并為后續將要進行的三唑酮對水生態系統的風險評價提供基礎數據.

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

三唑酮溶液標準樣品,CAS登記號:- 43-3,購于景宏化工有限公司,濃度為100mg/L.助溶劑丙酮(<0.1mL/L),購于天津津北精細化工有限公司.試驗過程所用稀釋水為去氯自來水(曝氣48h),各水質參數如下: pH=7.65,總有機碳(TOC)為0.017mg/L,硬度(以CaCO3計)約為140mg/L.試驗過程中溶解氧平均水平維持在80%飽和度以上.配制不同濃度水平(即名義濃度)的試驗液,并對三唑酮含量進行測定實測濃度為名義濃度的98.2%,空白對照中未檢出三唑酮.因此,在后續慢性毒性試驗中本試驗采用名義濃度來表示三唑酮的毒性結果[15].

1.2 試驗生物

青鳉魚()和大型溞()均來自中國科學院生態環境研究中心,已經在本試驗室實現小規模繁殖和養殖.青鳉魚采用流水試驗,每24h流量為試驗容器容積的6倍[16],試驗前在試驗條件下馴化至少兩周.試驗條件設定為:溫度(24±1)℃,溶解氧6mg/L以上,pH 7.24±0.16,光/暗周期為16h:8h(光照:黑暗),試驗期間每天早晚喂食新鮮豐年蝦一次.魚卵孵化試驗為半靜態試驗,每24h換水一次,孵化液配方為: 1mL NaCl (10%), 1mL KCl (0.30%), 1mL CaCl2· 2H2O (0.40%), 1mL MgSO4·7H2O (1.63%), 1mL亞甲基蘭(0.01%),95mL蒸餾水,使用前混合[17].

大型溞為實驗室培養3代以上的單克隆品系,個體間差異較小,使用Elendt M4培養基進行培養,用新鮮斜生柵藻()作為唯一的食物.斜生柵藻按照經濟合作與發展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD) 201[18]的要求配制培養基培養.按照OECD 211[19]的培養條件,大型溞和斜生柵藻都置于恒溫水浴培養箱中,溫度為(22±1)℃,每天光照16h,黑暗8h,光照強度不超過1110l~ 1480lx[15~20μE/(m2·s)].實驗前,挑選個體大、懷卵多和游泳能力強的母溞20~30只置于500mL的燒杯內,喂養3周,隨機選取小于24h的非頭胎幼溞用于慢性毒性實驗.幼溞置于盛有40mL M4培養基的50mL燒杯中,每天喂食斜生柵藻,投餌密度為2.0×105~3.0×105cells/mL.

1.3 青鳉魚試驗設計

1.3.1 96h急性致死試驗 96h急性毒性測試參照OECD制定的急性毒性標準試驗方法[20].試驗用魚為生命早期處于指數生長期的青鳉魚幼魚,每個容器中5L試驗用水,10條幼魚.參考文獻中三唑酮對魚類急性半致死濃度(LC50)的數值[21],試驗濃度設置為500,1000,2000,3000,4000, 8000μg/L,每24h 觀察一次,記錄死亡情況,及時清除死亡的幼魚和代謝物.

1.3.2 青鳉魚幼體生長抑制試驗 青鳉魚幼體生長抑制試驗采用生命早期處于指數生長階段的幼魚,根據30d預測生存毒性計算結果,設置試驗濃度為20,40,60,80,100μg/L,每天觀察并記錄幼魚生長死亡情況,及時清除死亡的幼魚和代謝物.暴露28d后統計存活數量,測量幼魚的體重,并計算幼魚的比生長率(SGR),計算公式[22]如下:

式中:1,2為試驗開始與結束的時間間隔;1,2分別表示某尾魚在1,2時的重量.

1.3.3 青鳉魚繁殖試驗 采用丙酮作為助溶劑,設置1個空白對照組和1個丙酮最大濃度(0.01%) 對照組,以及5個濃度水平,分別為:1,5,10,25, 50μg/L.采用4個月的成年青鳉,持續暴露28d,最后4d每天記錄每組魚的產卵量和受精率.收集受精卵,在胚胎開始分裂前(受精后30min內)放入孵化液,進行半靜態暴露孵化試驗,孵化液每24h更新一次[23].記錄每組魚全部孵出的時間,試驗結束時計算孵出率.受精卵死亡標志為卵凝結(coagulation)、(tail not detached)、無體節(no somites)、無心跳(no heart-beat)[24]. 最后以產卵量、受精率、孵化時間和孵化率為測試終點,評價三唑酮對青鳉魚的繁殖毒性效應.

1.4 大型溞試驗設計

大型溞21d慢性毒性試驗參考OECD 標準方法[19],試驗為半靜態試驗,每24h更換試驗液一次.試驗設置1個空白對照組和5個濃度梯度,每個試驗濃度10只親溞,單獨分開培養,每天喂食斜生柵藻濃縮液2次.通過查閱文獻[25]和一系列預實驗,實驗濃度設置為25,50,100,200, 400μg/L.取40mL用M4配制(pH 7.8±0.2)的試驗溶液放入50mL燒杯中,每個燒杯中放入1只小于24h的非頭胎幼溞.記錄每只大型溞的蛻皮次數、每胎產溞數量及幼溞存活個數(死亡鑒定:搖動玻璃管觀察底部幼溞15s未能游動即認定死亡),及時取出新生幼溞,暴露試驗結束時在顯微鏡下測量大型溞體長(不包括尾刺).

1.5 數據統計分析方法

根據96h急性致死試驗數據,利用US EPA 開發的軟件ACE 2.0[26]計算30d慢性致死濃度.用=0.05的單側假設檢驗[27],將試驗濃度組的有害效應與對照組相比,確定每個測試終點的NOEC. NOEC值為與對照組相比其生長速率無顯著性差異(>0.05)的最高濃度.

2 結果與討論

2.1 青鳉魚幼體生存/生長抑制試驗結果

繪制處理濃度對死亡率的曲線,用直線內插法計算出三唑酮對青鳉魚的半致死濃度(LC50),并用標準方差方法計算95%的置信限,最后用US EPA開發的軟件ACE 2.0[26]推算慢性生存毒性數據,得到死亡率分別為1.00%、0.10%和0.01%的時間—致死濃度曲線(圖1).

青鳉魚生命早期階段幼魚經過28d的三唑酮暴露以后,以生長抑制作為測試終點,結果如圖2所示.

經過統計分析,對照組中幼魚的比生長速率為9%,三唑酮的濃度為80,100μg/L時,幼魚的比生長速率分別為7.75%,7.32%,相對于對照組受到顯著抑制作用(<0.05).因此,青鳉魚生命早期階段的28d生長毒性NOEC值為60μg/L, LOEC值為80μg/L.

2.2 青鳉魚繁殖毒性試驗結果

青鳉魚成魚暴露26d后開始記錄每天的產卵量和受精率,連續記錄4d,計算每個試驗濃度組平均產卵量和平均受精率.將每組的受精卵在孵化液中進行暴露孵化,每24h換孵化液一次,及時清除死亡的受精卵,記錄每組全部孵出時間,并計算孵出率,結果如圖3所示.

經過統計分析,對照組中青鳉魚的產卵量為135.25±11.9,三唑酮的濃度為10,25μg/L時,產卵量分別為86.75±20.8、87±14.8,與對照組相比受到顯著抑制作用(<0.05);三唑酮濃度為50μg/L時,青鳉魚產卵量為61.5±9.8,抑制作用更加顯著(<0.01).與產卵量相似,孵化率在10μg/時表現出顯著差異(<0.05),50μg/L時差異性增大.相對于產卵量與孵化率,魚卵受精率敏感性較差,25μg/L時開始表現出顯著差異(<0.05).4個繁殖指標中,魚卵孵化時間最不敏感,在所有試驗濃度中,青鳉魚卵孵化時間與對照組相比無顯著差異(> 0.05).由此可見,產卵量和孵化率是評價三唑酮對青鳉魚繁殖毒性效應最敏感的生物標志物, NOEC均為5μg/L.為縮短實驗時間,降低試驗操作難度,建議產卵量作為青鳉魚繁殖毒性指標.

2.3 大型溞慢性毒性試驗結果

從圖4可以看出,三唑酮濃度￡100μg/L時,與對照組相比,大型溞體長沒有明顯差異;在三唑酮濃度為200,400μg/L的環境中,大型溞體長顯著短于對照組(<0.01).圖5表明,大型溞蛻皮次數隨著三唑酮濃度的升高逐漸減少,在50μg/L時與對照組相比顯著減少(<0.05),說明三唑酮能有效地與大型溞體內的蛻皮激素受體結合,從而干擾其正常的生理過程.

大型溞21d染毒過程中每只親溞產胎6次,表1中列出了每胎產溞數和幼溞死亡情況.

表1表明,21d暴露過程中,第1次產溞數較多,第2次略有降低,對照組和低濃度暴露(25~ 100μg/L)情況下,單次產溞量降低后又逐漸增加.在較高濃度(200~400μg/L)下,大型溞的生殖量隨著暴露時間逐漸降低.觀察21d產溞總數,三唑酮濃度為25,50μg/L時與對照組差別不大,濃度為100~200μg/L時累積產溞數少于對照組,但無顯著差別(P>0.05),400μg/L時累積產溞數顯著降低(P<0.05). Hassold等[25]在相似條件下進行大型溞繁殖毒性試驗,結果表明以大型溞繁殖量為測試終點的EC10為611μg/L,與本試驗結果相差不大.因此,三唑酮對大型溞的繁殖毒性NOEC可以確定為200μg/L.三唑酮濃度為0~100μg/L時,幼溞無死亡現象,當濃度提高到200、400μg/L時,死亡率為12.5%,可見,三唑酮濃度大于200μg/L時能夠明顯降低大型溞的子代存活率,由此推斷以F1代幼溞死亡為測試終點的NOEC為100μg/L.

注:“*”表示顯著性差異為<0.05.

2.4 三唑酮水生態毒性

如表2所示,以生存、生長、繁殖毒性為測試終點,青鳉魚的NOEC分別為76,60,5μg/L;以大型溞F0代蛻皮次數,生長和繁殖為測試終點的NOEC分別為25,100,200μg/L.

比較不同測試終點,針對大型溞其幼溞的生長以及蛻皮次數相比繁殖指標更為敏感,而青鳉魚的繁殖類指標最敏感,其次是生長,生存.這是因為,青鳉魚與大型溞具有不同的內分泌調節系統,三唑酮在其體內發生的作用模式不同,進而表現出不同的毒性效應.作為脊椎動物,青鳉魚的繁殖系統受下丘腦-垂體-甲狀腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸控制[30],劉少穎[31]研究表明三唑酮低濃度長期暴露能夠產生甲狀腺激素干擾效應和芳香酶抑制效應,影響青鳉魚繁殖和胚胎發育.此外,由于產卵量與魚類的卵子發育,雌雄交配行為,性激素刺激等多個繁殖環節相關,是所有相關生理生化行為的綜合體現,因此對外源化合物的影響最敏感.

表2 三唑酮對青鳉魚和大型溞不同測試終點的NOEC值 Table 2 The NOEC values with different endpoints for Oryzias latipes and Daphnia magna

分析不同生物類群對三唑酮的毒性效應,表2表明青鳉魚比大型溞更敏感.據報道,三唑酮對斑馬魚和稀有鮈鯽的96h LC50分別為13100μg/L 和6890μg/L[22],對非洲爪蟾48h 急性致死NOEC為g/L[32],而三唑酮對浮萍的96h半抑制濃度(IC50)為5370μg/L[10],對柵藻的96h 半效應濃度(EC50)為2770μg/L[33],說明不同生物類群對三唑酮的敏感性有明顯差異,魚類比兩棲類敏感,而浮萍和藻類的急性毒性比魚類更敏感.因此,作為除草劑類農藥,在制定三唑酮水質基準時,只有動物慢性毒性數據不足以保護整個水生態系統,有必要進一步研究三唑酮對水生植物,藻類以及其它生物類群的慢性毒性效應.

3 結論

3.1 根據慢性毒性試驗結果,青鳉魚的NOEC為5~76μg/L,大型溞的NOEC為25~200μg/L,青鳉魚比大型溞對三唑酮更敏感.

3.2 分析不同測試終點的敏感性,青鳉魚的繁殖毒性最敏感,其次是生長、生存;大型溞的蛻皮次數最敏感,其次是生長和F1代生存,三唑酮對F0代大型溞的繁殖力影響相對較小.

3.3 三唑酮對不同生物類群和不同測試指標的敏感性存在較大差異,在預測低濃度水體的生態風險時,應全面考慮不同生物類群的不同測試終點,尤其要考慮魚類繁殖毒性效應.

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* 責任作者, 高級工程師, jxw85@126.com

Toxicity effect of Triadimefon based on Oryzias latipes and Daphnia magna with different test endpoints

LIU Na1, JIN Xiao-wei2*, WANG Ye-yao1,2, ZHANG Ling-song3, LV Yi-bing2, YANG Qi1

(1.School of Water Resources and Environment, China University of Geosciences (Beijing), Beijing 100083；2.China National Environmental Monitoring Center, Beijing 100012；3.State Key Laboratory for Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China).Science, 2016,36(7)：2205~2211

Triadimefon is one of the most widely used broad spectrum bactericides at the present. Although the acute toxicity of triadimefon is lower, it would accumulate persistently in the water environment and cause adverse effect to aquatic organisms due to its consistency and adsorption. Sub-chronic toxicity of different endpoints for Oryzias latipes and Daphnia magna were conducted to evaluate aquatic ecological effect of triadimefon. The result showed that the NOECs of triadimefon based on the survival, growth and reproductive of Oryzias latipes were 76, 60, 10μg/L respectively. While the NOECs based on the molt, growth and reproductive of Daphnia magna were 25, 100, 200μg/L, respectively. Oryzias latipes was more sensitive than Daphnia magna to triadimefon. For the view of different endpoints, reproduction was the most sensitive endpoint of Oryzias latipes to triadimefon, followed as growth and survival. For Daphnia magna, the growth and molt were more sensitive than reproduction. Therefore, it would cause reproductive fitness to aquatic organisms under low dose long-term exposure of triadimefon. Different endpoints for kinds of species, especially for reproductive toxicity of fish should be considered in the ecological risk assessment of triadimefon.

triadimefon；Oryzias latipes；Daphnia magna；NOEC；chronic toxicity；reproductive toxicity

X171.5

A

1000-6923(2016)07-2205-07

劉 娜(1985-),女,河北衡水人,中國地質大學(北京)博士研究生,主要研究方向為生態毒理以及區域生態風險評價.

2015-12-24

國家自然科學青年基金(21307165);國家水體污染控制與治理科技重大專項(2013ZX07502001);環境模擬與污染控制國家重點聯合實驗室(中國科學院生態環境研究中心)開放基金(14K02ESPCR)