發酵法生產檸檬酸的研究進展

王寶石，陳堅,2，孫福新，龐海強，李由然，張梁，丁重陽，顧正華，石貴陽*

1(江南大學，糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫， 214122)2(江南大學，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫， 214122)3(江蘇國信協聯能源有限公司，江蘇 宜興，214200) 4(山東省費縣檢驗檢測中心，山東 費縣，273400)

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發酵法生產檸檬酸的研究進展

王寶石1，陳堅1,2，孫福新3，龐海強4，李由然1，張梁1，丁重陽1，顧正華1，石貴陽1*

1(江南大學，糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫， 214122)2(江南大學，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫， 214122)3(江蘇國信協聯能源有限公司，江蘇 宜興，214200) 4(山東省費縣檢驗檢測中心，山東 費縣，273400)

檸檬酸是一種具有多功能的重要有機酸，是當前世界上產量和消費量最大的食用有機酸，伴隨著在新興產業領域的廣泛應用，其需求量以每年5%的速度增長。發酵法生產檸檬酸起步較早，但工藝鮮有創新；文中首先介紹了檸檬酸生產工藝國內外研究現狀，并以產業化的視角，縱觀檸檬酸生產全過程分析限制檸檬酸快速增長的瓶頸，著重提出了實現檸檬酸高效生產與清潔生產相統一的主要策略，為實現檸檬酸高效綠色制造奠定基礎。

檸檬酸；同步糖化發酵；多糖分子量分布；連續發酵；廢水資源化利用

檸檬酸(citric acid)又名枸櫞酸，是一種三羧酸類化合物，易溶于水，無毒，無臭，具有很強的酸味，是一種重要的、多功能的有機酸[1-3]，廣泛應用于食品、醫藥，化工等領域。檸檬酸全球產量超過170萬t，隨著生物聚合、藥物運輸、細胞培養等新興產業領域的廣泛應用，每年以5%的速度增長，是世界第二大發酵產品，產量僅次于酒精產量[4]，檸檬酸發酵生產一直是學者關注的熱點。隨著需求量的逐年增加，提高檸檬酸發酵效率成為新的研究課題。本篇以工業化生產的視角，從發酵菌株，原料處理，發酵方式及廢水處理等方面分析限制檸檬酸增長的因素，并重點闡述實現檸檬酸高效生產的主要策略。

1　生產菌種

多種類型的微生物可以用于生產檸檬酸，如曲霉類——Aspergillusniger,A.awamori,Penicilliumjanthinelum; 酵母類-Yarrowialipolytica,Candidatropicalis,Candidaoleophila;及細菌類——Bacilluslicheniformis,Arthrobacterparaffinens,Corynebacteriumsp.[5-6]。CARLOS[7]報道細菌類如Arthro-bacterparaffinens，Bacilluslicheniformis和Corynebac-teriumssp.能夠生產檸檬酸。酵母類可以利用不同類型碳源生產檸檬酸，其中解脂亞羅酵母已經被廣泛用于生產檸檬酸，RYMOWICZ利用解脂假絲酵母發酵烷烴類底物，獲得大量檸檬酸[8]。然而，檸檬酸是能量代謝產物，僅在代謝不平衡條件下才能大量積累，雖然文獻報道多種類型微生物可以生產檸檬酸，可用于工業化生產僅曲霉類與酵母類。酵母類發酵會產生大量的副產物異檸檬酸，降低檸檬酸產量。因此，篩選低順烏頭酸酶活性的突變株或許有助于提高檸檬酸產量。

黑曲霉易操作，底物廣泛，產量高，副產物少，是檸檬酸工業化生產的最佳選擇[9]。CURRIE[10]最初研究發現黑曲霉在初始pH為2.5～3.5，含有高濃度糖與礦物鹽的培養基上能夠大量繁殖并積累檸檬酸，此發現為黑曲霉工業化生產檸檬酸奠定了基礎。研究專家對黑曲霉發酵底物優化拓展以及傳統誘變技術應用于菌株篩選，進一步提升了檸檬酸產量。KUTYA-OLESIUK[11]采用黑曲霉發酵蔗糖生產檸檬酸；孟佼[12]采用黑曲霉以玉米秸稈為原料發酵生產檸檬酸，發酵216 h，檸檬酸產量為98.27 g/L；ADEOYE[13]采用黑曲霉發酵木薯皮生產檸檬酸。WEI HU[14]組合碳離子束(12C6+)與X射線對黑曲霉誘變處理，顯著提高了檸檬酸產量，產量達到187.5 g/L，產率為3.13 g/(L·h)；王德培[15]采用氮離子注射與微波輻射復合誘變，檸檬酸產量提高60%；IKRAM -UL-HAQ[16]通過UV與NTG誘變處理，發酵赤糖糊168 h，檸檬酸產量達到86.1 g/L。現代誘變技術的應用，也取得了良好的效果。JONGH[17]將來源于根霉的延胡索酸酶基因(FumRs)與酵母菌的富馬酸還原酶(Frds1)在黑曲霉中過量表達，可以有效改善黑曲霉在錳離子培養基中耐受力，提高檸檬酸產量，產率為0.025 g/g菌體；HJORT[18]構建了不產草酸的黑曲霉菌株，減少發酵過程中副產物產生，提高檸檬酸產量。傳統誘變與現代誘變技術的應用一定程度上提高了檸檬酸產量，降低了副產物形成；未來黑曲霉高產菌種的篩選可以組合傳統誘變技術與代謝工程技術進一步提高檸檬酸生產效率。

與單細胞發酵(細菌類與酵母類)相比，黑曲霉因其獨特的形態學特征，在攪拌條件下更易受到復雜環境影響產生非均相體系，影響發酵過程傳質、溶氧。其中最有趣的是其復雜的菌絲體形態，從致密的菌絲球到各種形態的菌絲，黑曲霉菌絲體形態會直接影響其發酵產酸[19]。PAPAGIANNI[20-21]采用數字圖像技術分析黑曲霉菌絲體形態學特征，通過人工神經網絡模型將菌絲體形態分為球形、橢圓形、團塊狀和游離菌絲；研究發現改變孢子接種量可以有效調節菌絲聚集形態。隨后，PAPAGIANNI[19,22]在發酵初期劇烈攪拌會導致菌絲高度分支化，產生大量菌絲碎片，菌絲平均長度降低，菌絲球直徑減小；而發酵后期菌絲逐漸衰老，菌絲高度空泡化，菌絲增生較少。究竟菌絲球還是游離菌絲更適宜生產檸檬酸，PAUL等[23]研究發現分散菌絲比生長速率、比產酸速率與比耗糖速率等指標明顯高于大菌絲球，同時UJCOVA[24], SEICHERT[25]研究表明菌絲體形態為游離絲狀產酸更高；而GOMEZ與KISSER等[26-27]研究表明，菌絲體形態為菌絲球的產酸更高。雖然何種菌絲體形態更適合檸檬酸發酵一直存在爭議，但存在一定共識—產酸較高的黑曲霉菌絲一般具有短、膨大，分支菌絲尖端多的特征。因此，控制發酵過程菌絲體特定形態有助于提高檸檬酸產量。

現代工業化生產的黑曲霉種子仍然沿用傳統二級培養方式，即首先一級培養得到黑曲霉孢子，經二級培養獲得成熟的菌絲球，然后用于接種發酵。工業化生產中，一批成熟的孢子需要經過平板篩選，斜面培養，茄子瓶培養，最后麩曲桶培養等逐級擴大培養，流程長，制備繁瑣，制備周期需要30 d以上，如圖1所示；二級種子培養周期較長，僅孢子萌發需要12 h以上。因此，菌絲替代孢子接種方式，縮短孢子萌發時間，是改善傳統種子培養方式的重要方向。

圖1　傳統培養模式規模孢子制備工藝Fig.1　Large-scale spores preparation in conventional process

高質量的生物產品及發酵穩定性與其細胞活力密切相關，目前黑曲霉細胞缺乏有效的活力評價方法。SIGLER[28]，GABRIEL[29]建立了基于酸化力法快速評價酵母活力，PRASHANT[30]基于亞甲基藍褪色速度反應酵母細胞活力，對于評價黑曲霉細胞活力具有良好的借鑒意義。種子培養過程中種子活力波動會造成發酵過程不穩定，因而建立一種快速有效的黑曲霉細胞活力評價方法對于指導種子培養與移種均具有重要意義。

2　原料處理

黑曲霉是發酵生產檸檬酸的主要菌種，是因為它能夠利用廉價原料，產量仍能達到理論值70%以上[31]。產檸檬酸培養基主要成分為淀粉質或含葡萄糖、蔗糖的原料，隨著全球檸檬酸需求量增加，低成本原料逐漸成為檸檬酸生產競逐的對象，一些工農業加工廢料及副產物應用于檸檬酸生產，同時緩解了環境壓力。YASSER[32]利用過期的糖漿生產檸檬酸，經1.5%磷酸鈣除去金屬離子，產量比未處理對照組提高38.87%。 DHILLON[33]以蘋果渣超濾后的污泥為底物發酵144 h，檸檬酸產量達到44.9 g/L。BARRINGTON[34]發酵泥煤苔生產檸檬酸，發酵120 h，產量為354.8 g/( kg底物)。KHOSRAVI-DARANI[35]采用尿素處理甘蔗渣生產檸檬酸，檸檬酸產量、產率分別為82.38 g/kg(干基)，26.45 g/(kg·d)。各種低廉、廢棄原料的應用拓寬了檸檬酸原料范圍，同時對緩解環境壓力，降低原料成本等方面做出了巨大貢獻。但由于各種廢棄原料的成分復雜，增加了生產后期檸檬酸提取難度，縱觀檸檬酸整個生產過程，生產成本不減反增，生產效率降低。因此，淀粉質原料仍然是檸檬酸工業化生產的主要原料。

黑曲霉對碳源的代謝是影響檸檬酸發酵水平最重要的因素，MADDOX, VANDENBERGHE, HOSSAIN[36]研究表明，淀粉質原料需首先被水解為單糖才能用于檸檬酸的高效合成。檸檬酸工業化生產中采用淀粉質粗原料，經液化后利用黑曲霉自身的糖化能力進行同步糖化發酵。基于同步發酵的工藝特點，在發酵過程中任何時間葡萄糖生成速度與消耗速度的不匹配均會降低發酵效率。葡萄糖的消耗速度可通過控制溶氧和發酵溫度等參數精確調控；而葡萄糖的生成速度則以液化效果為主因，常常成為發酵產酸的瓶頸所在。以上都體現出液化糖化階段對整個檸檬酸發酵過程的重要性。黑曲霉自身液化型淀粉酶系作用效率有限，降解淀粉的速率無法滿足檸檬酸合成過程中的代謝需求。因此，淀粉質原料在發酵前需經α-淀粉酶水解液化，將大分子切割成短鏈，形成糊精和少量寡糖，降低淀粉黏度，為糖化酶的作用創造條件。同時黑曲霉自身分泌的糖化酶是一種外切型淀粉酶，它針對不同結構的底物作用效率不同，黑曲霉糖化酶作用于長鏈的活性更大；HIROMI[37]研究發現黑曲霉糖化酶對低聚糖的Km值(米氏常數)隨著聚合度( degree of polymerization，DP≤7)的增加而降低，對麥芽糖Km值為0.18～1.4 mmol/L，而對麥芽低聚糖的Km值為 0.02～0.14 mmol/L；DOUGLAS[38]研究發現，不同聚合度的底物與黑曲霉糖化酶活性中心競爭性結合能力不同； MEAGHER[39]也發現黑曲霉糖化酶的水解速率k2以及與底物的親和力不同。傳統淀粉質粗料發酵模式的液化工藝缺乏精細化調控，液化組分中多糖分子量分布不均，導致后期發酵過程不穩定，是長期制約檸檬酸發酵行業提升的關鍵技術難題。因此，精細化調控淀粉液化過程，改善液化組分中多糖分子量分布規律，有利于提高黑曲霉糖化速率，進而改善發酵效率。

3　發酵方式

檸檬酸發酵方式包括淺盤發酵法(surface fermentation)、固態發酵法(solid fermentation)、液態深層發酵法(submerged fermentation)3種形式。淺盤發酵又稱表面發酵，是檸檬酸發酵最初的發酵形式；固態發酵方式能夠利用工農業加工廢料，降低生產成本，同時減少環境污染[2, 35, 40-41]，是一種非常具有潛力的發酵模式，但因廢料成分復雜，對發酵后期產物提取影響較大，有待于進一步研究；液態深層發酵方式具有產率高，自動化程度高，不易污染，發酵周期短等優勢，是檸檬酸工業化生產的主要方式，約有80%的檸檬酸產量是通過液態深層分批發酵方式得到的[7, 42]。

傳統分批發酵模式嚴重制約了檸檬酸的快速增長，對于工業化生產，連續發酵方式更具有優勢，消耗少的勞動力獲得較高的發酵效率，學者始終未停止對檸檬酸連續發酵工藝的探索。然而檸檬酸合成是部分生長偶聯型[43]，且黑曲霉菌絲體結構復雜，實現黑曲霉連續發酵生產檸檬酸比較困難[44]。

酵母菌作為單細胞生物，操作簡便，易于實現連續發酵，解脂假絲酵母連續發酵生產檸檬酸取得了一定進展。MOELLER等人[45]使用解脂假絲酵母反復分批發酵，連續發酵3 d，檸檬酸產量為100 g/L，檸檬酸產量提高了32%；隨后MOELLER等人[46]采用解脂假絲酵母H222重復補料發酵10批次，發酵時間553h，產率由1.4 g/(L·h)降至1.1g/(L·h)。RYWISKA等人[8]采用解脂假絲酵母反復分批發酵甘油16批次，仍保持較高活性，檸檬酸產量為0.78 g/g，產率1.05 g/(L·h)。ARZUMANOV等人[44]采用解脂假絲酵母反復分批發酵乙醇生產檸檬酸，發酵700 h，檸檬酸產量為105 g/L。解脂假絲酵母雖然在連續生產檸檬酸取得一定進展，但酵母類發酵方式存在缺陷，使其工業化生產受阻。其最大的缺點是副產物異檸檬酸產量較高(5%～10%)，提取過程困難；酶系單一，原料轉化率低；同時解脂假絲酵母作為產油脂酵母菌的菌種來源，細胞中還易累積較多油脂，這些副產物的產生降低了檸檬酸產量[47]。

黑曲霉由于酶系豐富，發酵效率高、副產物少等優勢，仍然是實現檸檬酸連續發酵的主要選擇。通過引入菌絲球分割技術，組合發酵過程控制策略改善黑曲霉菌絲體形態，實現黑曲霉連續培養，提高檸檬酸生產效率。

4　檸檬酸廢水處理

檸檬酸生產主要采用液體深層發酵，發酵液經固液分離鈣鹽法或色譜提取、蒸發、結晶等工藝獲得檸檬酸成品。提取過程中會產生大量廢水，其中含有一些有機酸、糖、蛋白質膠體、礦物質等物質[48]，COD高達350 kg/t檸檬酸，濃度高達10 00015 000 mg/L。檸檬酸廢水處理主要采用生物處理法、Fenton試劑法、光合細菌法、乳化液膜法等[49]，其中生物處理法的應用最為廣泛，單獨采用厭氧生物法或者好氧生物法處理高濃度檸檬酸廢水，往往不能達到國家排放標準，需結合其他處理技術進行深度處理。

方亞葉[50]將酒精發酵過程中廢水經陶瓷膜過濾回流至生產系統中，發酵13次未產生明顯抑制作用, 對檸檬酸廢水回流具有良好的借鑒意義。國內外學者對檸檬酸廢水進行深度處理進而資源化利用，取得了較好的效果。WIECZOREK等[51]將發酵液經過液液萃取系統，連續運行55 d，發酵結果正常，但部分萃取劑會溶解到水相中，需要活性炭進一步吸附處理。HUSEYIN[52]利用 Fenton 氧化法處理廢水，作為 SBR 生物處理的預處理，組合工藝的COD去除率達98%。此處理方法過程比較復雜，成本高，單一處理方法不能達到污水排放標準，不符合資源化利用技術的要求。XU[53-55]構建了檸檬酸-沼氣雙發酵藕聯生態體系，產生的檸檬酸廢水經厭氧發酵產生沼氣，厭氧出水經過進一步預處理用于檸檬酸發酵體系，檸檬酸廢水循環利用10批次，檸檬酸發酵過程比較穩定。

現有的檸檬酸廢水回用方法一般需要前期預處理，流程較長，可操作性與穩定性較差，有些可能造成二次污染。基于菌種適應性進化技術，提高菌種廢水耐受性，減少廢水復雜前處理過程，降低生產成本，是實現檸檬酸廢水資源化利用的重要手段。

5　展望

高產量、高產率、高生產強度統一為目標的發酵過程技術，一直是發酵工程領域關注的焦點問題。針對檸檬酸傳統生產工藝存在問題，建立上游發酵技術、下游提取技術和后期污水處理各環節有效的溝通機制，提高生產效率，實現清潔生產，可從以下幾個方面開展。集成傳統誘變技術與現代代謝工程技術篩選黑曲霉高產菌株，基于細胞活力快速評價方法，指導建立黑曲霉種子連續培養方式；精細化調控淀粉質原料液化過程，改善液化組分多糖分子量分布，同步糖化發酵，提高發酵效率；通過引入菌絲球分割技術，組合發酵過程控制策略改善黑曲霉連續發酵過程中的菌絲體形態，實現黑曲霉連續發酵；基于菌種適應性進化技術，提高菌種廢水耐受性，實現檸檬酸廢水資源化利用。

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Advances in production of citric acid through microbial fermentation

WANG Bao-shi1, CHEN Jian1,2, SUN Fu-xin3, PANG Hai-qiang4, LI You-ran1,ZHANG Liang1, DING Zhong-yang1, GU Zheng-hua1, SHI Gui-yang1*

1(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)3(Jiangsu Guoxin Union Energy Co., Ltd., Yixing 214203, China)4(Shandong Feixian Inspection and Detection Center, Feixian 273400, China)

Citric acid is one of the most important multifunctional organic acids produced by fermentation. At present, it is the world’s second largest fermentation products ranking behind ethanol. The volume of citric acid production is increasing at a high annual rate of 5% with numerous new applications coming to light. Though production of citric acid through microbial fermentation has a long history, there is little innovation in the production process. We firstly reviewed the advances in citric acid production and then analyzed the factors limiting the fast increase of citric acid in perspective of the entire production-process. Main strategies for efficient production of citric acid coupled with cleaner production were elaborated, which laid foundation for the realization of efficient green manufacturing of citric acid.

citric acid; simultaneous scarification and fermentation; polysaccharide molecular weight distribution; continuous fermentation; utilization of wastewater resource

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609042

博士研究生(石貴陽教授為通訊作者，E-mail:gyshi@jiangnan.edu.cn)。

國家高技術研究發展計劃(863計劃，No: 2015AA020302)；江蘇省產學研前瞻性聯合研究項目 (No. BY2015019-13)

2016-02-28,改回日期：2016-04-11