上調基因-11（URG11）生物信息學與功能分析

姚楊 蘇杰 劉凱歌 徐銳

（西安醫學院第一附屬醫院，西安 710077）

上調基因-11（URG11）生物信息學與功能分析

姚楊 蘇杰 劉凱歌 徐銳

（西安醫學院第一附屬醫院，西安 710077）

應用基因芯片技術獲取以穩定轉染HBx基因的肝癌細胞HepG2（HepG2-X）Y，以及非轉染的肝癌細胞HepG2的差異表達基因，利用生物信息學方法對其進行初步分析表明，該蛋白基因編碼673個氨基酸，預測分子量為17.06 kD，理論等電點為4.83，定位于細胞核，具有轉錄調控、生長因子、信號傳導的功能，同源性分析結果表明，其堿基序列與已經報道的其他12個物種的相似率為76%-97%，且符合種屬之間的進化關系。

乙肝相關性肝癌；生物信息學分析；URG11；HBx

目前，我國每年約有11-13萬人死于原發性肝癌，占全球肝癌死亡數的半數之多。在誘發肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的眾多因素中，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染占到50%以上［1-3］。流行病學和分子生物學研究認為HBV是HBV相關性HCC發生的高危因素。HBx（Hepatitis B virus X protein）是HBV四個開放讀碼框架中X編碼的一種病毒多功能蛋白，研究發現X基因表達產物（HBx）在肝癌形成過程中參與肝癌血管生成，但作用機理并不明確［4，5］。URG11（upregulated gene11）是一個可被HBx蛋白上調的基因，能促進肝癌細胞G1期向S期進展，與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關的基因［6，7］。

URG11與腫瘤關系的相關的報道已經很多，但并未對其進行詳細的生物信息學分析。本實驗通過HBx基因穩定轉染的HepG2細胞為實驗組，非轉染的肝癌細胞HepG2為對照組，通過Agilent人全基因芯片篩選差異表達基因，通過生物信息學方法對其進行分析，旨在為HBV相關肝癌的發生、轉移的診斷、靶基因治療和預后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞系HepG2及HepG2-X均為本實驗室保存。10%小牛血清（四季青生物工程工司），RPMI-1640培養基（Gibco公司）；消化液（0.02%EDTA 0.25%胰蛋白酶）；DEPC水；Agilent人類全基因4×44K芯片；Agilent Microarray Scanner和Agilent feature extraction數據分析軟件。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片 用Trizol［8］法分別抽取實驗組及對照組細胞總RNA，紫外分析及電泳檢測，合成有熒光標記的cDNA探針并純化，將基因芯片和雜交探針分別在95℃水溶液中變性5 min，將探針加在芯片上，蓋玻片封片，65℃，10 r/min，滾動雜交17 h，實驗組和對照組分別雜交上樣量825 ng，60℃下用SCC和0.2%SDS分別洗2 min，室溫晾干。片結果采用Agilent Microarray Scanner進行掃描，用Feature Extraction software 10.7讀取數據，最后采用Gene Spring Software 11.0進行歸一化處理，所用的算法為Lowess。

1.2.2 序列的生物信息學分析 利用BLAST在線分析工具分別對GenBank 的非冗余核算數據庫和非冗余蛋白質數據庫序列進行比對分析；采用NCBI的ORF finder［9］對URG11開放閱讀框進行預測；利用ExPASy 的ProtParam［10］程序統計基因中各種氨基酸含量，并預測理論分子量和等電點；應用ProtScale［11］程序進行蛋白質的疏水性分析；跨膜結構域分析采用TMHMM軟件預測［12］。信號肽采用SignalP3.0server工具分析［13］。磷酸化位點分析采用蛋白質亞細胞定位NetPhos2.0 Server在線分析工具［11］。采用在線工具（http：//psort nibb.ac.jp/form. html）預測，通過NCBI數據庫GenBank 分析蛋白質保守結構域；采用Protfun在線工具預測URG11的功能分類［14］；采用同源模型服務軟件SWISSMDEL［15，16］預測URG11的三維結構；采用MEGA5.0軟件進行系統進化樹的構建。

2 結果

2.1 開放閱讀框分析

本研究利用NCBI ORF Finder對URG11在線分析表明其在+1閱讀框有最長的開放性讀碼框，長度為2 020 bp編碼673個氨基酸殘基（圖1）。

圖1 人URG11基因序列的ORF分析

2.2 保守結構域預測

利用NCBIBLAST 工具進行保守區分析，發現URG11氨基酸序列中含有4個保守的作用位點，如圖2所示。

2.3 理化性質分析

利用ExPASy 在線工具ProtParam對URG11基因編碼產物的理化性質預測結果表明，其中含量最多的兩種氨基酸是Cys（C）和Gly（G），所占比例分別為34.4%和27.8%理論分子量為17.06 kD，理論等電點為4.83。

根據蛋白質親水性/疏水性分析原理，利用ExPASy ProtScal程序，對人URG11基因編碼產物的疏水性進行分析，結果（圖3）顯示，整條多肽鏈表現為親水性，由此可知人URG11是一種可溶性蛋白。

2.4 跨膜結構域分析

TMHMM綜合了跨膜區疏水性、螺旋長度和膜蛋白拓撲學限制等性質，用馬氏模型對跨膜區及膜內外區進行整體預測。本實驗利用TMHMM對URG11進行跨膜結構的分析，結果表明此蛋白不含跨膜位點。

圖2 保守域預測結果

圖3 ProtScal程序分析URG11編碼產物的疏水性結果

圖4 URG11跨膜結構預測產物信號肽預測

信號肽（signal peptide）是一段由3-60個氨基酸組成的短肽序列，它是引導新合成蛋白質被輸送至目的地點的識別信號，也被稱為靶標信號。利用SignalP 3.0 Server工具對人URG11信號肽進行預測，結果（圖5）表明，該蛋白不含信號肽。

圖5 URG11編碼產物氨基酸序列信號肽預測

2.5 磷酸化位點分析

磷酸化和去磷酸化在多種真核細胞中具有重要的作用，如新陳代謝、細胞分裂及信號轉導等，利用NetPhos2.0 Server在線分析工具對URG11磷酸化位點分析，結果（圖6）發現有29個絲氨酸和12個蘇氨酸可能被磷酸化。

2.6 編碼產物功能預測及分析

通過Protfun預測URG11編碼產物的功能，從分析結果（表1）可知，URG11具有轉錄調控、生長因子、信號傳導的功能，可能性分別為0.854、0.476、0.365。

2.7 URG11保守域預測與高級結構分析

通過Swiss-Modeling軟件對URG11的氨基酸序列進行蛋白質三維結構的同源建模，獲得其氨基酸序列的預測三級結構（圖7）。

2.8 同源比對和系統進化樹分析

將URG11氨基酸序列與NCBI數據庫在核苷酸和蛋白質一級結構水平上進行同源性比較，結果（表2）表明其在進化中十分保守，與其他12種物種URG11氨基酸水平的相似性為76%-97%。同時也反映了URG11編碼產物在不同物種結構上的穩定性對生物體功能的重要性。根據URG11基因特征序列和保守序列在GenBank數據庫進行檢索，物種間系統進化樹（圖8）分析表明，白頰長臂猿、蘇門答臘猩猩、獼猴的親緣關系較近。

圖6 NetPhos2.0 Server預測磷酸化位點

表1 URG11編碼產物功能分析結果

圖7 URG11氨基酸序列高級結構分析結果

表2 URG11與其他近緣物種該蛋白基因氨基酸序列同源性

圖8 不同物種URG11編碼產物系統發育樹

3 討論

URG11最早是利用抑制消減雜交及全長PCR擴增技術克隆的一個基因，該基因定位于人11號染色體長臂，能促進肝癌細胞系的增殖、分化并促進肝癌細胞裸鼠體內的成瘤能力，更重要的是將此基因轉染入腫瘤細胞，可促進B-連接蛋白（B-catenin）的表達。B-catenin不僅在維持細胞正常形態及介導細胞運動中發揮重要作用，還是與腫瘤發生及發展密切相關的Wnt信號轉導通路中的關鍵分子［17，18］。Peng 等［19］發現URG11通過上皮間質轉化促進胰腺癌的侵襲，從而導致預后效果不佳。Fan等［20］發現抑制URG11，HCC細胞可通過下調G1-S期相關蛋白抑制細胞增殖，通過下調BCL-2誘導細胞凋亡。

雖然關于URG11基因的報道已經很多，但并未對其進行詳細的生物信息學分析。本研究通過基因芯片技術篩選出HBx參與的乙肝相關性肝細胞性癌差異表達基因URG11，對其同源性比較結果表明，其堿基序列與已經報道的其他12個物種的相似率為76%-97%，與其他物種比較，URG11基因氨基酸序列表現出高度保守性，以保證其執行重要的生物學功能。利用MeGa5.0軟件基因NJ法構建系統進化樹，人URG11與大猩猩、黑猩猩、普通狨該基因的分子進化距離最近，親緣關系最密切，這與動物學分類結果一致，這種同源性在一定程度上代表著物種親緣關系的遠近，同時也反映了URG11編碼產物在不同物種結構上的穩定性對生物體功能的重要性。隨著對URG11結構和功能的深入研究，針對URG11的干擾和抑制可能成為一種新型的臨床分子靶點抗癌藥物。

4 結論

本研究結合分子生物學技術和生物信息學分析，通過基因芯片技術篩選出HBx參與的乙肝相關性肝細胞性癌差異表達基因URG11，該基因編碼673個氨基酸，預測分子量為17.06 kD，理論等電點為4.83，同源性分析結果表明，其堿基序列與已經報道的其他12個物種的相似率為76%-97%，且符合種屬之間的進化關系。亞細胞定位于細胞核的可能性大，具有轉錄調控、生長因子、信號傳導的功能。

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（責任編輯 李楠）

Function Analysis of Up-regulated Gene（URG11）Based on Its Bioinformatics

YAO Yang SU Jie LIU Kai-ge Xu Rui
（The First Affiliated Hospital of Xi'an Medical University，Xi'an 710077）

This work was to obtain differentially-expressed genes with hepatoma cell HepG（HepG2-X）Y of stable transfected HBx and non-transfected hepatoma cell HepG2using gene chip technology. The preliminary bioinformatic analysis demonstrated that the gene of the protein encoded 673 amino acids with a predicted molecular weight of 17.06 kD and pI 4.83. URG11 were mainly localized in the nuclear and played the role in transcription regulation，growth factor and signal transducer，and it showed 76%-97% identity with the others reported 12 species，as well as was consistent with the evolutionary relationship between species.

HBV-related hepatocellular carcinoma；bioinformatics；URG11；HBx

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.032

2015-06-04

西安市科技計劃項目（SF1418（6）），西安醫學院科研項目（12FZ15），西安醫學院附屬醫院科研項目（XYFY11-14）

姚楊，碩士研究生，研究方向：生化與分子；E-mail：yaoyang1220@sina.com