Us11的表達及其多克隆抗體的制備

童海燕李國毅，2湯穎

（1.哈爾濱醫科大學第一附屬醫院，哈爾濱 150001；2.同濟大學附屬東方醫院，上海 200085）

Us11的表達及其多克隆抗體的制備

童海燕1李國毅1，2湯穎1

（1.哈爾濱醫科大學第一附屬醫院，哈爾濱 150001；2.同濟大學附屬東方醫院，上海 200085）

已有研究發現單純皰疹病毒1（HSV-1）感染后，病毒的Us11 蛋白在拮抗宿主先天性免疫反應中發揮重要作用。通過合成HSV-1的Us11基因，克隆表達制備針對Us11的多克隆抗體，為研究Us11的功能以及與宿主蛋白的相互作用提供的實驗基礎。通過人工合成Us11基因并以其為模板擴增，回收Us11基因片段，克隆至原核和真核表達載體；誘導表達Us11蛋白并純化，制備Us11兔源多克隆抗體；轉染質粒至293T細胞，對細胞表達的蛋白進行間接免疫熒光（IFA）和免疫印跡（WB）檢測。成功構建pCold-Us11和pFLAG-Us11質粒，實現可溶性Us11蛋白表達，純化的Us11蛋白免疫動物獲得針對Us11的多克隆抗體。IFA和Western blot結果顯示，制備的抗血清能特異性檢測到pFLAG-Us11轉染293T細胞表達的Us11蛋白。

Us11；原核表達；真核表達；多克隆抗體

單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus type 1，HSV-1）是一種全世界流行的皰疹性疾病病原體［1］。HSV-1基因組152 kb的雙鏈DNA，編碼76個以上的病毒蛋白。HSV-1主要感染人的口腔、皮膚黏膜、眼粘膜及中樞神經系統，引起齦口炎、唇皰疹、咽炎、角膜炎和皰疹性腦炎，而HSV-1引發的腦炎對人類健康危害最為嚴重［2］。近年來我國HSV-1感染發病率迅速上升，由其所引起的單純皰疹病毒性腦炎（herpes simplex encephalitis，HSE）約占腦炎病例的5%-20%，占病毒性腦炎病例的20%-68%［3］。然而，HSV-1引發腦炎的病理機制尚不十分清楚。已有研究表明HSV-1 感染后，病毒Us11 蛋白在拮抗宿主先天免疫反應中發揮重要作用。Us11能拮抗I 型干擾素刺激產生的抗病毒蛋白PKR、2'-5'寡腺苷酸合成酶；此外HSV-1 Us11 蛋白能隔離dsRNA，阻斷了dsRNA激活PKR［2，4，5］。為了研究HSV-1利用Us11拮抗宿主抗病毒免疫應答的機制，本研究分別構建Us11原核和真核表載體統，原核表達Us11蛋白并制備Us11兔源多克隆抗體，通過間接免疫熒光（IFA）、免疫印跡（Western blot）實驗鑒定Us11真核表達載體轉染細胞并表達Us11蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌、細胞和實驗動物 大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）由本實驗室保存；293T細胞由本實驗室保存；新西蘭大耳白實驗兔購自上海斯萊克實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑與耗材 原核表達載體pCold I和真核表達載體pFLAG 7.1由本實驗室保存；Us11基因、核苷酸引物和序列測定由上海桑尼生物完成；Taq DNA聚合酶、T4連接酶、限制性內切酶、DNA純化試劑盒、DNA標準分子量marker購自TaKaRa（大連）公司；標準蛋白marker（普通及預染）購自Fermentas公司；異丙基-β-D 硫代半乳糖苷（IPTG）購自Sigma公司；弗氏完全佐劑（FCA）和弗氏不完全佐劑（FICA）購自Sigma公司；質粒小量/大量抽提試劑盒購自Axygen公司；His標簽蛋白純化預裝柱購自GE公司；3 kD蛋白超濾管購自Millipore 公司；羊抗兔IgG-HRP、羊抗兔IgGFITC購自CTL公司；West Pico化學發光試劑盒購自Thermo scientific公司；Lipofectamine? 3000購自Invitrogen公司，其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 HSV-1 Us11基因擴增 通過NCBI數據庫查詢Human herpesvirus 1 strain F Us11基因（GenBank：GQ999614.1），根據序列合成Us11全長基因。

根據合成的Us11基因序列，在全長Us11兩端設計PCR引物序列，引物5'末端引入酶切位點。引物序列如下：

上游引物：5'-GGCAAGCTT atgagccagacccaacccccg-3'（下劃線為Hind III 酶切位點），下游引物：5'-GGCGAATTCctatacagacccgcgagccg-3'（下劃線為EcoR I酶切位點）。

以合成的Us11基因為模板，擴增Us11基因用于表達載體克隆。PCR反應體系為：95℃5 min；95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收目的片段。

1.2.2 pCold -Us11原核表達載體構建 將pCold I載體和Us11回收片段分別用Hind III、EcoR I雙酶切，回收純化后使用T4 DNA連接酶連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞后涂布于LB/Amp 平板培養，挑取克隆進行PCR、酶切和測序鑒定，將鑒定正確的質粒命名為pCold-Us11。

1.2.3 Us11蛋白的誘導表達和純化 將重組質粒轉化宿主表達菌BL21（DE3）感受態細胞，挑取單菌落接種至LB/Amp液體培養基，37℃振蕩培養過夜。次日以1∶100比例轉接至新鮮LB/AMP培養基中，37℃振蕩培養2-3 h，OD600值到達0.6時取出，冷卻至15℃時加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，15℃振蕩培養24 h。誘導后的菌液冷卻后離心收集菌體，PBS（0.1 mmol/L PMSF）重懸，在冰浴中超聲波破碎，12 000 r/min 4℃離心后分別收集裂解后的沉淀和上清，加入5X電泳上樣緩沖液，100℃煮沸5 min后進行SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白可溶性表達情況。同時設置pCold I空載體質粒轉化BL21（DE3）宿主菌和BL21（DE3）空菌同步誘導作為對照。

將重組菌單克隆按上述方法接種擴大培養，超聲波裂解菌體后獲得上清，按照HisTrap FF Crude操作手冊純化蛋白，然后使用3 kD蛋白超濾管3 500 r/min 4℃濃縮蛋白。濃縮蛋白通過SDS-PAGE鑒定并使用分光光度計測定濃度，分裝，-80℃保存備用。

1.2.4 Us11兔源多克隆抗體的制備 取純化后Us11蛋白，加入等體積的佐劑，充分乳化，皮下多點注射免疫健康的新西蘭大耳白兔，每只每次免疫蛋白量為100 μg。基礎免疫使用福氏完全佐劑，加強免疫使用福氏不完全佐劑，每次免疫間隔2周，共免疫3次。第3次免疫后2周，對兔子心臟采血，分離血清，分裝，-20℃保存備用。

1.2.5 pFLAG-Us11真核表達載體的構建和擴增 將pFlag 7.1載體和Us11回收片段分別用Hind III 、EcoR I雙酶切，回收純化后使用T4 DNA連接酶連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞后涂布于LB/Amp 平板培養，挑取陽性克隆進行PCR、酶切和測序鑒定，將鑒定正確的質粒命名為pFLAG-Us11。

挑取重組菌單克隆接種至LB/Amp液體培養基擴大培養，收獲菌體使用質粒大量提取試劑盒提取pFLAG-Us11質粒，分裝-20℃保存備用。

1.2.6 IFA檢測293T細胞表達Us11蛋白 將293T細胞接種于24孔細胞板，待細胞生長至70% 時將pFLAG-Us11質粒按照Lipofectamine? 2000操作手冊轉染細胞，質粒 500 ng/孔。培養48 h后取出細胞板，用PBS溫和清洗細胞，加入4%多聚甲醛4℃固定細胞30 min，清洗后用0.1% TritonX-100室溫透化細胞5 min，清洗細胞棄多余液體。以制備的Us11兔抗血清為一抗，按1∶1 000稀釋加入細胞37℃孵育1 h。PBS清洗細胞4遍，以羊抗兔IgG-FITC為二抗，1∶1 000稀釋加入細胞37℃孵育1 h。PBS清洗細胞4遍，在熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.2.7 Western blot檢測pFLAG-Us11轉染細胞表達Us11蛋白 將293T細胞接種于24孔細胞板，待細胞生長至70%時將pFLAG-Us11質粒按照Lipofectamine? 2000操作手冊轉染細胞，質粒 500 ng/孔。培養48 h后取出細胞板，用PBS溫和清洗細胞，加入RIPA裂解液充分反應后吸取裂解液4將293T細胞 12 000 r/min離心10 min。獲取上清蛋白液進行SDS-PAGE，取下凝膠在在半干轉印儀中轉移至PVDF膜，恒壓20 V轉移20 min。取出PVDF膜在含5%脫脂乳的TBST中4℃封閉過夜。次日用PBST洗兩遍，Us11兔抗血清用封閉液按1∶500稀釋后加到PVDF膜上，室溫緩慢搖晃2 h。取出膜用PBST搖晃洗滌3遍，每次10 min。1∶5 000稀釋的羊抗兔IgG-HRP作為二抗，室溫緩慢搖晃1 h，同樣用PBST搖晃洗滌3遍，最后用ECL化學發光試劑盒顯色，在膠片上曝光。

2 結果

2.1 pCold-Us11原核表達載體構建和鑒定

根據GenBank收錄的Human herpesvirus 1 strain F Us11基因序列設計一對特異性引物，從合成的基因模板擴增出Us11全長475 bp（圖1），連接到pCold I載體。重組質粒經PCR鑒定和Hind III 、EcoR I雙酶切鑒定（圖1）。重組質粒測序結果顯示，Us11基因序列和GenBank中的Human herpesvirus 1 strain F Us11序列一致。證明pCold I-Us11原核表達載體構建成功。

圖1 Us11基因擴增和pCold-Us11原核表達載體酶切鑒定

2.2 Us11蛋白的原核表達、純化及其抗血清的制備

在IPTG誘導下，pCold I-Us11在BL21（DE3）中可溶性表達，目的蛋白17.4 kD（圖2）。大量表達后經過鎳離子柱純化并進行濃縮，蛋白液濃度為1.6 mg/mL。收獲的Us11蛋白和佐劑充分乳化后多點免疫大耳白兔，免疫3次后采集抗血清，用于真核表達載體pFLAG-Us11轉染細胞表達鑒定分析。

圖2 pCold I-Us11在BL21（DE3）中的表達

2.3 pFLAG-Us11真核表達載體構建和鑒定

將PCR擴增出的Us11全長基因片段連接到pFlag7.1載體，重組質粒經PCR鑒定和Hind III 、EcoR I雙酶切鑒定（圖3）。重組質粒測序結果顯示，Us11基因序列和GenBank中的Human herpesvirus 1 strain F Us11序列一致。證明pFlag7.1-Us11真核表達載體構建成功。

圖3 pFLAG-Us11真核表達載體酶切鑒定

2.4 pFlag7.1-Us11轉染細胞鑒定

鑒定正確的重組菌單克隆擴大培養，大量抽提質粒后瞬時轉染293T細胞，以制備的Us11兔血清為一抗進行FIA檢測，用熒光顯微鏡觀察，可見轉染pFLAG-Us11重組質粒的細胞綠色熒光彌散分布整個胞漿，而轉染pFlag7.1空載體的細胞未見免疫熒光（圖4）。同時，將pFLAG-Us11質粒瞬時轉染細胞培養后裂解獲取上清，SDS-PAGE后轉印至PVDF膜，以制備的Us11兔血清為一抗進行Western blot檢測，結果（圖5）顯示，重組質粒表達產物在17.4 kD處產生特異性條帶，而對照組無免疫印跡。實驗表明，上述制備的Us11兔多抗能鑒定pFLAG-Us11在細胞中的真核表達。

圖4 IFA檢測Us11蛋白真核表達

圖5 Western blot檢測Us11蛋白真核表達

3 討論

HSV-1原發感染后機體很快產生特異性的免疫力，清除大部分病毒從而使癥狀消失。也有少數病毒可長期潛伏在神經節中的神經細胞內，但不產生臨床癥狀［2，3，6］，當機體免疫力低下時，病毒引起復發性局部皰疹。疫苗和抗病毒藥物依然是預防和治療HSV-1感染的最佳選擇，但HSV-1的疫苗研制多處于研究階段［5，7-9］。葛蘭素史克公司（Glaxo Smith Kline，GSK）研制的HSV糖蛋白D（gD-2）的亞單位疫苗實驗表明只對HSV-1和HSV-2血清陰性的女性有效，而對男性和HSV-1血清陽性的女性群體免疫效果不佳。Chiron公司研發的HSV-2糖蛋白B（gB-2）和gD-2聯合亞單位疫苗因免疫后雖然能產生抗體，但不能抑制對HSV-2的感染，最終停止了研究［5，6，10］。廣泛使用阿昔洛韋（acyclovir，ACV）導致HSV耐藥毒株自1982年就已出現，在免疫系統正常的HSV患者中感染ACV耐藥毒株比例在0.6%以下，而免疫缺陷的患者中ACV耐藥毒株比例高達3%-6%，骨髓移植受體HSV患者的耐藥毒株比例達14%。目前仍無用于臨床安全有效的HSV-1疫苗，其重要原因是HSV-1感染宿主后的致病機制及病毒逃避宿主免疫反應的機制還不完全清楚［7］。

類似于大多數病毒，HSV-1進化出多種策略對抗宿主的先天免疫反應，如干擾IFN信號途徑和IFN刺激基因的抗病毒功能，抑制病毒感染細胞的凋亡利于病毒復制等機制［11］。在HSV-1復制周期早期階段病毒能夠抑制干擾素刺激基因轉錄產物的積聚，這是通過早期蛋白ICP0抑制IRF3介導的ISGs的轉錄激活［12］。值得注意的是，HSV-1感染晚期，能夠在IFN處理的細胞內復制而不會激活RNase L介導的抗病毒反應途徑。HSV-1 感染后Us11 蛋白能抑制2'-5'寡腺苷酸合成酶（2'-5'OAS）的合成，2'-5'OAS/RNase L途徑是IFNs刺激的經典抗病毒先天免疫反應。Us11蛋白RNA結合結構域是抑制OAS必需的。已有研究報道Us11能抑制PKR和PACT介導的抗病毒途徑，其中研究較多的是HSV-1拮抗I 型IFN刺激產生的抗病毒蛋白PKR、2'-5'寡腺苷酸合成酶。PKR是宿主重要抗病毒蛋白，能抑制HSV-1的復制［13］。目前研究表明，HSV-1抑制PKR的抗病毒功能至少涉及兩種機制。HSV-1 L蛋白ICP34.5 能提高蛋白磷酸酶1（PP1）的表達，阻斷PKR介導的磷酸化eIF2進程，從而干擾PKR-eIF2抗病毒途徑。此外，HSV-1 Us11 蛋白能隔離dsRNA，阻斷dsRNA激活PKR。Us11 和ICP34.5 蛋白在對抗IFNs的抗病毒功能中發揮作用。而且Us11還能抑制 2'-5'寡腺苷酸合成酶抗病毒系統［14，15］。Us11能結合RNA，干擾TLR3和RLR對dsRNA的識別作用。

4 結論

本研究運用分子生物學方法，表達了Us11蛋白并免疫兔子制備了多克隆抗體，并使用該抗體對Us11的真核表達進行了鑒定，為深入研究HSV-1 Us11拮抗宿主先天免疫反應提供有價值的技術手段和實驗材料。

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（責任編輯 李楠）

Expression of Protein Us11 and Preparation of Polyclonal Antibodies

TONG Hai-yan1LI Guo-yi1，2TANG Ying1
（1. The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001；2. Oriental Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200085）

The previous studies have discovered that protein Us11 of HSV-1（herpes simplex virus 1）played an important role in antagonistic host innate immune responses after HSV-1 infection. By synthesizing the gene Us11 of HSV-1，the polyclonal antibodies for Us11 were cloned and prepared，which provided the solid experimental basis for studying the functions of Us11 and the interactions between Us11 and host protein. The artificially-synthesized gene Us11 was as template and amplified，and then the recycled gene fragments of Us11 were cloned into the prokaryotic and eukaryotic expression vectors. Further，the induced expressed Us11 protein was purified，and polyclonal antibodies for rabbit were prepared. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells；the expressed protein was detected by indirect immunofluorescence（IFA）and Western blot（WB）. Plasmid pCold-Us11 and pFLAG-Us11 were successfully constructed，soluble Us11 protein expression was achieved，and the polyclonal antibodies targeting for Us11 was acquired by immunizing animal with purified Us11 protein. The results from IFA and WB revealed that prepared antiserum may specially detect the Us11 protein expressed in transfected 283T cells by pFLAG-Us11.

Us11；prokaryotic expression；eukaryotic expression；polyclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.033

2015-05-28

黑龍江省自然科學基金項目（D201219）

童海燕，碩士研究生，研究方向：中樞神經系統感染；E-mail：tonghaiyan1215@163.com

湯穎，副教授；研究方向：中樞神經系統感染；E-mail：hydtangying@hotmail.com