不同金黃色葡萄球菌選擇性分離平板效果比較及探討

林碧蓮

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院， 福建 福州 350002）

不同金黃色葡萄球菌選擇性分離平板效果比較及探討

林碧蓮

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院， 福建 福州 350002）

針對GB 4789.10-2010中Baird-Parker平板對金黃色葡萄球菌特異性低，選擇性弱等問題，文章引入金黃色葡萄球菌顯色平板進(jìn)行補(bǔ)充和改進(jìn)，結(jié)果顯示顯色平板上金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)典型，顏色特異，具有良好的特異性和較強(qiáng)的抗干擾能力。定量比對結(jié)果顯示Baird-Parker平板與顯色平板上金黃色葡萄球菌數(shù)值無顯著性差異，將顯色平板應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的定量檢測具有良好的適用性和較高的可行性。

金黃色葡萄球菌；Baird-Parker平板；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌是人類常見的食源性致病菌之一，產(chǎn)毒菌株可引起食物中毒，歷年來在我國各個省市食源性致病菌監(jiān)測中金黃色葡萄球菌的檢出率排名居高不下[1-3]。現(xiàn)有的檢測方法很多，但只有傳統(tǒng)的培養(yǎng)法被廣泛認(rèn)可，其檢測過程依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB4789.10-2010[4]進(jìn)行，其中以Baird-Parker平板作為定量分離培養(yǎng)基，但其存有很多缺陷，蔡芷荷等[5]發(fā)現(xiàn)其它葡萄球菌如緩慢葡萄球菌，賽氏葡萄球菌在Baird-Parker平板的菌落特征跟金黃色葡萄球菌很相似，同樣為黑色菌落，有渾濁帶和明顯的透明圈；趙薇等在進(jìn)行金黃色葡萄球定量檢測能力驗證時，采用顯色平板計數(shù)的結(jié)果為Baird-Parker平板的兩倍，更接近目標(biāo)值[6]，說明Baird-Parker平板在雜菌多的情況下可能存在特異性差，靈敏度低等問題，這些嚴(yán)重影響了金黃色葡萄球菌的分離率，給日常檢測判讀帶來很大的難度。

因此亟需引進(jìn)性能更好的培養(yǎng)基以更有針對性的高效定量分離金黃色葡萄球菌。目前，金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基因其具有較高的特異性和靈敏度而得到相關(guān)檢驗技術(shù)者的青睞，其通過抑制一些雜菌，并能使目標(biāo)菌形成特定的顏色或形態(tài)而被有效鎖定。國內(nèi)學(xué)者對其進(jìn)行了深入的研究，主要比較分析Baird-Parker平板和各種顯色平板的特異性，各平板對金黃色葡萄球菌的靈敏度，以及實際樣品檢測數(shù)據(jù)差異的顯著性等[6-9]，但對于摻雜菌的定量比對的報道較少，也未見有對金黃色葡萄球菌顯色平板進(jìn)行相關(guān)的質(zhì)量驗收程序的報道，因此文章率先應(yīng)CNAS-CL09：2013質(zhì)量要求[10]，開展商業(yè)化顯色平板的質(zhì)控驗收，并測試3種培養(yǎng)基對混雜菌中金黃色葡萄球的靈敏度，比對測試結(jié)果以確定顯色培養(yǎng)基作為金黃色葡萄球菌的定量計數(shù)平板的適用性和可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

表1 混合菌液在3種平板的菌落總數(shù)及目標(biāo)菌的檢出情況

實驗用菌株均來自于美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號分別為金黃色葡萄球菌：ATCC25923、表面葡萄球菌：ATCC1222、大腸埃希氏菌：ATCC25922、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌：ATCC19115、糞腸球菌：ATCC29212；所用的平板計數(shù)瓊脂（PCA）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、血平板、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Baird-Parker瓊脂、腦心浸出液培養(yǎng)液購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；法國科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基購于鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的質(zhì)量驗收

參照GB 4789.28-2013[11]的商品化培養(yǎng)基質(zhì)量控制中Baird-Parker平板的驗收方法以及廣東環(huán)凱顯色培養(yǎng)基產(chǎn)品說明書中質(zhì)控說明，將金黃色葡萄球菌、表面葡萄球菌、大腸埃希氏菌、糞腸球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的新鮮培養(yǎng)液分別接種于Baird-Parker平板和環(huán)凱、科瑪嘉兩種顯色培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)、特異性并計算目標(biāo)菌株（金黃色葡萄球菌）和陰性菌株（大腸埃希氏菌）的G值。

1.2.2 培養(yǎng)基的靈敏度檢測

將上述5株菌的新鮮培養(yǎng)物分別用生理鹽水制成菌懸液，并通過預(yù)實驗（PCA平板菌落計數(shù)）確定菌濃度并適當(dāng)稀釋至約1000 CFU.mL-1，后各取1 mL菌液混合，補(bǔ)充生理鹽水至10 mL，按照GB 4789.10-2010[4]第二法進(jìn)行顯色平板Baird-Parker平板的涂布及后續(xù)的確證實驗，所得的菌落數(shù)值用于后期的比較分析。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)特征

金黃色葡萄球菌在廣東環(huán)凱顯色培養(yǎng)基上的菌落為紫紅色，菌落直徑大于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基的菌落，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上的菌落為粉色至淡紫色，Baird-Parker平板上菌落黑色，圓潤，周圍有渾濁帶和明顯的透明圈。

表面葡萄球菌在環(huán)凱、科瑪嘉兩種顯色平板微弱生長，呈半透明、乳白色的小菌落，在Baird-Parker平板上菌落呈黑色，有渾濁帶及細(xì)小的透明圈。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在兩種顯色平板均為藍(lán)綠色菌落，生長良好，在Baird-Parker平板上生長良好，菌落黑色，無渾濁帶和透明圈。糞腸球菌在顯色平板上為藍(lán)綠色菌落，生長微弱，在Baird-Parker平板上生長良好，菌落為黑色，無渾濁帶和透明圈。

2.2 培養(yǎng)基的質(zhì)量驗收及特異性驗證結(jié)果

金黃色葡萄球菌在環(huán)凱、科瑪嘉顯色平板和Baird-Parker平板3種培養(yǎng)基上均生長良好，G值分別為10.5、9、11.5；大腸埃希氏菌在3種培養(yǎng)基上都不生長，G值都等于0，都達(dá)到GB 4789.28-2013商品化分離平板目標(biāo)菌的質(zhì)控要求（目標(biāo)菌株G值＞6，陰性菌株＜1）。

2.3 培養(yǎng)基靈敏度的測試結(jié)果

表1顯示了混合菌液在環(huán)凱、科瑪嘉顯色平板和Baird-Parker平板3種平板的菌落數(shù)及目標(biāo)菌數(shù)，其中Baird-Parker平板上的菌落總數(shù)明顯大于顯色平板，類似的，疑似目標(biāo)菌數(shù)Baird-Parker平板也明顯高于顯色平板。但是，經(jīng)過確證實驗，3種平板的目標(biāo)菌數(shù)的平均值分別為87，89，90(單位都為CFU.mL-1)，無顯著性差異。

3 分析與討論

Baird-Parker平板含有的氯化鋰和亞碲酸鉀能抑制大多數(shù)非葡萄球菌類雜菌的生長。金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)生的卵磷脂酶和脂肪酶，能分解卵黃使得菌落周圍形成渾濁沉淀環(huán)和透明圈，同時由于亞碲酸鉀被還原而使菌落呈黑色。此次試驗中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌在Baird-Parker平板都為黑色菌落，表皮葡萄球菌有渾濁帶和透明圈、與目標(biāo)菌顏色形態(tài)相似具有干擾作用；顯色平板中特定的顯色底物能使目標(biāo)菌菌落顯現(xiàn)特定的顏色，而干擾菌被抑制或不產(chǎn)生特征性顏色，使目標(biāo)菌直觀易于挑取和計數(shù)，金黃色葡萄球菌顯色平板上金黃色葡萄球菌菌落呈粉紅色或紫紅色，表面葡萄球菌呈細(xì)小的乳白色菌落，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和糞腸球菌為藍(lán)綠色菌落，各種菌的菌落特征明顯，特異性強(qiáng)，易于金黃色葡萄球菌的有效鎖定。

從混合菌液中篩選金黃色葡萄球菌，兩種顯色平板的菌落總數(shù)(約380 CFU/mL)明顯低于Baird-Parke平板（486 CFU/mL），說明顯色平板對雜菌的抑制效果更好，抗雜菌干擾性的能力更強(qiáng)。可疑菌落數(shù)的比較（Baird-Parker平板平均值113 CFU/mL，顯色平板平均值分別為87 CFU/mL,89 CFU/mL）也說明這一問題；最后3種培養(yǎng)基確認(rèn)的目標(biāo)菌數(shù)據(jù)平行性好，檢測結(jié)果無顯著差異，說明顯色培養(yǎng)具有較高的適用性。國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者的報道也證實這一點(diǎn)，報道中指出在實際樣品檢驗中，顯色平板檢測性能優(yōu)于Baird-Parker平板[5-9，12]。此外，研究結(jié)果顯示2種顯色平板都符合GB 4789.28-2013的商品化培養(yǎng)基驗收要求。所以，將金黃色葡萄球菌顯色平板應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的定量檢測具有良好的可行性，在國家標(biāo)準(zhǔn)未修改前，建議引進(jìn)此顯色培養(yǎng)基作為GB 4789.10-2010中金黃色葡萄球菌檢測的輔助手段。

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[10] CNAS -CL09:2013 檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明[S].

[11] GB 4789.28-2013 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求[S].

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O651

A

1007-550X（2016）07-0040-03

10.3969/j.issn.1007-550X.2006.07.001

2016-06-20

林碧蓮（1985-），女，福建漳州人，主要從事微生物檢驗工作。