西藏靈菇中分離兩株干酪乳桿菌及其益生特性比較研究

馮沸，梅俊，李云飛

（上海交通大學農業與生物學院，上海200240）

西藏靈菇中分離兩株干酪乳桿菌及其益生特性比較研究

馮沸，梅俊，李云飛*

（上海交通大學農業與生物學院，上海200240）

從西藏靈菇中篩選出28株革蘭氏染色陽性菌，通過生理生化特征和16S rDNA序列同源性分析分離篩選出2株干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）G1、G2，對其進行益生特性比較研究。結果表明，菌株G1、G2均具有較快的產酸能力；均可以在較大溫度范圍中生長，最適溫度為40℃左右；具有較強的耐酸性；菌株G2耐膽鹽能力明顯高于菌株G1；菌株G1、G2對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和沙門氏菌（Salmonella）均具有抑制作用，對大腸桿菌的抑制效果較為明顯；菌株G1、G2對抗生素敏感性存在差異，對慶大霉素、諾氟沙星和氯霉素均產生耐藥性，呈現多重耐藥性。

西藏靈菇；干酪乳桿菌；分離鑒定；益生特性

西藏靈菇（Tibetan kefir）是一種產自西藏的開菲爾粒，顏色呈乳白色、膠質狀的塊狀物，表面可以見到多層的網狀結構，顆粒具有一定的彈性，且自身具有風味，直徑在1～15 mm不等，外形酷似小塊花椰菜［1］。西藏靈菇作為一種傳統的發酵劑，除乳酸發酵外還會伴有輕微的酒精發酵，其風味具有酸味、香味和輕微的醇香味［2］。經西藏靈菇發酵制得的發酵乳營養豐富，具有提高免疫活性［3-4］、調節腸胃適應［5］、生物抑菌［6-7］等醫療保健作用。西藏靈菇菌落結構豐富，成分包括乳酸菌（主要包括乳酸球菌、乳酸鏈球菌、乳酸桿菌）、酵母菌（假絲酵母屬、克魯維酵母屬）和醋酸菌等微生物在多糖環境中經過長期的相互適應和協同作用形成的復雜的菌相共生體［8］。干酪乳桿菌作為一種益生菌，可以起到調節腸內菌群平衡、促進人體的消化吸收等作用，也是西藏靈菇的主要發酵乳桿菌［9］。

本研究主要通過生理生化特征和16S rDNA序列同源性分析從西藏靈菇中分離干酪乳桿菌并鑒定，研究其產酸能力、生長條件、抑菌性及抗生素耐藥性等益生特性，以期為西藏靈菇發酵劑提供優良發酵菌株。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1西藏靈菇的來源及培養

西藏靈菇樣品來自于西藏林芝地區。在實驗室將西藏靈菇以10 g/100 mL的量接種于光明無抗純牛乳中制備西藏靈菇發酵乳培養液，置于37℃環境條件下，每24 h更換一次牛奶。

1.1.2培養基及試劑

MRS培養基、LB培養基、MH培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；AxyPrep細菌基因組DNA小量制備試劑盒：上海百賽生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNA Marker：上海桑尼生物科技有限公司；抗菌藥物藥敏紙片：杭州微生物試劑有限公司；豬膽鹽試劑：國藥集團化學試劑有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、沙門氏菌（Salmonella）ATCC14028：上海北諾生物科技有限公司。

1.2儀器與設備

2720 Thermal cycler PCR儀、3730-XL測序儀：美國應用生物系統公司；5804R離心機：德國Eppendorf（中國）公司；2500凝膠成像系統：上海天能科技有限公司；pL203電子天平：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-1D單人單面直凈化工作臺：上海蘇凈實業有限公司；Systec VB-55 4812高壓滅菌鍋：美國Autoclave公司；UV2801型紫外分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；JK-SCI-50生化培養箱：上海精密科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1乳酸菌的形態觀察和生理生化鑒定

用接種環取西藏靈菇發酵乳培養液，在MRS培養基上劃線，37℃恒溫培養48 h，用滅菌環蘸取形成透明圈的單菌落在MRS培養基上多次復篩。對復篩菌落通過顯微鏡觀察菌落顏色、形態、邊緣、表面等菌落特征。對菌落進行革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗等鑒定其生理生化特性［10］，進行初步的乳桿菌屬的篩選［11］。

1.3.2乳酸菌的分子鑒定

基因組DNA的提取參照文獻［12］的方法進行。以細菌菌落16S rDNA通用引物27F和1492R為上下游引物，染色體DNA為模板擴增菌株的16SrDNA。聚合酶鏈反應（polymerase chainreaction，PCR）反應條件為：95℃預變性5min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，循環35次，72℃終延伸7 min。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物用DNA凝膠回收試劑盒回收，使用測序儀進行DNA測序。將菌株序列與GenBank數據庫中通過局部序列排比檢索基本工具（basic local alignment search tool，BLAST）選取的基因序列同源性最高的已知分類菌株序列進行多序列比較，計算同源百分比，并以菌株的16S rDNA序列為基礎，通過MEGA軟件，以非加權配對算數平均法（unweighted pairgroupmethodwithanithmeticmean，UPGMA）構建系統發育樹。

1.3.3菌株產酸特性

將實驗分離菌株新鮮菌液按接種量5%（V/V）接種于MRS液體培養基中（pH 5.4），37℃恒溫培養24 h，測定培養基的pH及滴定酸度的變化。

1.3.4溫度對菌株生長的影響

將實驗分離菌株新鮮菌液分別置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃恒溫水浴條件下靜置1 h，按5%（V/V）接種于MRS液體培養基中，37℃恒溫培養24 h，測菌液OD600nm。

1.3.5初始pH對菌株生長的影響

配制初始pH值為2.0、3.0、4.0、5.0和6.0的MRS液體培養基，將實驗分離菌株新鮮菌液按接種量5%（V/V）接種于其中，37℃恒溫培養24 h，測菌液OD600nm。

1.3.6耐膽鹽能力測定

配制膽鹽含量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的MRS液體培養基，將實驗分離菌株新鮮菌液按5%（V/V）接種到各培養基中，37℃恒溫培養48 h，測菌液OD600nm。菌株存活率=（實驗組OD600nm-空白組OD600nm）/（對照組OD600nm-空白組OD600nm）。

1.3.7抑菌性試驗

參考楊尚嬌等［13］采用的方法測定菌株對金黃色葡萄球菌（S.aureus）、大腸桿菌（E.coli）、沙門氏菌（Salmonella）菌液的抑菌性。將0.1 mL指示菌菌懸液均勻涂布在LB培養基上，培養皿中等距放置4個牛津杯（直徑8 mm），其中3個牛津杯中加入0.2 mL分離菌株新鮮菌液，無菌水作對照，37℃恒溫培養16 h，觀察抑菌圈直徑大小。

1.3.8抗藥性試驗

參考陳燃等［14］進行乳酸菌藥物敏感性試驗的藥物紙片瓊脂擴散法，根據美國臨床實驗室標準化委員會（national committee for clinical laboratory standards，CLSI）的最新規則和標準［15］進行結果判讀。將菌株活化24 h后，采用l%接種量涂布在MRS培養基上，37℃培養24 h，將菌液活菌含量調整為108CFU/mL，取0.1 mL菌液于MH培養基中，將標準藥敏片貼于板上，37℃恒溫培養48 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小。

1.3.9數據分析

利用SAS軟件進行數據分析，顯著性水平定為0.05。

2　結果與分析

2.1乳酸菌的鑒定

2.1.1菌株的形態特征

西藏靈菇樣品經過MRS培養基分離純化出28株革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性的菌株，編號為G1和G2，通過顯微鏡觀察菌落及菌體形態特征，結果見圖1。

圖1　西藏靈菇中分離乳桿菌菌體形態及菌落形態Fig.1 Cell and colonial morphology ofLactobacillusisolated from the Tibetan kefir

由圖1可知，兩株菌落在MRS培養基表面形成直徑約2 mm的圓形菌落，表面光滑、中央凸起、邊緣整齊，刮起時菌落具有一定黏稠性，呈奶白色。菌體形態為單個、成鏈狀的短桿菌菌株。

2.1.2生理生化試驗

對兩株菌進行接觸酶試驗、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗，結果見表1。

表1　菌株的生理生化鑒定Table 1 Physiological and biochemical identification of strains

由表1可知，G1和G2兩株菌均呈革蘭氏陽性。接觸酶試驗、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗均呈陰性，葡萄糖產酸試驗、4.0%、6.5%NaCl生長試驗、15℃、45℃生長試驗均呈陽性。通過與文獻［11］對比可初步鑒定菌株G1和G2為乳桿菌。

2.1.3菌株的分子生物學鑒定

對G1和G2兩株乳桿菌進行進一步分子生物學鑒定，通過菌株的16S rDNA PCR擴增，擴增產物電泳結果見圖2。

圖2　菌株G1和G2的16S rDNA PCR擴增產物電泳圖譜Fig.2 PCR amplified products electrophoretogram of 16S rDNA of strains G1and G2

通過MEGA軟件，以UPGMA法構建系統發育樹，結果見圖3。菌株G1與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）12A（CP006690）同源性為99.87%，菌株G2與干酪乳桿菌的類干酪乳桿菌干酪亞種（Lactobacillusparacasei）KL1（CP013921）同源性為99.91%，菌株G1、G2與L.paracaseiN1115（CP 007122）、L.paracaseiL9（CP012148）、L.paracaseiCAUH35（CP012187）同源性均在99%以上，可以認為G1、G2和干酪乳桿菌為屬內同種。

圖3　菌株G1和G2 16S rDNA的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA of strains G1 and G2

2.2乳酸菌特性

2.2.1菌株產酸能力

干酪乳桿菌常用作牛奶、酸乳、奶油和干酪等乳制品發酵劑，需要有較好的發酵產酸特性。酸乳的發酵過程就是原乳中乳糖參與糖酵解途徑，最終生成乳酸，造成酸度的增強，可以降低消化道的pH值，從而抑制病原菌的生長和繁殖，同時也是抑制乳桿菌自身生長的原因之一［16］。干酪乳桿菌發酵24 h過程中滴定酸度和pH值的變化情況如圖4所示。

圖4　干酪乳桿菌發酵過程中滴定酸度和pH值的變化Fig.4 Changes of titratable acidity and pH value during L.caseifermentation

由圖4可知，在培養的前4 h，菌株G1、G2生長迅速，同時產酸能力較強，乳酸大幅增加，滴定酸度迅速上升，pH值迅速下降，這一階段菌株G1產酸能力比菌株G2強，酸度變化較快，組間組內差異性顯著（P＜0.05）。自14 h起，菌株G2的產酸量逐漸大于菌株G1，組間組內差異性顯著（P＜0.05）。20 h后菌株的產酸變化逐漸減小，酸度及pH值變化趨勢逐漸減小趨緩，菌株生長受到環境酸度的抑制。菌株G1、G2均具有較快的產酸能力，菌株G2則體現出較為持續的產酸能力。

2.2.2溫度對菌株生長的影響

溫度對干酪乳桿菌生長的影響變化情況如圖5所示。由圖5可知，菌株G1、G2經過30℃、35℃、40℃、45℃熱處理1 h后，菌株生長無明顯的影響（P＞0.05），均可以較好地生長，其中40℃熱處理條件下菌株生長能力最強，組間無顯著性差異（P＞0.05）。經過50℃處理后，菌株G2較菌株G1生長活性低。在55℃處理后，菌株G1、G2的OD600nm下降至40℃處理后菌液OD600nm的65.3%和76.5%，60℃處理后，菌株G1、G2存活度下降至40℃處理后菌液OD600nm的42.3%和35.1%，其中菌株G2的溫度耐受性顯著高于菌株G1。同時菌株G1、G2均可以在較大溫度范圍中生長，最適溫度均為40℃左右。

圖5　溫度對干酪乳桿菌生長的影響Fig.5 Effect of temperature on growth ofL.casei

2.2.3初始pH值對菌株生長的影響

圖6　初始pH值對干酪乳桿菌生長的影響Fig.6 Effect of initial pH on growth of L.casei

pH值對干酪乳桿菌生長的影響變化情況如圖6所示。由圖6可知，菌株G1和G2在初始pH值為6.0時生長最好，隨pH值的降低，菌落生長逐漸減緩。初始pH值為3.0時菌株G1、G2菌液OD600nm為初始pH6.0時的72.5%和76.8%，初始pH值為2.0時菌株G1、G2菌液OD600nm為初始pH6.0時的41.1%和53.9%，菌株G1、G2在初始pH值為2.0、3.0時生長受到抑制顯著（P＜0.05），與菌株G1、G2 48 h產酸能力近似。菌株G1、G2組間無顯著性差異（P＞0.05），可以認為兩株乳桿菌具有相似且較強的耐酸性，適宜在pH值4.0～6.0的環境中進行產酸。

2.2.4菌株膽鹽耐受能力

干酪乳桿菌作為一種益生菌，能夠耐受口腔中的酶、胃液中低pH條件和小腸的膽汁酸等進入腸道，從而起到調節腸道內菌群平衡、促進營養消化吸收的功能，故在試驗中考察菌株的耐酸和耐膽鹽能力以評價體現菌株腸道內存活能力，結果見圖7。由圖7可知，在膽鹽濃度＜0.2%時，G1、G2菌株的生長沒有明顯差異（P＞0.05），可以維持90%以上的存活率。隨膽鹽濃度增高，G1、G2菌株之間的存活率迅速下降，且兩者之間出現顯著性差異（P＜0.05），菌株G2耐膽鹽能力明顯高于菌株G1，在高膽鹽濃度（≥0.5%）時，菌株G2存活率＞50%，菌株G1為30%左右，菌株G2耐膽鹽能力明顯高于菌株G1。此外，有文獻利用微膠囊包埋等［17］技術可以將干酪乳桿菌的胃腸道存活度提升到85%左右，利于其營養保健作用的發揮。

圖7　干酪乳桿菌耐膽鹽能力Fig.7 Cholate resistant ability ofL.casei

2.2.5菌株對常見有害菌群抑菌性

圖8　干酪乳桿菌抑菌圈直徑Fig.8 Diameter of antibacterial circle ofL.casei

干酪乳桿菌對常見有害菌群的抑菌圈直徑如圖8所示。由圖8可知，菌株G1、G2對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌均具有一定的抑菌性。其中菌株G2對大腸桿菌的抑制效果較為明顯，且明顯強于菌株G1，對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌則兩菌株無顯著性差異（P＞0.05）。根據產酸試驗可知，菌株G2具有較強的產酸能力，可能是由于酸性環境產生較高的氧化還原電位，對大腸桿菌產生抑制作用。此外，干酪乳桿菌能夠產乳酸菌素，抑制和殺死食品中的腐敗菌和致病菌，可以作為發酵乳的良好防腐、抑菌物質。

2.2.6菌株抗生素藥物敏感性

對菌株G1、G2進行常見的8種抗生素進行敏感性實驗，結果見表2。由表2可知，菌株G1、G2對抗生素敏感性存在差異。其中菌株G1對青霉素、萬古霉素敏感，對于紅霉素中度敏感，而菌株G2對這3種抗生素產生耐藥性；菌株G1、G2對氨基糖苷類的慶大霉素和諾氟沙星、氯霉素均產生耐藥性，對氨芐西林和克林霉素敏感，呈現多重耐藥性。干酪乳桿菌具有的多重耐藥性可能存在潛在的抗藥性基因傳遞，對腸道菌群和致病菌存在抗藥因子傳遞的［18］，因此需要在發酵乳生產過程中進行必要的菌株耐藥性檢測，控制抗藥菌株的擴散。

表2　兩株干酪乳桿菌對常用抗生素的藥敏性Table 2 Antibiotic susceptibility of the two strains ofL.casei on common antibiotics

3　結論

從西藏靈菇中篩選出28株革蘭氏陽性菌，通過菌落形態特征、生理生化特征和16S rDNA序列同源性分析鑒定菌株G1、G2為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。菌株G1、G2均具有較快的產酸能力，在培養初期，菌株G1產酸能力比菌株G2強，菌株G2則體現出較為持續的產酸能力。菌株G1、G2在40℃熱處理條件下菌株生長能力最強，均可以在較大溫度范圍中生長，最適溫度為40℃左右。菌株G1、G2具有較強的耐酸性，且適宜在pH值4.0的環境中進行產酸。菌株G2耐膽鹽能力明顯高于菌株G1，在高膽鹽濃度時，菌株G2存活度高于50%，菌株G1為30%左右。菌株G1、G2對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌均具有一定的抑菌性，對大腸桿菌的抑制效果較為明顯。菌株G1、G2對抗生素敏感性存在差異，對慶大霉素、諾氟沙星和氯霉素均產生耐藥性，呈現多重耐藥性。

研究結果反映了西藏靈菇源干酪乳桿菌的益生特性，且實驗分離的干酪乳桿菌G2具有更佳的產酸能力、耐溫能力、膽鹽耐受能力和對常見有害菌群的抑菌性，可作為西藏靈菇復合菌株發酵劑的備選菌株。

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FENG Fei，MEI Jun，LI Yunfei*
（School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China）

Twenty eight strains of gram-positive bacteria were isolated from Tibet kefir.Two strains ofLactobacillus caseiG1 and G2 were isolated and identified by physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence homology analysis，and their probiotic characteristics were compared and investigated.The results showed that both strains G1 and G2 had faster ability to produce acid and stronger acid resistance.They could grow in a large temperature range.The optimum temperature was about 40℃.The cholate resistant ability of strain G2 was apparently higher than that of strain G1.Both strains G1 and G2 had inhibitory effect onStaphylococcus aureus，Escherichia coliandSalmonella，and the inhibitory effect onE.coliwas the most obvious.There were different sensitivities of strains G1 and G2 on antibiotics.Strains G1 and G2 had drug resistance on gentamycin，norfloxacin and chloramphenicol，which showed multiple drug resistance.

Tibet kefir；Lactobacillus casei；isolation and identification；probiotic characteristics

Q936

0254-5071（2016）06-0035-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.008

2015-12-22

十三五“國家科技支撐計劃”項目（2013BAD18B02）

馮沸（1991-），男，碩士研究生，研究方向為食品科學。

李云飛（1954-），男，教授，博士，研究方向為食品質構與流變學。