大曲蛋白酶對固態釀酒發酵的影響

向雙全，黃應予，劉麗娟，王蕾，候花寧，周瑩瑩

（1.甘肅省固態發酵工程技術研究中心，甘肅徽縣742308；2.金徽酒股份有限公司技術中心，甘肅徽縣742308）

大曲蛋白酶對固態釀酒發酵的影響

向雙全1，2，黃應予1，2，劉麗娟2，王蕾2，候花寧2，周瑩瑩2

（1.甘肅省固態發酵工程技術研究中心，甘肅徽縣742308；2.金徽酒股份有限公司技術中心，甘肅徽縣742308）

在傳統濃香型固態釀酒工藝的基礎上，采用響應面法對影響釀酒出酒率的關鍵響應因子進行了研究和探討。用統計學方法建立了出酒率與糟醅酸度、糟醅水分、大曲蛋白酶活力組成的二次多項式數學模型，并通過分析模型方程和響應曲面得到本試驗方案固態釀酒最佳條件，即糟醅酸度為1.9度，糟醅水分含量為53%，大曲蛋白酶活力為14 U/g。在此最佳條件下，出酒率達到47.3%。

酸度；水分；大曲蛋白酶；出酒率

大曲蛋白酶是一種復合型蛋白酶，具有在酸性、中性、堿性條件下保持酶活力的特點，它是制曲過程多種微生物的代謝產物［1-5］。在固態釀酒發酵過程中大曲蛋白酶具有促進原料溶解、分解蛋白質、生成氨基酸、提供氮源、促進微生物繁殖生長，降解酵母菌體、提高原料利用率、提供生香前驅物質和風味組分，協同其他微生物共發酵、抑制大量雜醇油的生成、提高原酒產量和質量等重要作用［6-10］。

在傳統固態白酒釀造過程中經常會出現原料利用率低，發酵結束后糟醅酸度、殘糖、殘余淀粉越來越高、出酒率和質量下降的惡性循環狀態。究其主要原因：一方面是蛋白質對淀粉的包裹作用，阻礙大曲液化酶、糖化酶對淀粉的充分水解；另一方面是由于蛋白質未被水解，發酵需要的氮源嚴重缺乏，影響釀酒微生物的繁殖代謝，特別是酵母菌對氮源的需求［11］。大曲中蛋白酶活力適當的情況下，包裹淀粉的蛋白質層結構會被破壞，使淀粉被糖化；另一方面蛋白質水解增加了氮源，有利于釀酒微生物，特別是酵母菌的代謝繁殖，糟醅的惡性狀況會逐漸改善，達到正常生產水平。本研究通過Design Expert 8.05b（Box-Behnken）試驗設計進行響應面試驗［12-14］，優化了大曲蛋白酶在固態釀酒中的最佳酸度和水分配合發酵條件，充分發揮其在固態釀酒發酵過程中的作用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

中溫大曲：宜賓市長興酒廠；酸性蛋白酶（10萬U/g）：山東隆大科技公司；高粱、大米、糯米、玉米、小麥、稻殼：湖北夢晶米業公司。

蒸餾水、福林試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、酪蛋白、L-酪氨酸、氫氧化鈉、鹽酸、乳酸、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

T6紫外-可見分光光度計：普析通用公司；XPE105電子天平：梅特勒-托利多公司；DK-S14恒溫水浴鍋、DGG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱、SHP-150生化培養箱：上海森信試驗儀器有限公司；FZ102微型植物粉碎機：山東泰斯特儀器有限公司；5 L蒸酒設備：自制。

1.3方法

1.3.1工藝流程

糧粉→加水潤糧→加入稻殼混勻→入甄蒸煮→出甄檢測糟醅水分、酸度→調節糟醅水分、酸度→加入調好蛋白酶活力的曲粉→裝袋密封→放入培養箱恒溫發酵→取出蒸酒

1.3.2操作要點原料粉碎

將5種糧食粉碎，過20目篩；按高粱∶大米∶糯米∶小麥∶玉米比例為38%∶22%∶20%∶12%∶8%進行混合。大曲粉碎后過20目篩。

取1 kg混合糧粉，加入600 mL溫水潤糧30 min，加入250 g熟稻殼，混勻，在蒸酒設備上大氣蒸煮70 min后出甄，出甄后加入80℃熱水。通過調整加入熱水的量來控制發酵糟醅水分；同時通過在熱水中加入不同量的乳酸來控制發酵糟醅的酸度。加入熱水燜潤15 min后攤開糟醅冷卻，當溫度降至20℃時加入調好蛋白酶活力的大曲粉250g。最后收堆密封，放入27℃培養箱中恒溫發酵10 d后取出發酵后糟醅。

1.3.3單因素試驗

糟醅酸度對出酒率的素影響：設定糟醅水分含量為50%，大曲蛋白酶活力為10.0U，分別調整糟醅酸度為1.4度、1.7度、2.0度、2.3度、2.6度、2.9度，考察糟醅酸度對出酒率的影響。糟醅酸度的定義為10 g糟醅消耗0.10 mol/L氫氧化鈉標準溶液的毫摩爾數為糟醅酸度，消耗1 mmol氫氧化鈉標準溶液為1度。

糟醅水分對出酒率的影響：設定糟醅酸度為1.5度，大曲蛋白酶活力為10.0 U，分別調整糟醅水分含量為46%、48%、50%、52%、54%、56%，考察糟醅水分含量對出酒率的影響。

大曲蛋白酶活力對出酒率的影響：設定糟醅水分含量為50%，糟醅酸度為1.5度，分別調整大曲蛋白酶活力為5.0 U/g、10 U/g、15 U/g、20 U/g、25 U/g、30 U/g，大曲蛋白酶活力對出酒率的影響。大曲蛋白酶活定義為1 g（干質量）大曲中所含的蛋白酶在40℃、pH值為3.0的條件下1 min水解干酪素產生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位（U/g）［15］。

1.3.4響應面試驗

采用Design Expert 8.05b軟件設計試驗，選取發酵糟醅水分、糟醅酸度、大曲蛋白酶活力為3個評價因素，以出酒率為響應值，設計3因素3水平的響應面分析試驗，因素與水平見表1。

表1　Box-Behnken試驗因素水平及編碼Table 1 Factors and coded levels of Box-Behnken design

1.3.5測定方法

出酒率：糟醅發酵10d后取出拌糠蒸餾，用500 mL量筒接酒，同時在量筒中放入溫度計和酒精計，當量筒中的酒精度降至60%vol時，停止接酒，記錄蒸出酒體積，按60%vol酒精度計算出酒率。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果與分析

2.1.1糟醅酸度對出酒率的影響

糟醅酸度對出酒率的影響結果見圖1。由圖1可見，糟醅酸度為1.4～2.0度時，隨著酸度的增加，釀酒微生物繁殖代謝能力逐漸增強，出酒率也增加；當糟醅酸度＞2.0度時，釀酒微生物繁殖代謝能力減弱，出酒率開始下降。因此，確定出酒率最佳的糟醅酸度為2.0度。

圖1　糟醅酸度對出酒率的影響Fig.1 Effect of fermented grains acidity on Baijiuyield

2.1.2糟醅水分含量對出酒率的影響

糟醅水分含量對出酒率的影響見圖2。由圖2可見，糟醅水分含量在46%～52%的范圍內時，隨著水分含量的增加，出酒率也增加；當水分含量＞52%時，出酒率開始下降。因此，確定出酒率最佳糟醅水分為52%。

圖2　糟醅水分含量對出酒率的影響Fig.2 Effect of fermented grains moisture onBaijiuyield

2.1.3大曲蛋白酶活力對出酒率的影響

大曲蛋白酶活力對出酒率的影響見圖3。由圖3可見，大曲蛋白酶活力在5～15 U/g的范圍內時，隨著大曲蛋白酶活力的增加，出酒率也增加；當大曲蛋白酶活力＞15 U/g時，出酒率開始下降。因此，確定出酒率最佳的大曲蛋白酶活力條件為15 U/g。

圖3　大曲蛋白酶活力對出酒率的影響Fig.3 Effect of Daqu protease activity onBaijiuyield

2.2響應面試驗設計和顯著性分析

試驗設計和數據利用DesignExpert8.05b（Box-Behnken）軟件處理，用F（Fischer）檢驗評價數學模型方程的顯著性，方程的擬合性由決定系數R2確定，以確定固態發酵過程中糟醅酸度、水分以及大曲蛋白酶活力的最佳配比，試驗設計及結果見表2。利用Design Expert 8.05b軟件對試驗結果進行方差分析，結果見表3。

表2　Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

通過對數據進行多元回歸擬合，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：Y=2885.4-3.93A+1.84B-0.59C-0.30AB+ 0.35AC-0.17BC-8.87A2-3.29B2-4.34C2。用該回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時，決定系數R2=0.973 2，說明了97.32%的響應值變化是由該模型決定的，調整后決定系數值為0.9384說明試驗中出酒率與模型預測值有93.84%的一致性，由此表明該模型對試驗結果能進行較準確的預測。模型的顯著水平P＜0.01，此時二次回歸方程是極顯著的，方程對試驗擬合較好，因此可用此模型對響應面進行分析和預測。通過比較方程一次項系數絕對值大小，可以判斷在本試驗工藝參數中，糟醅酸度、二次項均達到極顯著水平（P＜0.01），糟醅水分含量對結果影響顯著（P＜0.05），交互項對果影響不顯著（P＞0.05）。由表3可知A的P值為0.001，B的P值為0.000 2，C的P值為0.014 1，說明各自變量在設定的取值范圍內單因素對出酒率的影響順序為A＞B＞C。失擬項P=0.1379＞0.05，未達到顯著水平，表明試驗設計合理，該模型能準確描述各變量因素與響應值之間的關系。

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3響應面的分析與優化

通過模型方程得出的響應曲面及等高線圖，結果見圖4。

由圖4可知，AC兩因素間的交互作用大于AB以及BC之間的交互作用；其結果與擬合方程中交互項系數的絕對值大小關系一致。由圖4可以看出，等高線均呈橢圓形，說明各兩因素間的交互作用較強。由此可以說明在固態釀酒過程影響出酒率因素中，大曲蛋白酶活力的影響不可忽視，在固態釀酒工藝參數范圍內大曲蛋白酶活力僅次于糟醅酸度對出酒率的影響，且大于糟醅水分對出酒率的影響，由此試驗可以認為大曲蛋白酶活力在固態釀酒過程中的重要作用及地位。

圖4　糟醅酸度、糟醅水分含量、大曲蛋白酶活力交互作用對出酒率影響的響應曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermented grains acidity，moisture and Daqu protease activity onBaijiu yield

2.4模型驗證

對擬合的二次多項式回歸方程分別求A、B、C的偏導數，可得各個因素的極值點：A=1.87，B=52.77，C=14.37。

即糟醅酸度1.87度，糟醅水分52.77%，大曲蛋白酶活力14.37 U/g。為方便實際操作，調整糟醅酸度為1.9度，糟醅水分為53%，大曲蛋白酶活力為14 U/g，在此條件下進行3次平行試驗，出酒率平均值為47.3%。

3　結論

本試驗根據傳統固態釀酒工藝控制要點的基礎上，固定其他工藝要素，選擇糟醅酸度、水分含量、大曲的蛋白酶活力3個因素，應用響應面法對3因素進行優化，建立了固態釀酒出酒率與糟醅酸度、水分含量、大曲蛋白酶活力組成的二次多項式數學模型，并通過分析模型方程得到本試驗方案固態釀酒最佳條件，即糟醅酸度為1.9度，糟醅水分含量為53%，大曲蛋白酶活力為14 U/g，在此條件下的出酒率為47.3%。

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XIANG Shuangquan1，2，HUANG Yingyu1，2，LIU Lijuan2，WANG Lei2，HOU Huaning2，ZHOU Yingying2
（1.Gansu Province Solid State Fermentation Engineering Technology Research Center，Huixian 742308，China；2.Provincial Technology Center of Jinhui Liquor Co.，Ltd.，Huixian 742308，China）

On the basis of traditional flavor type of solid-state fermentation process ofBaijiu，the key factors affectingBaijiuyield were researched by response surface methodology.Quadratic polynomial mathematical model was established betweenBaijiuyield and fermented grains acidity，moisture and Daqu protease activity by statistical method，and the optimal solid-state fermentation process was determined by analyzing model equations and response diagram as follows：fermented grains acidity 1.9，moisture 53%，Daqu protease activity 14 U/g.Under the optimum conditions，the Baijiuyield was 47.3%.

acidity；moisture；Daqu protease；liquor yield

TS261.1

0254-5071（2016）06-0101-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.021

2016-04-23

甘肅省科技廳科技計劃項目（144JTGK220）

向雙全（1979-），男，工程師，本科，研究方向為白酒風味成分和白酒釀造。