響應面法優化酒糟水解液發酵生產木糖醇

王浩，李炎璋，李迎，趙亮，宋健，賈士芳

（太原科技大學化學與生物工程學院，山西太原030000）

響應面法優化酒糟水解液發酵生產木糖醇

王浩，李炎璋，李迎，趙亮，宋健，賈士芳*

（太原科技大學化學與生物工程學院，山西太原030000）

研究熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）GIM2.7發酵酒糟水解液生產木糖醇的最佳工藝條件，提高酒糟資源的利用率。在單因素試驗結果的基礎上，選擇主要因素接種量、裝液量、有機氮源添加量進行響應面優化。結果表明，當接種量為16%、有機氮源添加量5%、裝液量109 mL/250 mL時，木糖醇轉化率可達到57.8%，與預測值（60.4%）相接近，說明響應面優化酒糟水解液生產木糖醇的發酵條件是有效的。

酒糟水解液；木糖醇；發酵；熱帶假絲酵母；響應面法

木糖醇是一種重要的功能性五碳糖醇，其甜度與蔗糖相當，熱量與葡萄糖相當，在體內代謝不需胰島素參與，也不會造成血糖的急劇變化，可作為糖尿病人的甜味替代品［1］。此外，由于木糖醇具有預防齲齒、溶解熱大、不發生美拉德反應等功效以及具備甘油和其他多元醇的優異特性，可廣泛用于醫療、化工、食品等行業［2-3］。

目前，國內外工業化生產木糖醇的主要方法是化學合成法，即用富含半纖維素的玉米芯、棉子殼、甘蔗渣、樺木片等農副產品經酸（如HCl、H2SO4）水解成木糖后，經純化處理和加氫反應制得木糖醇，該方法成本高、產率低、污染較嚴重［4］。鑒于化學法生產木糖醇存在的一些弊端，有學者開始關注利用微生物發酵法來生產木糖醇［5］。有文獻報道，酵母轉化木糖醇的能力最強，產木糖醇的酵母菌主要集中在假絲酵母屬（Candida），如熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）在24 h內可轉化90%以上的木糖產木糖醇［6-7］。

白酒糟成分比較復雜，但以半纖維素物質為主。我國的白酒糟年產量已經達到2 100萬t以上［8］，產量如此龐大的酒糟如果不加合理利用，既會污染環境也會造成資源的浪費。利用酒糟為原料發酵產木糖醇在國外已有相關報道，而在國內則研究甚少［9］。酒糟的成本較低，利用酒糟為原材料發酵生產木糖醇可大大降低木糖醇生產的成本，本研究采用響應面法探究熱帶假絲酵母（C.tropicalis）GIM2.7發酵酒糟水解液生產木糖醇的最佳工藝條件，以期降低生產成本，提高木糖醇的轉化率。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原材料和菌種

酒糟：太原某酒廠。

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）GIM2.7：廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2培養基

斜面培養基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO42 g/L，pH自然，115℃滅菌15 min。

液體種子培養基：木糖10 g/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO42 g/L，pH自然，115℃滅菌15 min。

發酵培養基：每100 mL酒糟水解液（含木糖約36 g/L）補加5 mL有機氮源溶液（其中酵母膏和蛋白胨質量濃度均為50 g/L），起始pH 5.0，115℃滅菌15 min。

1.2儀器與設備

UV-5200紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HZQ-X100立式搖床：常州杰博森儀器有限公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠；PHS-25C數顯酸度計：上海宇隆儀器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1酒糟水解液的制備

稱取一定量烘干后的白酒糟，粉碎至60目，按1∶10（g∶mL）的料比加入2%的混合酸（濃磷酸和濃鹽酸各1%），浸泡過夜，121℃水解2.5 h，過濾除去酒糟殘渣，于70℃真空適當濃縮后，以2.5%的比例加入活性炭脫毒60min。使用活性炭脫毒可以有效除去水解液中的糠醛和酚類化合物等發酵抑制物，提高發酵性能［10］。得到的水解液用過量的石灰乳中和（pH 10.0），再用濃磷酸回調至pH 5.0，抽濾，于4℃冷藏備用。

1.3.2種子液制備

將凍干熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）GIM2.7轉接至斜面培養基，30℃活化36 h，然后挑取斜面菌種3環，接種至裝液量為100 mL/250 mL的液體種子培養基中，于30℃，180 r/min的搖床上培養24 h。

1.3.3酒糟水解液發酵生產木糖醇

取10 mL種子液接種至裝液量為100 mL/250 mL的發酵培養基中，于30℃搖床發酵48 h［11-12］（其中0～24 h轉速為180 r/min，24～48 h轉速為120 r/min），發酵過程不做任何處理。發酵結束后，取適量發酵液于3 000 r/min離心10 min，收集上清液，待分析木糖醇、木糖含量。

1.3.4木糖醇轉化率的測定方法

木糖含量測定采用地衣酚法［13］，并繪制木糖標準曲線方程：y=0.049 1x+0.035 6（R2=0.993 1）。根據木糖標準曲線方程，計算發酵液中木糖含量。

木糖醇含量測定采用變色酸法［14］，并繪制木糖醇標準曲線方程：y=0.088 8x+0.015 2（R2=0.993 1）。根據木糖醇標準曲線方程，計算發酵液中木糖醇含量。

木糖醇轉化率的計算公式如下：

1.3.5單因素試驗設計

以木糖醇轉化率為評價指標，研究酒糟水解液接種量（5%、10%、15%、20%、25%）、裝液量（60mL/250mL、80mL/250mL、100mL/250mL、120mL/250mL、140mL/250mL）、氮源添加量（0、3%、5%、7%、9%）、初始pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）對發酵效果的影響。

1.3.6響應面最優試驗設計

根據單因素試驗結果，分別以接種量、裝液量、氮源添加量為主要影響因素，以木糖醇轉化率為響應值，采用Box-Behnken中心組合試驗設計原則進行3因素3水平試驗設計和使用Design Expert 7.0軟件對數據進行分析。響應面試驗因素與水平見表1。

表1　響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1接種量對木糖醇轉化率的影響

接種量對木糖醇轉化率的影響，結果見圖1。

圖1　接種量對木糖醇轉化率的影響Fig.1 Effect of inoculum on the conversion rate of xylitol

由圖1可知，在5%～25%范圍內，隨著接種量的增加，木糖醇轉化率先增后減，當接種量為15%時，木糖醇轉化率達到最大值，為42.9%。這可能是由于酒糟水解液環境復雜，接種量過小（5%～10%），菌體受發酵液中糠醛、乙酸、酚類化合物等發酵抑制物的影響［15］，延長了發酵時間，使木糖醇積累少，轉化率低；但接種量過大（＞15%），大量的木糖和其他營養成分用于菌體生長，發酵產木糖醇少，表現在木糖醇轉化率明顯降低。因此，本試驗選擇接種量為15%。

2.1.2裝液量對木糖醇轉化率的影響

裝液量對木糖醇轉化率的影響，結果見圖2。

由圖2可知，當裝液量為60～100 mL/250 mL時，隨著裝液量的增加，木糖醇轉化率升高，這是因為發酵液中溶氧充足，一方面菌體快速繁殖，木糖主要用于菌體生長，木糖醇代謝相對較慢，另一方面將導致形成的木糖醇再度氧化成木酮糖［16］；當裝液量為100 mL/250 mL時，木糖醇轉化率達到最高值，為46.1%；當裝液量＞100 mL/250 mL時，發酵液中溶氧量下降，導致菌體生長不足，菌體濃度較低，從而影響了木糖醇的積累。因此，本試驗選擇裝液量為100 mL/250 mL。

圖2　裝液量對木糖醇轉化率的影響Fig.2 Effect of liquid volume on the conversion rate of xylitol

2.1.3有機氮源添加量對木糖醇轉化率的影響

有機氮源添加量對木糖醇轉化率的影響，結果見圖3。

圖3　有機氮源添加量對木糖醇轉化率的影響Fig.3 Effect of organic nitrogen source addition on the conversion rate of xylitol

由圖3可知，當有機氮源添加量為0～5%時，隨著有機氮源添加量的逐漸增加，木糖醇轉化率明顯升高，這主要是因為發酵液中有機氮源添加量過低時，不能滿足菌體大量生長的需求，菌體濃度較低，致使木糖醇轉化率偏低；當有機氮源添加量為5%時，木糖醇轉化率達到最大值，為45.3%；當繼續添加氮源＞5%時，木糖醇轉化率變化不大。因此，從節約成本角度考慮，本試驗選擇有機氮源添加量為5%。

2.1.4初始pH對木糖醇轉化率的影響

初始pH對木糖醇轉化率的影響，結果見圖4。

由圖4可知，當初始pH 4.0時，木糖醇轉化率偏低，這可能是由于發酵液中存在大量未解離的乙酸分子，強烈地抑制了菌體生長和木糖醇的代謝積累［15］；當初始pH值從4.5升至5.5時，木糖醇轉化率先緩慢升高后又緩慢降低，當初始pH 5.0時，木糖醇轉化率達到最大值，為45.1%。木糖醇轉化率隨著初始pH值變化不明顯，可見初始pH值對發酵效果影響較小。因此，固定初始pH值為5.0進行后續試驗。

圖4　初始pH對木糖醇轉化率的影響Fig.4 Effect of initial pH on the conversion rate of xylitol

2.2響應面試驗分析

采用響應面試驗對接種量、裝液量和有機氮源添加量進行優化，以木糖醇轉化率（Y）為響應值，響應面試驗設計與結果見表2。回歸模型的方差分析結果見表3。

表2　響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments

針對表2結果，應用Design Expert 7.0軟件進行回歸分析，建立多元二次回歸方程如下：

由表3可知，回歸模型P＜0.000 1，表明該回歸模型達到極顯著水平，說明方程對試驗擬合較好。模型失擬項P=0.552 1＞0.05，不顯著，說明該模型能夠很好地對響應值進行分析和預測。模型復相關系數R2=0.976 7，表示有97.67%的響應值變化可用該模型來解釋，說明試驗可靠性較高，故此模型可以用來估計試驗結果。回歸方程各項方差分析表明，因素A、B、C、A2和B2對木糖醇轉化率的影響均極顯著（P＜0.01），因素AB、AC、BC對木糖醇轉化率影響不顯著P＞0.05）。各因素對木糖醇轉化率的影響依次是B（接種量）＞A（有機氮源添加量）＞C（裝液量）。

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

為進一步直觀分析響應面優化效果，根據回歸模型繪制各因素交互作用對木糖醇轉化率的響應曲面和等高線圖，結果見圖5。響應面及其等高線的形狀可直觀反映各因素間的交互作用對木糖醇轉化率的影響，可明顯看出它們的等高線基本呈圓形，且曲面坡度較平緩，所以交互作用均不顯著［17］，但它們對響應值的交互影響順序為：AC＞AB＞BC。通過對模型方程分析得出酒糟水解液發酵產生木糖醇的最佳工藝條件為：接種量15.77%、有機氮源添加量4.84%、裝液量109.13 mL/250 mL。

圖5　接種量、裝液量和有機氮源添加量交互作用對木糖醇轉化率影響的響應曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum，liquid volume and organic nitrogen source addition on the conversion rate of xylitol

2.3最佳條件的驗證試驗

將得出的最佳工藝條件修正為：接種量16%、有機氮源添加量5%、裝液量109 mL/250 mL，在此條件下，進行3次驗證試驗，木糖醇轉化率的平均值為57.8%，與預測值（60.4%）相接近，說明采用響應面法優化得到的木糖醇發酵條件可信，此模型準確可靠，具有一定實用價值。

3　結論

本研究通過單因素試驗和響應面分析得到熱帶假絲酵母（C.tropicalis）GIM2.7發酵酒糟水解液生產木糖醇的最佳工藝條件為：初始pH5.0、接種量16%、有機氮源添加量5%、裝液量109 mL/250 mL。在此條件下，木糖醇轉化率可達到57.8%，與預測值（60.4%）相接近。結果表明，響應面優化酒糟水解液生產木糖醇的發酵條件是有效的，對提高木糖醇的生產提供了技術支持，并且有利于酒糟的合理利用。

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WANG Hao，LI Yanzhang，LI Ying，ZHAO Liang，SONG Jian，JIA Shifang*
（College of Chemical and Biological Engineering，Taiyuan University of Science and Technology，Taiyuan 030000，China）

The optimum conditions of xylitol fermentation from vinasse hydrolysate byCandida tropicalisGIM2.7 were researched to improve the utilization rate of vinasse resources.On the basis of single factor experiment results，the main factors including inoculum，liquid volume，nitrogen source addition were optimized by response surface methodology.The results showed that in the optimum conditions of inoculum 16%，organic nitrogen source addition 5%，and liquid volume 109 ml/250 ml，the conversion rate of xylitol was up to 57.8%，which was approached with predicted value（60.4%）.Results indicated that it was a very effective method to optimize fermentation conditions of producing xylitol from vinasse hydrolysate by response surface methodology.

vinasse hydrolysate；xylitol；fermentation；Candida tropicalis；response surface methodology

TQ923

0254-5071（2016）06-0113-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.024

2016-03-07

太原科技大學大學生創新創業訓練項目（XJ2015058）；山西省高等學校大學生創新創業訓練項目（SJ2016276）

王浩（1994-），男，本科生，研究方向為生物工程。

賈士芳（1978-），女，副教授，博士，研究方向為作物生理生態、生物能源及天然產物開發利用等。