紅曲色素發酵分批補料工藝研究

顧澄琛，張朝暉，包瑩玲，劉銀蘭，嘉曉勤

（浙江工業大學生物工程學院，浙江杭州310014）

紅曲色素發酵分批補料工藝研究

顧澄琛，張朝暉，包瑩玲，劉銀蘭，嘉曉勤*

（浙江工業大學生物工程學院，浙江杭州310014）

為了提高紅曲菌（Monascus purpureus）FM-4000的紅色素色價，采用優化種齡和接種量的方法，探索了分批補料發酵基質對紅色素色價的影響。結果表明，最佳種齡為6 h二級種子液，接種量10%（V/V），在發酵48 h時補加20 g/L黃豆粉，在發酵84 h時補加0.5 mol/L氨水，在發酵96 h時補加60 g/L米粉。在此工藝條件下，搖瓶發酵紅曲菌FM-4000的紅色素色價達到135.61 U/mL，相對初始搖瓶紅曲菌FM-4000的紅色素色價提高了37.25%；在5 L發酵罐中對紅曲菌FM-4000進行分批補料發酵培養，紅色素色價可達145 U/mL。

紅曲菌；紅色素；分批補料發酵

紅曲色素是紅曲菌（Monascus）代謝過程中產生的一系列聚酮類化合物，其特點是色澤鮮艷、耐熱性強、安全性高等［1］。隨著人們對食品安全問題的日益重視，天然色素正受到人們越來越多的關注。目前對紅曲色素的固態發酵有大量的報道［2-3］。而液態發酵有利于擴大化、自動化生產，并且發酵時間短、生產消耗少、產品純度高，因此液態發酵紅曲色素成為近年來的研究熱點［4-5］。但目前對液態發酵紅曲色素的補料工藝研究甚少［6］，邱鵬等［7］通過單因素試驗對紅曲菌發酵條件進行了優化，付榮霞等［8］利用正交試驗設計，研究不同碳源、氮源、pH、裝液量對紅曲霉色價及菌體干質量的影響。分批補料發酵能使營養物質在某個階段維持在一定濃度，既可保證發酵過程中基質的供給，又可以有效地在消除某些基質對產物合成所產生的阻遏或抑制效應，因此更有利于菌體生長和產物合成［9］。本研究對實驗室保藏的紅曲菌（Monascus purpureus）FM-4000液態發酵的種齡及接種量進行了優化，研究其補料發酵的合適條件，并在搖瓶發酵的基礎上進行5 L發酵罐中紅曲菌（M.purpureus）FM-4000分批補料發酵擴大培養，以期提高液態發酵紅曲色素產量及色價。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實驗菌株

紅曲菌（Monascus purpureus）FM-4000：浙江工業大學紅曲研究所提供。

1.1.2培養基

種子培養基：淀粉30 g/L，NaNO32 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，黃豆粉10 g/L，玉米漿1%（V/V），pH自然，121℃滅菌30 min。

發酵培養基：米粉60 g/L，黃豆粉20 g/L，NaNO32 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，乳酸調節pH 4～5，滅菌前加入消泡劑（泡敵）1‰（V/V），121℃滅菌30 min。

1.1.3化學試劑

可溶性淀粉：南京化學試劑有限公司；NaNO3：上海化專實驗二廠；KH2PO4：浙江中星化工試劑有限公司；MgSO4·7H2O：上海四赫維化工有限公司；乳酸：浙江中星化工試劑有限公司；乙醇：天津科密歐化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；SW-CJ-6型超凈工作臺：上海錦昱科學儀器有限公司；YP202N型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；721型可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；ZHWY-2102恒溫搖床：上海智城分析儀器制造公司；PB-10型pH計：德國Sartorius公司；BIOSTATRB型5L發酵罐：德國Sartorius公司。

1.3方法

1.3.1培養方法

斜面培養：將保藏菌種轉接至新鮮的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）試管，30℃恒溫培養7 d。

種子培養：用無菌水洗下斜面上的菌體，制備孢子懸液。取孢子懸液5 mL接至裝液量為100 mL/250 mL的種子培養基中，30℃、180 r/min培養48 h得到一級種子液。將一級種子液按10%（V/V）的接種量接種至裝液量為100mL/250mL的種子培養基中，30℃、180 r/min培養24 h，得到二級種子液。

發酵培養：將二級種子液按8%（V/V）的接種量接種至裝液量為100 mL/250 mL的發酵培養基中，30℃、180 r/min培養168 h。定時取樣測定相關參數，測定結果為3個平行樣的平均值。

1.3.2生物量的測定方法

生物量的測定采用濕重法。取2mL發酵液，12 000 r/min離心15min，取沉淀，加入1mL去離子水，混勻后12 000 r/min離心5 min，除去上清，稱質量。

1.3.3色價的測定方法

胞外紅色素色價測定方法：取2mL發酵液，12 000 r/min離心15 min，取上清；上清稀釋至適當倍數，用721分光光度計在波長505 nm處測定吸光度值OD505nm。胞外紅色素色價值的計算公式如下：

胞內紅色素色價測定方法：取2mL發酵液，12000r/min離心15min，取沉淀；加入1mL體積分數為70%乙醇，混勻，超聲10 min，靜置30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清；上清液稀釋至適當倍數，用721分光光度計在波長505nm處測定吸光度值OD505nm。胞內紅色素色價值的計算公式如下：

總色價=胞外紅色素色價+胞內紅色素色價

1.3.4紅曲菌發酵液中總糖的測定方法

參照武發菊等［10］的3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法。

2　結果與分析

2.1二級種子種齡的優化

研究不同種齡的二級種子液對色素色價的影響，顯微鏡下觀察不同種齡菌落及菌絲生長狀態，結果如表1所示。由表1可知，二級種子培養6 h時，發酵液中菌絲短而粗壯，呈致密的網狀結構，菌落呈絮狀，致密，生長快（見圖1）；隨著二級種子種齡增加，菌體開始結成小球，導致菌球內部傳質、傳氧發生困難，難以到達菌球中心，形成中空型菌球，影響菌體的正常代謝及目標產物的合成，最終導致色素積累受到抑制。色價變化情況見圖2。由圖2可知，二級種子種齡為6 h時，色價最高，達到85.11 U/mL。因此，采用二級種子種齡6 h為宜。

表1　不同種齡二級種子菌落及菌絲形態Table1 Colony and mycelial morphology of the secondary seed of different inoculum ages

圖1　二級種子培養6 h后菌落和菌絲形態Fig.1 Colony and mycelial morphology of secondary seed after culture 6 h

圖2　不同種齡對發酵液總色價的影響Fig.2 Effect of different inoculum ages on total color value of fermentation broth

2.2接種量的優化

菌株在發酵液中的生長速度受接種量影響較大。研究發酵液中不同接種量對色價的影響，結果如圖3所示。由圖3可知，起初紅色素色價隨著接種量的增加而增加，當接種量達到10%時，紅色素色價達到最高，為115.67 U/mL；但是當接種量為11%時，發酵液色價相對低。這可能因為一方面隨著接種量增加，相應種子液中水解酶類增加，基質利用率增加；另一方面菌株迅速占據培養環境，形成優勢菌，雜菌生長機會下降，這兩方面共同導致色價逐漸增加；但是當接種量過大時，菌絲生長過快，造成溶氧不足，細胞快速衰老影響色價。因此，采用10%的接種量比較合適。

圖3　不同接種量對發酵液總色價的影響Fig.3 Effect of different inoculum on total color value of fermentation broth

2.3碳源補加量對總色價的影響

殘糖量在24 h后下降速率較快，當發酵進行到96 h時，發酵液殘糖量幾乎降為0，殘糖變化情況如圖4所示。為了保持發酵的繼續，以不同質量濃度的大米粉為碳源，在96 h補加碳源，補加后發酵液最終色價情況如圖5所示。

圖4　發酵時間與殘糖量的關系Fig.4 Relationship between fermentation time and residual sugar content

圖5　補加不同質量濃度米粉對總色價和殘糖量的影響Fig.5 Effect of different rice flour concentration on total color value and residual sugar concentration

由圖5可知，隨著補加米粉質量濃度的增加，色價逐漸升高，但是，當補加米粉質量濃度達到80 g/L時，色價降低。這可能是過高米粉質量濃度對菌體生長產生了抑制作用，影響色素積累。因此，選擇在發酵96 h時補加60 g/L的米粉溶液，此時色價達到130.60 U/mL，殘糖量為4.15 mg/mL。

2.4氮源補加量對總色價的影響

發酵過程中，菌體生長與氮源含量有很大關系。通過補加氮源，補充菌體發酵過程對氮源的消耗，提高色價。發酵過程中色價、pH、菌體濕質量變化曲線見圖6。

圖6　發酵過程中總色價、pH、菌體濕質量變化曲線Fig.6 Variation curve of total color value，pH and wet mass during fermentation

由圖6可知，0～12 h菌體生長緩慢，屬于菌體生長的遲滯期，色素生成量較少，pH為6.5左右；12～48 h菌體量迅速增長，達到0.73 g/mL，色素生成量增加；48～84 h階段，是色素生成的黃金時期，菌體量相對穩定在0.83g/mL。84～120 h，菌體生長呈現衰退，菌體量下降，色價依然緩慢上升，在發酵96 h時色價達到115.80 U/mL，此后色價下降，這與菌體開始出現自溶，產色素能力下降有關。

在發酵48 h時分別補加不同氮源（質量濃度為2 g/L），探究快速生長期補加氮源對色價的影響，結果見圖7。

圖7　不同氮源對總色價的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on total color value

由圖7可知，使用無機氮源（NaNO3、氨水）后色價較低，分別是85.40 U/mL，60.61 U/mL；而使用有機類氮源（黃豆粉、牛肉膏、蛋白胨）后，色價分別達到120.51 U/mL、123.06 U/mL和115.90 U/mL。這與有機氮源中含有的生長因子和一些無機鹽極大地促進了菌絲體生長量［11］，從而促進色素發酵過程的積累［12-14］有關，考慮到實際生產中的成本問題，選擇黃豆粉作為補加氮源。

考察黃豆粉的添加量對總色價影響，結果見圖8。由圖8可知，在紅曲菌（Monascus purpureus）FM4000發酵液中色價隨黃豆粉質量濃度增加而上升，在黃豆粉質量濃度為20 g/L時，色價達到最高，為123.80 U/mL。但當補加黃豆粉質量濃度＞20 g/L后，發酵液中菌體生物量繼續增加，但色價卻沒有隨之增加，反而降低。產生這種現象的原因可能是培養基中黃豆粉質量濃度過高導致了發酵液氮源十分充足，被大量用于生產菌體，而抑制了次級代謝產物的生成。因此，在發酵48 h時添加20 g/L黃豆粉。

圖8　黃豆粉添加量對總色價及菌體濕質量的影響Fig.8 Effect of soybean powder addition on total color value and biomass

2.5氨水補加量對總色價的影響

在84～120 h菌體生長進入衰亡期，此時pH在5.5～4.5時，接近發酵終點。此時根據紅曲色素代謝途徑中存在的加氨反應，在發酵84 h時通過補加氨水，促進橙色素向紅色素轉化。研究不同氨水濃度對色價的影響，結果見圖9。

圖9　不同濃度氨水對總色價及菌體濕質量的影響Fig.9 Effect of different ammonia concentration on total color value and biomass

由圖9可知，氨水補加濃度為0.5 mol/L時，發酵液色價達到最高，為135.61 U/mL，相對初始搖瓶紅曲霉色素色價提高了37.25%；而過高濃度的氨水導致菌體分解，從而抑制了紅色素的生成。因此，在發酵84h補加0.5mol/L氨水溶液。

2.6發酵罐補料分批發酵

圖10　紅曲菌FM-4000在5 L發酵罐分批補料發酵過程中pH（A）、生物量（B）、殘糖量（C）及總色價（D）的變化Fig.10 Changes of pH（A），biomass（B），residue sugar content（C）and total color value（D）duringM.purpureus FM-4000 fed-batch fermentation in 5 L fermenter

綜合上述優化后條件，進行5 L發酵罐補料驗證試驗。控制參數為：0～24h，轉速300r/min，調節通氣量為0.5vvm；24～84h，轉速500r/min，條件通氣量為0.7vvm；84～132h，轉速400r/min，調節通氣量為0.3vvm。分別在24h補加20g/L黃豆粉溶液，在132 h補加0.5 mol/L氨水溶液，發酵84 h、120 h分別補加60 g/L米粉溶液，每隔12 h取樣檢測發酵液的pH、菌體濕質量、殘糖量及總色價，發酵過程曲線如圖10所示。

由圖10可知，在24 h補加有機氮源黃豆粉，同時，殘糖量下降較快，這與紅曲菌（M.purpureus）FM-4000處于快速生產期，代謝旺盛有很大關系。在發酵84 h、120 h時，發酵液中殘糖含量很低，因此在84 h、120 h處補加米粉。在132 h補加氨水溶液，色素最終產量達到145 U/mL。

3　結論

在搖瓶中優化產紅色素紅曲菌M.purpureusFM-4000二級種子的培養時間、接種量，并探索補加碳源、補加氮源對總色價的影響。結果表明：以6 h培養二級種子，10%（V/V）接種量，在48 h時補加20 g/L黃豆粉，在84 h補加0.5 mol/L氨水，96 h補加60 g/L米粉溶液，搖瓶發酵紅色素的色價達到135.61 U/mL，相對初始搖瓶色素色價提高了37.25%；在搖瓶培養的基礎上，在5 L發酵罐中對M.purpureusFM-4000進行分批補料［15-16］發酵培養，紅色素色價可達145 U/mL。

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GU Chengchen，ZHANG Zhaohui，BAO Yingling，LIU Yinlan，JIA Xiaoqin*
（College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

In order to improve the color value of red pigment produced byMonascus purpureus，the inoculum age and inoculum were optimized，and the effect of fed-batch fermentation substrate on the color value of red pigment was researched.Results showed that the optimum conditions were inoculum age 6 h，inoculum 10%（V/V），feeding 20 g/L soybean meal at fermentation 48 h，0.5 mol/L aqueous ammonia at 84 h and 60 g/L rice flour at 96 h.Under the conditions，the color value of red pigment produced byM.purpureusFM-4000 in shake flask fermentation was up to 135.61 U/ml，which was 37.25%higher than that before optimization.The color value of red pigment was up to 145 U/ml afterM.purpureusFM-4000 fed-batch fermentation in 5 L fermentor.

Monascus purpureus；red pigment；fed-batch fermentation

TQ92

0254-5071（2016）06-0133-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.028

2016-05-03

國家文物局指南針計劃項目（No.20130306）

顧澄琛（1989-），女，碩士研究生，研究方向為發酵工程。

嘉曉勤（1972-），男，副教授，博士，研究方向為微生物分子生物學和微生物發酵工程。