贛江南昌段豐水期細菌群落特征

王 鵬,陳 波,李傳瓊,李 燕

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贛江南昌段豐水期細菌群落特征

王 鵬1,2*,陳 波1,2,李傳瓊1,2,李 燕1,2

(1.江西師范大學鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點實驗室,江西 南昌 330022；2.江西師范大學地理與環境學院,江西 南昌 330022)

細菌群落是河流生態系統的重要組成部分,本次研究基于高通量測序技術分析了贛江南昌段豐水期(4~8月)細菌群落特征.結果表明,贛江南昌段細菌優勢類群為放線菌門(Actinobacteria,41.18%)和變形菌門(Proteobacteria,31.79%),其次為厚壁菌門(Firmicutes,10.04%),擬桿菌門(,7.26%),藍藻菌門(,4.01%).在屬分類水平上,相對豐度最高的是(16.39%).贛江南昌段細菌豐度和多樣性在城區上游、城區中心和城區下游采樣點間沒有顯著差別,在不同月份有顯著差別.除變形菌門(Proteobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)外,其它門水平分類細菌相對豐度在不同月份都有顯著差異;不同采樣點中,只有Proteobacteria差異顯著(主要是Betaproteobacteria差異顯著),其它門水平分類細菌相對豐度在不同采樣點的差異均不顯著.溫度和流量是影響河流細菌群落的主要因子,其中溫度與細菌可操作分類單元(OTU)相關性更高,流量則與門分類水平細菌相關性更高,暴雨徑流中Firmicutes取代Actinobacteria和Proteobacteria成為豐度最高的菌群.溫度、流量和電導率(EC)是影響OTU的最佳環境因子組合,流量和溫度是影響門水平細菌群落的最佳環境因子組合.河水化學指標對細菌群落的影響小于溫度、流量等水文氣象條件.

贛江南昌段；高通量測序；細菌群落結構；環境影響因子

河流是人類工農業用水和生活用水的主要來源,同時也是水循環和碳、氮、磷等元素循環的重要環節[1].細菌群落是河流生態系統的重要組成部分,在河流污染物降解和轉化中起著關鍵作用[2].掌握細菌群落結構特征及其影響因素,有助于理解河流的生態功能及其與環境因子的關系.近年來分子生物學得到快速發展,尤其是低成本、自動化的高通量測序技術[3-4],能同時對樣品中的優勢物種、稀有物種及一些未知的物種進行檢測,快速準確獲得樣品中的微生物群落組成,在河流[5-8]、湖泊水庫[9-11]和海洋[12]等水體細菌群落結構研究中得到廣泛應用.

贛江是鄱陽湖的第一大支流,長江的重要支流.目前針對贛江水環境的研究主要包括非點源污染負荷[13],重金屬分布[14],營養鹽濃度[15-16]、懸浮有機質來源[17]和土地利用對水質的影響[18],但未有微生物群落的相關研究,尚不清楚贛江水體的微生物群落特征及其與環境因子的關系.贛江南昌段位于贛江下游,是鄱陽湖水體的直接補給來源,也是南昌市的主要飲用水水源.本次研究基于高通量測序技術,在豐水期對贛江南昌段進行連續采樣,分析細菌群落特征及其與環境因子的關系,以期為鄱陽湖和贛江流域的環境監測和污染防治提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 樣品采集與水化學分析

贛江進入南昌城區后逐漸分為三支,分別為南支、中支和北支,然后注入鄱陽湖(圖 1).其中贛江南支環繞老城區及高新開發區,北支流經部分新城區和城郊農業區,中支主要流經城郊農業區.本次采樣點分別位于贛江進入南昌城區前(G1),城區分支前(G2),流出城區后的贛江南支(G3),贛江中支(G4)和贛江北支(G5).

受東亞季風氣候影響,4月、5月和6月降水量占全年降水量的45%,7月和8月受臺風影響贛江流域降水也較多.選擇降水較多,溫度也較高的4~8月作為研究月份;良好的水熱條件有助于細菌的生長.分別在2015年4月、5月、6月、7月和8月中旬在河中心取50cm深度水樣,利用便攜式電導率儀(哈納HI98360)現場測量水體電導率(EC).用于水化學分析的水樣采集250ml,用于高通量測序的水樣采集3L.水樣采集后冷藏運回實驗室進一步分析.氨態氮(NH4+-N),硝態氮(NO3－-N)和總磷(TP)利用全自動間斷化學分析儀(SmartChem 200)測定,其中用于NH4+-N和NO3－-N測定的水樣通過0.45μm孔徑濾膜過濾.用于高通量測序的水樣先通過5μm孔徑濾膜過濾去除顆粒雜質,再通過0.22μm孔徑濾膜過濾.將過濾后的0.22μm孔徑濾膜放入-80℃冰箱保存,進行后續DNA提取.

1.2 DNA提取與高通量測序

采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)提取基因組DNA,采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA.對16S rRNA基因的V3-V4高變區片段進行PCR擴增,引物序列[19]為338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA- 3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3').擴增條件為:95℃預變性2min,接著進行25個循環,包括95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s;循環結束后72℃最終延伸5min.每個樣本3個重復,將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物, Tris_HCl洗脫;2%瓊脂糖電泳檢測.參照電泳初步定量結果,將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量,按照每個樣本的測序量要求,進行相應比例的混合.測序在上海美吉生物醫藥科技有限公司的Illumina Miseq PE300平臺進行.

1.3 統計分析

利用Mothur(V.1.36.1)對原始DNA序列進行過濾處理,去除嵌合體,得到優化序列;按照97%相似性將優化序列劃分可操作分類單元(OTU, Operational Taxonomic Units);基于OTU進行稀釋性曲線分析,并計算覆蓋度(Coverage)、Chao1豐度指數和Simpson多樣性指數,利用方差分析對比不同月份、不同采樣點的細菌群落豐度與多樣性.利用Mothur(V.1.36.1)計算采樣點細菌群落的Bray-Curtis距離矩陣,R語言vegan軟件包做非度量多維尺度(NMDS)分析和作圖.對比Silva (Release119, http://www.arb-silva.de)16S rRNA數據庫,采用RDP Classifier (http://rdp.cme.msu. edu/)貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學分析,并在各個分類水平上統計每個樣品的群落組成;利用方差分析對比不同月份、不同采樣點門分類和屬分類細菌豐度差異.基于R語言vegan軟件包BioEnv程序判斷不同環境因子組合對微生物群落(OTU組成和門分類群落)的影響,通過冗余分析(RDA)研究環境因子與細菌門分類群落的關系.

2 結果

2.1 細菌群落豐度與多樣性

25個水樣的高通量測序共得到618 245條高質量基因序列,以97%相似度劃分,得到811條OTUs,單個水樣的OTU數量為343~562,平均值為472.表1為樣品中的OTU數量、多樣性指數以及相應環境因子.各樣本文庫的覆蓋率(Coverage)范圍均在99.3%以上,能夠代表贛江水體細菌群落的真實情況.

表1 水樣細菌群落的豐度、多樣性以及環境因子 Table 1 Bacterial community abundance, diversity and environmental factors in the Ganjiang River

采樣編號aOTUChao1CoverageShannonEC(μS/cm)NH4+-N(mg/L)TP(mg/L)DOC(mg/L)流量b(m3/s)氣溫c(℃) G5_75536220.99614.6964.50.290.0123.42 G1_84705600.99604.3871.50.320.0451.65136028.5 G2_84655280.99714.3671.30.300.0292.22 G3_84715570.99644.5298.70.620.1193.51 G4_83434390.99633.4077.10.280.0373.22 G5_84335260.99484.0973.90.380.0452.87

注:a采樣點G_,G為采樣點位置(=1,2,3,4,5),為采樣月份(=4,5,6,7,8);b采樣當日贛江外洲站早8:00流量,數據來源:http://www.jxncsw.com/list.jsp?classid=19;c采樣當日的日平均氣溫.

Chao1指數的平均值為554,最大值出現在5月的G2采樣點(657),最小值出現在4月的G3采樣點(434);Shannon指數的平均值為4.23,最大值出現在6月的G3采樣點(4.70),最小值出現在5月的G1采樣點(3.01).單因素方差分析表明不同采樣點Chao1指數和Shannon指數不存在顯著差異(值分別為0.899和0.548);不同月份的Chao1指數和Shannon指數差異性顯著(值分別為0.001和0.006),Chao1指數的大小順序為:7月>5月>6月>8月>4月,Shannon指數的大小順序為7月>6月>4月>8月>5月.

NMDS分析(圖2)表明,相同月份的采樣點具有類似的細菌群落結構,不同采樣點細菌群落沒有明顯的差異;不同月份之間,6月和7月細菌種群結構較為類似,而4月、5月和8月差異較大.

2.2 細菌群落結構

25個贛江水樣高通量分析得到的811條OTUs中,在門、綱、目、科、屬和種分類水平上未能進行分類的OTU比例分別為0.74%,1.73%, 4.44%,8.26%,13.81%和44.88%,表明在種分類水平上贛江水體存在大量未知類型細菌.各分類水平上符合分類要求的OTU分屬于26個門,49個綱,75個目,123個科,166個屬,149個種.圖 3為門水平上的細菌分類.相對豐度最高的是放線菌門(Actinobacteria,41.18%),其次為變形菌門(Proteobacteria,31.79%),兩者占總基因序列的比例達到了72.97%.Actinobacteria中豐度最高的是放線菌綱(Actinobacteria,31.19%),其次為酸微菌綱(Acidimicrobiia,9.49%),另外還含有少量的嗜熱油菌綱(Thermoleophilia,0.50%).Proteobacteria中豐度最高的是β-變形菌綱(Betaproteobacteria,23.07%),其次為α-變形菌綱(Alphaproteobacteria,5.19%),γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria,2.08%),δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria,1.01%)和ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria,0.21%).厚壁菌門(Firmicutes,10.04%)是平均豐度第三高的類群,但只在5月份的相對豐度很高(18.26%~66.57%),其它月份的相對豐度都在5%以下.此外,相對豐度較高的依次為擬桿菌門(Bacteroidetes,7.26%),藍藻菌門(Cyanobacteria,4.01%),疣微菌門(Verrucomicrobia,1.01%),浮霉菌門(Planctomycetes,0.93%),綠彎菌門(Chloroflexi,0.88%),綠菌門(Chlorobi,0.84%),芽單胞菌門(Gemmatimonadetes,0.79%)和酸桿菌門(Acidobacteria,0.55%).其它門類別的平均相對豐度均小于0.5%.

圖 4為細菌群落的屬水平分類,將平均豐度低于1%的部分合并為others在圖中顯示,剩余17種屬水平分類中有2種屬于分類學數據庫分類學譜系的中間等級,沒有科學名稱,以作為標記;1種細菌屬于未培養細菌,以表示.根據置信度閾值的篩選,2種細菌在屬分類級別分值較低,在統計時以標記.相對豐度最高的是中的(16.39%),其次為中的CL500-29__(8.48%),中的乳球菌屬(,7.89%)排在第3位,但豐度只是在5月較高(14.90%~ 52.36%),其它月份的豐度均在4%以下.

表2為25個水樣中門水平分類細菌相對豐度統計量.根據變差系數判斷,Firmicutes, Chlorobi和Cyanobacteria的動態變化最大, Proteobacteria,Actinobacteria和Verrucomicrobia的動態變化最小.單因素方差分析表明,多數門水平分類細菌相對豐度在不同月份有顯著差異(<0.05),只有Proteobacteria(=0.337)和Verrucomicrobia(=0.795)差異不顯著; Proteobacteria中在不同月份差異不顯著的為Betaproteobacteria(=0.533)和Epsilonproteobacteria(=0.680).在G1-G5不同采樣點中,只有Proteobacteria(=0.037)差異顯著,其它門水平分類細菌相對豐度在不同采樣點的差異均不顯著(>0.05).Proteobacteria在5個采樣點的大小順序為:G3>G1>G2>G5>G4.在Proteobacteria中只有Betaproteobacteria(=0.024)在不同采樣點差異顯著,在5個采樣點的大小順序同樣為:G3> G1>G2>G5>G4.

在屬水平分類上,對平均豐度大于1%的屬分類細菌進行單因素方差分析(文中未給出數據列表),結果表明多數屬分類細菌相對豐度在不同月份有顯著差異(<0.05),只有(=0.083)、(= 0.199)、(=0.230)和(=0.217)差異不顯著;絕大多數細菌相對豐度在不同地點沒有顯著差異(>0.05),只有(=0.006)有顯著差異.

表2 贛江南昌段主要門水平分類細菌相對豐度統計量及月份、采樣點差異顯著性 Table 2 Statistics of Relative abundance of main bacterial phyla in Nanchang section of Ganjiang River and the significance of difference between months and sites

2.3 細菌群落結構與環境因子關系

表3為不同環境因子組合對細菌群落結構的影響.OTU是細菌分類的最小基本單元,門分類則是細菌分類中最大的分類單元.在不同分類尺度上環境因子對細菌群落結構的影響不同,溫度是影響OTU的最主要環境因子,相關系數為0.6159;溫度、流量和EC是影響OTU的最佳環境因子組合,相關系數為0.7164.流量是影響門分類水平細菌的最主要環境因子,相關系數為0.6379;流量和溫度是影響門水平細菌群落的最佳環境因子組合,相關系數為0.6424.因此,溫度和流量是影響贛江細菌群落結構的主要因素;在水化學因子中,體現水體可溶性化合物總量的EC和DOC對OTU的影響較大,而DOC和TP對門分類水平細菌影響較大.化學因子對細菌群落的影響小于溫度、流量等水文氣象條件.

表3 細菌群落與不同環境因子組合的相關關系 Table 3 Correlations between different environmental variables combination and bacterial community

圖5為環境因子對主要門分類種群(平均豐度大于0.5%)的冗余分析結果,第一主軸解釋了門分類群落63.35%的方差變化,第一主軸和第二主軸一共解釋了69.88%;其中流量對門分類種群變化的顯著性最高(=0.002),其次為溫度(= 0.004),TP(=0.012)和DOC(=0.05);EC和 NH4+-N的影響顯著性值大于0.05,所以流量、溫度、TP和DOC是影響主要門分類種群顯著環境因子.除Firmicutes和Bacteroidetes外,其它門分類細菌均與溫度呈正相關關系;與流量呈較強正相關性,在5月暴雨徑流中, Firmicutes取代Actinobacteria和Proteobacteria成為豐度最高的菌群;Bacteroidetes與NH4+-N、DOC和EC有較強正相關性.第一大門分類種群Actinobacteria受溫度影響較小,與流量呈較強負相關關系;第二大門分類種群Proteobacteria受各種環境因子的影響相對較小.

3 討論

3.1 細菌群落結構

細菌群落在河流生態系統中起著重要作用,是營養物質的轉化者和能量流動的承擔者[20].贛江南昌段相對豐度最高的是Actinobacteria(41.18%),其次為Proteobacteria(31.79%,其中Betaproteobacteria相對豐度為23.07%),(10.04%)和Bacteroidetes(7.26%).國內外研究(表4)表明, Actinobacteria, Proteobacteria和Bacteroidetes是河水中的優勢細菌門類;Read等[8]在英國泰晤士河的研究表明,河水細菌的最大門類群由上游的Bacteroidetes和Proteobacteria逐漸轉變為下游的Actinobacteria,并認為這種細菌群落結構的變化是由河流水流特性引起的,即體型更小的Actinobacteria細菌不易被捕食,在水體滯留時間更長的河流下游逐漸成為優勢類型;Savio等[21]在多瑙河和Kolmakova等[22]在葉尼塞河的研究也得到了類似結論.本次研究區位于贛江下游,Actinobacteria為相對豐度最高的門分類群落,與以上研究成果相符;但Bacteroidetes的豐度位于Firmicutes之后,這主要是由于5月Firmicutes的相對豐度較高;如果不考慮5月數據,Bacteroidetes為位于Actinobacteria和Proteobacteria之后的第三大門分類細菌.Jeon等[23]研究發現,沙塵細菌的優勢群落為Firmicutes(53%)和Actinobacteria(18%);5月采樣時,受前期全流域暴雨影響,贛江流量明顯升高(表1),細菌群落與其它月份有顯著區別,優勢群落為Firmicutes(43.38%)和Actinobacteria(21.42%),與Jeon等[23]研究中的沙塵細菌非常類似,可以推測暴雨將大量地表沙塵帶入河流,沙塵細菌的加入導致贛江5月Firmicutes的相對豐度明顯偏高.

表4 國內外河流基于16S rRNA方法的細菌群落及影響因子研究結果 Table 4 Bacteria communities and the influencing factors in domestic and oversea rivers based on 16S rRNA

注:——表示文獻中未進行細菌群落影響因子的研究.

方差分析結果表明,分別位于城區上游,城區中心和城區下游的5個采樣點細菌群落豐度與多樣性不存在顯著差別,除Proteobacteria以外的其它門分類菌群也不存在顯著差別(表 2).這表明南昌城區污水排放沒有明顯影響贛江河水的細菌群落結構.Vannote等[30]提出了河流連續體概念,認為河流生態群落能夠改變自己的結構和功能牲,使之適應具有連續梯度的非生物環境.本次研究區上、下游河流長度約為80km,較短的距離使各采樣點間的生物多樣性及群落結構差異不顯著. 5個采樣點中具有顯著差別的是Betaproteobacteria,流經更多城區的G3采樣點具有最高豐度的Betaproteobacteria.人類排泄物中Bacteroidetes和Firmicutes是主要的細菌類型[31-32],但Shanks等[33]對13個城市未處理污水的研究發現污水中的主要細菌類型為Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria,并認為城市排水管道不利于Bacteroidetes等排泄物細菌的生存,導致城市污水中排泄物細菌豐度并不高.本次對贛江南昌段的研究中,只有Betaproteobacteria在不同采樣點有顯著區別,且在不同月份沒有顯著區別,說明Betaproteobacteria受上游來水的影響較小,主要受城區污水排放的影響.Betaproteobacteria是淡水細菌群落的主要菌群,與營養物質關系密切[34],經常利用有機物分解產生的氨氣、甲烷等物質[35],富含有機物的城區排水系統可能為Betaproteobacteria提供了有利的生存條件.

3.2 環境影響因子

河流細菌群落受到氣候、水文、營養物質、重金屬污染等眾多環境因子的影響[36],不同河流自然地理條件的差異,以及采樣方案與測試指標的差異使不同研究得到不同的環境影響因子(表 4).局部河段的單次采樣不能反映水文氣象條件變化,只能分析C N P濃度以及pH值等水化學指標對河流細菌群落的影響[6,24,26];Savio等[21]和Kolmakova等[22]對全河段的研究表明,沿河流上游至下游細菌群落結構經常發生規律性的變化,如多樣性降低,優勢菌群豐度變化等,與河水化學指標并沒有顯著關系,而是與河流本身的特性,如河水滯留時間、濕周等因素有關;按不同季節進行多次采樣的研究[7,29]則發現溫度、降水量、河流補給來源等水文氣象因素是河流細菌群落的主要影響因子.本次研究通過贛江南昌段豐水期4月-8月的5次采樣,發現溫度和流量是影響河流細菌群落的主要因子,其中溫度與最小的細菌分類單元OTU相關性更高,流量則與門分類水平細菌相關性更高.溫度影響河流細菌的生長速度[37]和運動能力[38],影響河水中各種細菌的豐度;徑流量的大小體現了河水補給來源和水文特性的改變,引起河水中優勢細菌群落的變化[7-8,21],如5月暴雨徑流水樣中Firmicutes取代Actinobacteria和Proteobacteria成為豐度最高的菌群.化學污染物一般會減小河流細菌群落多樣性,或者導致可利用污染物的某些細菌群落豐度增加[36],目前贛江水質相對較好,化學污染物不是影響細菌群落的主要影響因素.河水的化學指標,包括EC, DOC, TP和NH4+-N對細菌群落的影響小于溫度、流量等水文氣象條件(表3和圖5).

4 結論

4.1 贛江南昌段細菌優勢類群為放線菌門(Actinobacteria,41.18%)和變形菌門(Proteobacteria, 31.79%),其次為厚壁菌門(Firmicutes, 10.04%),擬桿菌門(Bacteroidetes, 7.26%),藍藻菌門(Cyanobacteria,4.01%).在屬分類水平上,相對豐度最高的是(16.39%),其次為CL500-29__(8.48%)和(7.89%).在種分類水平上,贛江水體存在大量未知類型細菌.

4.2 贛江南昌段細菌豐度和多樣性在城區上游、城區中心和城區下游采樣點間沒有顯著差別,在不同月份有顯著差別.絕多數門水平分類細菌相對豐度在不同月份有顯著差異,只有Proteobacteria和Verrucomicrobia差異不顯著;不同采樣點中,只有Proteobacteria差異顯著(主要是Betaproteobacteria差異顯著),其它門水平分類細菌相對豐度在不同采樣點的差異均不顯著.

4.3 溫度和流量是河流細菌群落的主要影響因子,其中溫度與OTU相關性更高,流量則與門分類水平細菌群落相關性更高,暴雨徑流中Firmicutes取代Actinobacteria和Proteobacteria成為豐度最高的菌群.溫度、流量和EC是影響OTU的最佳環境因子組合;流量和溫度是影響門水平細菌群落的最佳環境因子組合.河水的化學指標對細菌群落的影響小于水文氣象條件.

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* 責任作者, 副教授, wangpengjlu@outlook.com

Bacterial communities in Nanchang section of the Ganjiang River in wet seaon

WANG Peng1,2*, CHEN bo1,2, LI Chuang-qiong1,2, LI Yan1,2

(1.Key Laboratory of Poyang Lake Wetland and Watershed Research, Ministry of Education, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China；2.School of Geography and Environment, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)., 2016,36(8)：2453~2462

Bacteria are key players in the ecosystem of rivers. In this study, bacterial communities in Nanchang section of the Ganjiang River in wet season (April to Auguest) were analyzed. The results showed that the dominant phyla were Actinobacteria (41.18%) andProteobacteria (31.79%), followed by Firmicutes (10.04%), Bacteroidetes (7.26%) and Cyanobacteria(4.01%). The dominant genus was(16.39%). There were no significant differences of the bacterial community abundance and diversity in river water between the upstream, the downtown and the downstream of urban area, while there were significant differences between months. Except for Proteobacteria and Verrucomicrobia, there was significant difference of the bacterial phyla abundance between months. Proteobacteria (mainly Betaproteobacteria) was the only phylum whose abundance showed significant difference between sampling sites. Temperature and streamflow were the main environmental factors influencing bacterial communities in river water, while temperature was more correlated with the bacterial Operational Taxonomic Unit (OTU), and streamflow was more correlated with bacterial phyla communities. Firmicutesbecame the dominant phylum instead of Actinobacteria and Proteobacteria in a stormflow. The optimal subset of environmental variables with the best correlation to OTU abundance included temperature, flow rate and EC, and with the best correlation to phylum abundance included temperature and flow rate. The influence of water chemical parameters on bacterial communities was less than that of hydrometeorological factors including temperature and streamflow.

Nanchang section of the Ganjiang River；high throughput sequencing；bacterial community structure；environmental factors

X172

A

1000-6923(2016)08-2453-10

王 鵬(1982-),男,山東濟寧人,副教授,博士,主要從事鄱陽湖流域水環境研究.發表論文10余篇.

2015-12-11

國家自然科學基金項目(41201033);鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點實驗室(江西師范大學)主任開放基金(ZK2013009);江西省自然科學基金(20151BAB213035);江西省重大生態安全問題監控協同創新中心資助項目(JXS-EW-00)