復合生物制劑在濃香型白酒黃水酯化中的應用

張　丹，陳雪玲，付　瑜，胡先強，王　濤，游　玲

（1.宜賓學院，生命科學與食品工程學院，固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓644000； 2.宜賓職業技術學院，四川宜賓644003）

復合生物制劑在濃香型白酒黃水酯化中的應用

張丹1，陳雪玲2，付瑜1，胡先強1，王濤1，游玲1

（1.宜賓學院，生命科學與食品工程學院，固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓644000； 2.宜賓職業技術學院，四川宜賓644003）

為探討一種自制酯化生香生物制劑在不同黃水酯化中的應用效果，對宜賓、瀘州兩地5家企業139口濃香型白酒窖池所產黃水進行窖外酯化，分別檢測酯化前后黃水中主要有機酸、酯含量變化，發現不同企業黃水理化指標及酸、酯含量差異明顯且呈現明顯的企業特性；所有黃水酯化后丁酸乙酯及己酸乙酯含量均大幅上升，但乙酸乙酯、乳酸乙酯含量變化很小，己酸促進黃水酯化的效果顯著，但各種酯的增加量與對應有機酸的原有含量或消耗量之間均無明確關聯。研究結果揭示了黃水中主要有機酸酯化的部分規律，并從統計學角度確證了酯化生香制劑用于黃水窖外發酵生香效果，為后續用于生產提供依據。

濃香型白酒； 黃水； 酯化； 生物制劑

黃水是濃香型白酒窖內發酵過程中產生的液態副產物，其中不僅含有豐富的醇、醛、酸和酯類等濃香型白酒風味（前體）物質，還含有豐富的淀粉、還原糖、酵母自溶物等營養物質及大量經長期馴化的釀造微生物［1］。濃香型白酒發酵是開放式接種的多菌種固態發酵，每批次產品的發酵原料組分、微生物群落及工藝均存在差異，使得不同企業乃至窖池的黃水在理化指標方面存在差異，但行業尚未對此開展較為系統的研究。

目前，黃水主要用于人工窖泥生產、養窖護窖以及利用其中豐富的風味（前體）物質提高原酒品質或生產新型白酒［2］。其中，采用各種技術手段，高效利用其中豐富的風味（前體）物質，是行業應用最廣的一類方式，如早期直接將黃水添加至蒸酒的底鍋水中，利用“串蒸”方式使部分風味物質進入酒體，后由于傳統串蒸效率低下，行業著重從提高黃水中風味物質含量及提取獲得風味物質技術及裝備方面開展了大量工作［3］。雖然添加己酸、乙酸等可以直接化學酯化［4-5］，但化學酯化反應條件較為苛刻，因此實際的做法是，添加窖泥、酒尾、曲粉等發酵1～2個月［6-7］，在此基礎上，陳帥［8-9］、羅惠波［10］、劉賓［11］、劉子紅［12］等先后利用紅曲霉或酵母制成的各種酯化酶粗酶制劑對黃水進行酯化，使黃水中的酯含量大幅上升，用于底鍋串蒸取得了很好的效果。

上述方案均涉及到酯化菌或酯化酶制劑的使用，但均存在各種各樣的問題，如酯化周期過長，酯化效果不穩定，酯化后主要酯類物質比例失調等，且由于黃水理化組成的復雜性和波動性，現有研究未系統開展酯化影響因素及條件的研究，導致現有的市售酯化酶制劑在不同企業的應用效果很不穩定，影響了這一技術的推廣應用。

在前期研究中，從宜賓濃香型白酒產區分離到1株高產酯化酶的紅曲霉菌，以及1株產酯生香的酵母，組成混合菌劑接種到麩皮中培養，得到了一種包括微生物、酶及大量風味物質前體在內的黃水窖外發酵用生物制劑，初步應用發現其酯化力強，在不改變濃香型白酒原有風味特征的前提下，可大幅提升黃水酯含量，為探討黃水理化指標波動對酯化效果的影響，收集了宜賓、瀘州地區5家白酒企業的數百個黃水樣品，使用該生物制劑酯化，希望找到不同企業不同窖池黃水酯化的規律，也為該生物制劑的應用提供技術支撐。

1　材料與方法

1.1生物制劑

酯化生香生物制劑：由本實驗室保存的1株紅曲霉菌及1株畢赤氏酵母加入麩皮混合培養、烘干而成。

1.2黃水

來自宜賓、瀘州濃香型白酒產區5家規模以上濃香型白酒生產企業，分別編號為H、J、T、L、X的139個黃水樣品，每個樣品3個重復。瀘州135個，宜賓312個，酯化前后黃水均12000 r/min離心10 min，0.22 μm過濾后備用。

1.3酯化方案

在250 mL三角瓶中，將200 mL黃水、2 mL己酸、10 g酯化生香生物制劑充分混勻，35℃保溫酯化5 d后，與未酯化的200 mL黃水分別添加100 mL蒸餾水，于200 mbar下，80℃蒸餾出200 mL蒸餾液，備用。

1.4檢測指標

靜置澄清的黃水采用手持糖度計測定可溶性固形物含量，采用滴定法［13］測定酸度，采用電導儀測定電導率，采用pH計測定pH值。蒸餾液采用密度折光儀（梅特勒DM40-RX40）測定其乙醇含量。

采用氣相色譜法測定蒸餾液中4種酯及離心過濾后黃水中乙酸、丁酸、己酸含量［14］，采用C18柱（5 μm，250× 4.6 mm），通過液相色譜法檢測黃水中乳酸含量［15］：流動相：甲醇∶0.01 mol/L（NH4）2HPO4緩沖溶液pH2.8（3∶97，v/v），柱溫28℃，流速0.7 mL/min，波長215 nm。使用純度90%的L-乳酸（sigma）作為標樣。

所得數據采用SPSS 19.0進行顯著性分析。

2　結果與分析

2.1不同企業黃水主要酸酯含量差異

黃水是微生物在糟醅中混菌發酵，并通過糟醅滲濾而匯聚在窖池底部的混合產物，其中包括了幾乎所有的白酒風味物質，分析黃水成分可在很大程度上揭示窖池內微生物的代謝狀況。對來自宜賓的4家濃香型白酒企業（分別編號為H、J、T、X）及瀘州1家白酒企業（編號L）的447個黃水樣品（瀘州135個，宜賓312個）進行了比較分析，發現兩地黃水的理化性質及主體風味物質含量存在差異。

從理化指標來看（圖1），不同企業黃水pH值差異很小，且方差很小，表明不同企業以及同一企業不同窖池的黃水pH值都很接近，這是因為窖池內發酵產物主要是乙酸、己酸、乳酸等弱酸，具有較好緩沖能力，這也為白酒窖池內各種生化反應的進行提供了一個穩定的酸堿體系。但H企業黃水酸度明顯大于其他企業，可能是由于H企業發酵周期超過120 d，窖池內產酸細菌在發酵后期的厭氧環境中產酸較多。

圖1　不同企業黃水主要理化指標

黃水中可溶性固形物及乙醇含量反映了糖化、發酵的深度，從圖1可以看出，各企業黃水這兩個指標雖有差異，但不顯著，可見窖齡、發酵時間等因素對發酵深度無顯著影響。值得注意的是，電導率直接反映了黃水中導電離子的濃度，間接反映了體系中束縛這些導電離子物質的含量，即黃水中有機質、腐殖質等具有緩沖能力的物質越多，游離的導電離子越少，T企業黃水電導率顯著高于H、J、X 3個企業，可能是由于T企業多數窖池生產歷史較短，窖池內可用于螯合導電離子的緩沖物質較少。

從圖2、圖3可以看出，由于不同生產工藝及生產歷史，各企業黃水中主要酸、酯含量有明顯差異。H、T企業黃水中總酯含量較高，主要是由于這2個企業發酵周期較長，都在120 d左右；L企業黃水總酯含量低于其他4個企業，可能是由于L企業多數窖池發酵時間較短，主要通過長周期發酵的“翻沙”窖池產酯，因此L企業窖池黃水酯含量的差異（方差）也較大；H、J、T、X企業窖池黃水中乙酸、乳酸含量較高的，其對應的酯含量也較高，而L企業黃水中的乙酸、己酸、乳酸含量均較高，但其對應酯含量并不高，特別是乳酸乙酯含量還顯著低于H、J、X企業，表明L企業發酵過程中，有機酸的酯化不如其他企業充分，造成這種差異的主要原因仍是L企業窖池發酵周期較短，而多數濃香型白酒企業在生產上也有通過延長發酵時間提高酯含量；對于發酵周期超過70 d的企業來說，H、T企業黃水中的乙酸乙酯含量高于J、X企業，與這些企業黃水中乙酸含量的差異大致吻合，且4個企業不同窖池黃水中己酸、乳酸含量高的，其己酸乙酯、乳酸乙酯含量也相對較高，表明在長時間酯化的情況下，乙酸、己酸、乳酸與對應酯的生成關聯度較大，但丁酸乙酯與丁酸含量沒有顯示出明顯對應關系，表明發酵過程中丁酸可能不是影響丁酸乙酯生成的主要因素。

圖2　不同企業黃水中4種有機酸含量

圖3　不同企業黃水中4種酯含量差異

從各企業不同窖池黃水酯含量差異（方差）來看，生產歷史較短的T企業樣品間主要酯含量差異均最大，J、X企業不同窖池黃水中的丁酸乙酯含量相互間差異超過100%（方差大于平均值），而X企業不同窖池黃水中的丁酸差異很小，表明除丁酸外，還存在影響丁酸乙酯生成的重要因素。L企業不同窖池黃水中的己酸乙酯含量相互差異也超過100%，則可能是由于部分樣品來自“翻沙”窖池，而發酵周期長、生產歷史也在20年以上的H企業窖池黃水中己酸乙酯含量低于T企業正常發酵70 d的新窖池，似乎說明己酸乙酯的生成并不像傳統認為那樣主要依賴于老窖長時間發酵。

2.2酯化對黃水酸酯含量的影響

根據上述分析結果，在各黃水樣品中加入富含酯化酶的復合生物制劑，以及1%己酸，35℃保溫酯化120 h后檢測黃水中主要酸、酯含量，發現乙酸乙酯、乳酸乙酯含量變化不顯著，但丁酸乙酯、己酸乙酯均有大幅提升（圖4），乙酸乙酯、乳酸乙酯并未明顯增加，可能是由于在窖內發酵過程中，乙酸、乳酸已經達到滿足其酯化平衡的最大酯化量，在這種情況下，增加酯化酶很難使對應酯含量增加，計算發現，不同窖池黃水中乙酸的酯化率在2.33%～4.64%之間，而乳酸的酯化率在42.5%～70.4%，造成不同窖池2種酸酯化率波動的因素還包括其他有機酸濃度、溫度、酯化菌等，但一定程度上可以認為多數窖池內的酯化條件足以滿足黃水中乙酸、乳酸的酯化需求。

圖4　酯化對黃水中4種酯含量的影響

對己酸乙酯、丁酸乙酯而言，在外加93 mg/10 mL己酸后，大幅增加了己酸乙酯、丁酸乙酯生成，其中己酸乙酯酯化率由0.33%～1.0%變為0.19%～0.82%，略有下降，但己酸乙酯含量大幅上升，以T企業為例，扣除酯化后增加的己酸及酯化成己酸乙酯的己酸（28 mg/10 mL左右），仍有大部分己酸通過揮發損失或進入其他代謝途徑，如分解為乙酸和丁酸，丁酸又進一步酯化生成丁酸乙酯，導致丁酸乙酯上升幅度甚至超過了己酸乙酯，這也是T企業黃水中乙酸、丁酸、丁酸乙酯含量均上升的原因，但其他企業黃水酯化后丁酸乙酯含量顯著增加，而乙酸、丁酸并未明顯增加，以H企業為例，酯化前后黃水中丁酸的降低量顯然少于新增含量丁酸乙酯所需丁酸，表明丁酸另有重要來源，很可能就是來自于己酸的分解。

同時，己酸的分解也可能導致乙酸含量上升，如酯化后H、L、T企業黃水中乙酸含量明顯上升（圖5），但其乙酸乙酯含量反而略有降低，這可能是由于添加的酯化生香制劑及己酸改變了黃水中原有酯化平衡體系，使乙酸的酯化朝酯分解方向進行。另一方面，H、J、L、T、X企業的丁酸乙酯含量分別提高了119.2倍、64.8倍、730.1倍、41.8倍、242.9倍，己酸乙酯含量分別提高了3.0倍、0.8倍、1.3倍、3.5倍、4.4倍，其提高幅度的差異遠遠超過了各企業丁酸、己酸的含量差異，表明外加酯化酶及己酸放大了黃水本身丁酸乙酯、己酸乙酯含量的差異，且放大的幅度與黃水中丁酸、己酸的含量沒有直接聯系，表明酯化生香制劑對黃水中酯化反應體系的影響非常復雜，黃水窖外發酵需在預實驗的基礎上謹慎開展。

圖5　酯化對黃水中乙酸、丁酸、己酸含量的影響

2.3窖齡對黃水酯化效果的影響

老窖池的黃水風味物質種類更豐富，酯類物質含量也較高，為探討窖齡對酯化效果的影響，研究分析了3個企業窖齡從1年到100年的窖池黃水酯化前后的酸、酯含量變化差異（圖6—圖8）。從圖6可以看出，對T企業而言，隨著窖齡的延長，7年以內窖池黃水中的己酸乙酯、乳酸乙酯呈下降趨勢，但窖齡超過30年，二者均明顯增加，添加酯化生香制劑窖外發酵后，不同窖齡窖池黃水中各種酯的含量差異（方差）也大致維持了酯化前的水平，同時，老窖池黃水中主要有機酸、酯含量相互差異比新窖池小，酯化后仍然如此，表明酯化不能改變新老窖池黃水的差異。

圖6　T企業1年、2年、7年及32年窖池黃水中主要有機酸酯化差異

圖7　H企業10年、20年及30年窖池黃水中主要有機酸酯化差異

圖8　L企業30年及100年窖池黃水中主要有機酸酯化差異

從圖7、圖8可以看出，對H企業10年、20年、30年窖池黃水及L企業30年、100年窖池黃水來說，隨著窖齡增加，不同窖池黃水中乳酸乙酯含量均略有增加，但酯化后乳酸乙酯、乙酸乙酯含量均有所下降，且老窖池黃水下降幅度更大，且老窖池黃水酯化后異味感也更輕，推測可能是由于在黃水中乙酸、乳酸過量的情況下，在酯化生香制劑及己酸的影響下，成分更為復雜的老窖池黃水可與酯化制劑中的風味物質共同作用，使少量乙酸乙酯、乳酸乙酯經其他代謝途徑轉化，減少了單一組分帶來的缺陷味感，酯化后的黃水風味也更自然。

3　結論與討論

黃水的酯化、串蒸一直是廣泛用于白酒生產的產酯生香方法，相關研究成果也較多。從黃水酯化方式來看，陳帥等添加紅曲酶及酵母酯化［9］，羅惠波等添加酵母和酯化酶酯化［10］，劉子紅直接添加紅曲菌酯化［12］，使總酯含量增加7倍以上［9］，己酸乙酯含量最高增加了20倍［12］，上述酯化反應時間最短為20 d以上［9］，有的長達50 d［12］，而本研究使用的自制酯化生香制劑加入黃水中酯化5 d即可取得很好的酯化效果，且僅需添加1%己酸及4%乙醇或8%酒尾，酯化后的黃水仍保持了原有風味，同時，通過對多個企業多個窖池黃水的酯化確證了其酯化效果，并初步得到以下結論：①不同企業黃水采用酯化生香制劑酯化后，其丁酸乙酯及己酸乙酯含量大幅上升，但乙酸乙酯、乳酸乙酯含量變化不大或略有降低；②己酸促進酯化效果顯著，但黃水中影響酯化效果的因素除酯化酶、有機酸外，尚有其他未知的重要因素，導致各種酯的增加量與對應有機酸的原有含量或消耗量之間均無關聯；③酯化不能明顯改變新、老窖池黃水差異，但老窖池黃水酯化后風味更自然。

總體上，雖然不同企業不同窖齡窖池黃水酯化效果略有差異，但這種差異更多來源于黃水本身，采用酯化生香生物制劑處理黃水前，可通過分析黃水中的酸、酯含量，據此設計較適宜的酯化方案（酯化生香生物制劑添加量、己酸添加量等），再通過預實驗進行驗證、優化，最終用于生產，可使酯化生香制劑起到最好的酯化效果。

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Application of a Compound Biological Agent in the Esterification of Yellow Water of Nongxiang Baijiu

ZHANG Dan1，CHEN Xueling2，FU Yu1，HU Xianqiang1，WANG Tao1and YOU Ling1
（1.College of Life Science and Food Engineering，Yibin University，Yibin，Sichuan 644000；2.Yibin Vocational and Technical College，Yibin，Sichuan 644003，China）

In order to evaluate the application effects of a self-made biological agent in the esterification of different yellow water，it was used in out-pit esterification of yellow water from 139 Nongxiang Baijiu pits of 5 distilleries in Luzhou/Yibin.The change in main organic acids content and esters content in yellow water before and after the esterification were detected respectively.There was significant difference in physiochemical indexes，esters content，and acids content of yellow water from different distilleries and such difference represented evident enterprise characteristics.After the esterification，the content of ethyl butyrate and ethyl caproate in yellow water increased greatly，while the content of ethyl acetate and ethyl lactate changed little.Caproate acid promoted the esterification evidently，but there were no correlations between esters formation and acids supply or consumption.The results revealed part of the rules of the esterification of main organic acids in yellow water，statistically confirmed the effects of the biological agent in esterification and aroma-producing，and provided scientific evidence for its subsequent application.

Nongxiang Baijiu；yellow water；esterification；biological agent

TQ920.9；TS262.3；TS261.4

A

1001-9286（2016）09-0071-05

10.13746/j.njkj.2016191

固態發酵資源利用四川省重點實驗室項目（2015GTC001）；四川省教育廳基金項目（15ZB0291、11ZA225）；四川省大學生創業訓練項目（201510641044）。

2016-05-31

游玲，E-mail：23686037@qq.com。

優先數字出版時間：2016-08-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160803.1013.002.html。