冰溫貯藏對羊肉中蛋白質磷酸化水平的影響

張 艷，李 欣，李 錚，李 蒙，劉永峰，張德權

?

冰溫貯藏對羊肉中蛋白質磷酸化水平的影響

張 艷1,2，李 欣2，李 錚2，李 蒙2，劉永峰1，張德權2

（1陜西師范大學食品工程與營養科學學院，西安 710119；2中國農業科學院農產品加工研究所/農業部農產品加工重點實驗室，北京 100193）

【目的】通過測定冰溫貯藏及冷藏過程中肌肉肌漿蛋白與肌原纖維蛋白的磷酸化水平，分析冰溫貯藏對蛋白質磷酸化水平的影響，為肉類冰溫貯藏品質調控提供理論依據。【方法】選取大尾寒羊與小尾寒羊雜交公羊的背最長肌于冷藏和冰溫條件下成熟，分別在0.5 h、12 h、24 h、3 d、5 d、9 d取樣測定蛋白激酶活性、肌漿蛋白與肌原纖維蛋白的磷酸化水平。采用蛋白激酶活性測定試劑盒、運用酶聯免疫的方法檢測各處理組蛋白激酶的活性隨貯藏時間的變化；通過SDS-PAGE電泳、熒光染色的方法得到全蛋白染色與磷酸化染色的肌漿蛋白與肌原纖維蛋白條帶，運用Quantity One軟件分析各處理組各處理時間的肌漿蛋白及肌原纖維蛋白的磷酸化水平。【結果】貯藏初期（0.5—12 h），冰溫組蛋白激酶活性顯著升高（＜0.05），冷藏組蛋白激酶活性則顯著降低（＜0.05），貯藏12 h—9 d過程中，冰溫組蛋白激酶活性均顯著高于冷藏組（＜0.05）。兩處理組蛋白激酶活性均隨貯藏時間的延長而逐漸降低，且冰溫組蛋白激酶活性均顯著高于冷藏組（＜0.05）。對肌漿蛋白染色效果圖中分布于15—250 kDa的17個蛋白條帶逐一進行分析，結果表明貯藏溫度極顯著影響肌漿蛋白各蛋白條帶的磷酸化水平（＜0.001）。冷藏組肌漿蛋白整體磷酸化水平先升高后降低，貯藏第3天達到最大值，冰溫組肌漿蛋白整體磷酸化水平先降低后升高，最小值出現在貯藏第24天，貯藏第12天至3天時，冷藏組肌漿蛋白整體磷酸化水平高于冰溫組（＜0.05），貯藏第9天時，冰溫組肌漿蛋白整體磷酸化水平高于冷藏組（＜0.05）。對肌原纖維蛋白染色效果圖中分布于15—250 kDa的20個蛋白條帶逐一進行分析，結果表明不同貯藏溫度對所有肌原纖維蛋白條帶的磷酸化水平均產生極顯著影響作用（＜0.001）。兩處理組肌原纖維蛋白整體磷酸化水平均隨貯藏時間的延長呈現先升高后降低的趨勢，冷藏組與冰溫組最大值分別出現在24 h和12 h，貯藏初期（0.5-—12 h），兩處理組間肌原纖維蛋白整體磷酸化水平無顯著差異（＜0.05），貯藏24 h至貯藏期結束，冷藏組肌原纖維蛋白整體磷酸化水平始終高于冰溫組（＜0.05）。【結論】冰溫貯藏通過影響蛋白激酶的活性來調控蛋白質的磷酸化水平，進而通過影響糖酵解途徑、肌肉收縮及骨架蛋白降解來間接調控肉品質。

冰溫；蛋白激酶；肌漿蛋白；肌原纖維蛋白；蛋白質磷酸化

0 引言

【研究意義】冰溫貯藏是指將食品貯藏在其冰點以上、0℃以下的溫度區域，該溫度區域既可使機體的生理活動降到最低程度，又能維持其正常的新陳代謝，既能抑制微生物生長，又不會對食品產生凍害，進而起到長期保鮮食品的作用[1]。磷酸化是經蛋白激酶催化的最常見、最重要的一種蛋白質的翻譯后修飾方式[2]。糖酵解、肌肉收縮及蛋白質降解等與肉品質形成相關的生物學過程都受蛋白質磷酸化和去磷酸化這一可逆過程的調節[3-5]。因此，研究冰溫貯藏條件下肌肉蛋白質磷酸化水平的變化，可為研究宰后蛋白質磷酸化修飾調控肉品質的形成和劣變提供理論依據。【前人研究進展】李培迪等[6]的研究表明，相較于冷藏，冰溫貯藏可使丙酮酸激酶活性升高，乳酸脫氫酶活性降低，同時延長μ-鈣蛋白酶的活性保持時間，從而延緩肌肉糖酵解進程，延遲肌肉成熟，說明貯藏溫度能夠通過調控酶的活性影響糖酵解過程。ANDERSON等[7]指出宰后肌漿蛋白中葡萄糖磷酸變位酶-1的磷酸化水平與肌肉剪切力呈現負相關，另外，SHEN等[8]的研究指出，豬宰后早期背最長肌中蛋白激酶的激活導致磷酸果糖激酶2（PFK-2）和磷酸果糖激酶1（PFK-1）的磷酸化，進而形成白肌肉（PSE肉），這表明宰后肌肉品質與肌漿蛋白的磷酸化關系密切。同時，HUANG等[9]研究發現宰后肌肉成熟及肌肉品質變化與肌原纖維蛋白磷酸化水平相關。HEELEY[10]、MAZZEI[11]、RYDER[12]等研究發現肌肉中大部分肌原纖維蛋白的功能特性均受蛋白質磷酸化和去磷酸化過程影響，可見肉品質變化同樣與肌原纖維蛋白的磷酸化存在緊密聯系。【本研究切入點】冰溫貯藏有利于延緩宰后肌肉的成熟進程，從而調控肌肉品質，同時有研究表明宰后成熟過程中（0—24 h）肌漿蛋白的磷酸化修飾水平能夠間接影響糖酵解進程，肌原纖維蛋白的磷酸化修飾可以通過影響肌肉收縮而調控肉的僵直及嫩化進程。肌漿蛋白與肌原纖維蛋白是肌肉蛋白最主要的組成成分，肌漿蛋白包括大多數與糖酵解有關的酶類，肌原纖維蛋白包含主要的收縮蛋白及收縮調控蛋白[13]。在宰后較長時間的貯藏過程中蛋白質磷酸化水平是否會發生變化，貯藏條件是否會對蛋白質磷酸化水平產生影響，均未見報道。【擬解決的關鍵問題】通過檢測貯藏過程中蛋白激酶的活性、肌漿蛋白及肌原纖維蛋白的磷酸化水平，揭示冰溫貯藏對蛋白質磷酸化水平的影響。

1 材料與方法

試驗于2015年10月至2016年2月在中國農業科學院農產品加工研究所進行。

1.1 試驗材料

選取飼養方式相同、體重相近的8月齡大尾寒羊×小尾寒羊雜交公羊5只。采用清真方式屠宰，宰前靜養1 h以消除應激，宰后0.5 h內迅速取下兩側背最長肌。

每只羊在宰后0.5 h取其任意一側背最長肌靠近尾端的1/7，液氮速凍，貯存于-80℃，用于測定初始指標。剩余背最長肌樣品均在宰后2 h內于冰盒上運回實驗室，每只羊兩側背最長肌隨機分為冷藏及冰溫貯藏處理組，每條背最長肌樣品平均分為6份，從頭至尾隨機分配至各個貯藏時間（12 h、24 h、3 d、5 d、9 d，剩余一塊用于監測溫度），白色托盤盛放，貼上標簽，食品級PE保鮮膜，氧氣透過率為（10 600± 20）% cm3/（m2·24 h·atm）包裹后放入-18℃冰箱進行降溫，冷藏組待肉塊中心溫度降至4℃時取出，冷藏貯存（2—4℃），冰溫組待肉塊中心溫度降至-1℃時取出，冰溫貯存（-1—-1.5℃）。宰后12 h、24 h、3 d、5 d、9 d取出相應肉塊，去除可見脂肪及筋膜后經液氮速凍，保存于-80℃。

1.2 試驗試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 試驗使用試劑均為分析純。三羥甲基氨基甲烷（Trizma base）、二硫蘇糖醇（DTT）、甲叉雙丙烯酰胺（methylene diacrylamide）、丙烯酰胺（Acrylamide）、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、甘氨酸、曲拉通-100（Triton-100）、EGTA、巰基乙醇（β-mercaptoethanol）、考馬斯亮藍G250、溴酚藍、甘油，美國Sigma公司；蛋白酶抑制劑（Roche Complete）、磷酸酶抑制劑（Roche PhosStop），瑞士Roche公司；蛋白濃度測定試劑盒（BCA protein assay kit），美國Pierce公司；蛋白激酶活性測定試劑盒，加拿大Immunechem公司；Pro-Q染色液（Pro-Q Diamond）、Ruby染色液（SYPRO Ruby），美國Invitrogen公司；氯化鉀（KCl）、無水乙酸鈉、磷酸、乙腈、甲醇、無水乙醇、乙酸，國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.2.2 主要儀器 MIR-154-PC低溫恒溫培養箱，日本Panasonic公司；Ultra Turrax Disperser S25勻漿器，德國IKA公司；CR22GII高速冷凍離心機，日本日立公司；SpectraMax 190多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司；1-14小型臺式離心機，美國Sigma公司；DK-S28電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；電泳儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；T6紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；超低溫冰箱，美國Thermo公司。

1.3 試驗方法

采用Pro-Q Diamond和SYPRO Ruby染液分別檢測磷酸化蛋白和全蛋白。將某一蛋白條帶經Pro-Q Diamond染色后的灰度值（P）與SYPRO Ruby染色后的灰度值（T）之比作為該條帶磷酸化水平。試驗共60個樣品（5只羊×2個處理組×6個時間點），所有樣品從蛋白質提取到進行電泳及蛋白質條帶染色均進行3次以上重復性檢測。

1.3.1 蛋白激酶活性測定 取-80℃凍存的肉樣，用預冷的生理鹽水洗滌2次，濾紙吸干，稱取3 g肉樣，加入12 mL預冷緩沖液（25 mmol·L-1Tris-HCl，2 mmol·L-1EGTA，50 mmol·L-1巰基乙醇），冰浴中15 000×充分勻漿（3次，每次15 s，間隔30 s）。在4℃、1 000×條件下離心30 min，上清液用兩層紗布過濾，即得蛋白激酶粗提液，分裝后于-80℃保存。

將蛋白激酶粗提液稀釋20倍后采用考馬斯亮藍法測定樣品蛋白濃度，調整原激酶粗提液至相同濃度，稀釋2 000倍，采用酶聯免疫方法，運用蛋白激酶活性測定試劑盒測定蛋白激酶活性，蛋白激酶相對活性以495 nm處樣品吸光度值與空白（20×蛋白激酶提取緩沖液）吸光度值之差表示。

1.3.2 肌漿蛋白提取及其磷酸化水平測定 肌漿蛋白提取參考Lametsch等[14]的方法，并略作修改，取-80℃凍存的肉樣1.0 g，加6 mL預冷的緩沖液（10 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1DTT，蛋白酶抑制劑1片/50 mL，磷酸酶抑制劑5片/50 mL），冰浴中15 000×勻漿30 s（3次，每次10 s，間隔30 s），4℃、20 000×離心30 min，上清液用兩層紗布過濾即得肌漿蛋白，震蕩均勻后分裝，于-80℃貯存。

取-80℃貯存的肌漿蛋白，稀釋8倍后用BCA法測定蛋白濃度，將肌漿蛋白濃度調整為2 μg·μL-1后與上樣緩沖液（10% SDS 4 mL，甘油2 mL，2 mL 0.5 mol·L-1Tris-HCl pH6.8，2 mL 1 mol·L-1DTT，溴酚藍0.01 g）1﹕1混合，沸水浴煮5 min，2 000×離心2 min，分裝后-20℃貯存備用。

采用SDS-PAGE電泳、磷酸化染色及全蛋白染色測定肌漿蛋白磷酸化水平。分離膠濃度為14%，濃縮膠濃度為4%，上樣量為5 μg。電泳結束后至成像前所有操作均需在搖床（60 r/min）上進行。固定液（50%甲醇，10%乙酸）固定（100 mL、30 min/次，2次）以確保凝膠上電泳緩沖液被清洗干凈，超純水水洗（100 mL、10 min/次，3次），Pro-Q Diamond染液避光染色80 min，Pro-Q脫色液（20%乙腈，50 mmol·L-1乙酸鈉，pH 4.0）脫色（100 mL、30 min/次，2次），超純水水洗（100 mL、5 min/次、3次），進行磷酸化蛋白染色成像；SYPRO Ruby染色液染色4 h，Ruby脫色液（10%乙醇，7%乙酸）脫色（100 mL、30 min/次，2次），超純水水洗（100 mL、5 min/次、3次）。

使用ChemiDocTMMP凝膠成像儀對染色后的蛋白質凝膠進行掃描。Pro-Q Diamond染色后在激發波長為532 nm、發射波長為 580 nm、分辨率為 200 mm的條件下掃描。 SYPRO Ruby染色后在激發波長為532 nm、發射波長為610 nm、分辨率為200 mm的條件下掃描。

1.3.3 肌原纖維蛋白提取及其磷酸化水平測定 肌原纖維蛋白提取參考Smuder等[15]的方法并略作修改，取-80℃凍存的肉1.0 g，加6 mL預冷的緩沖液（10 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1DTT，蛋白酶抑制劑1片/50 mL，磷酸酶抑制劑5片/50 mL），冰浴中15 000×勻漿30 s（3次，每次10 s，間隔30 s），4℃、20 000×離心30 min，棄上清。沉淀中加入8 mL預冷的肌原纖維溶解緩沖液（100 mmol·L-1KCl，1% Triton），冰浴中勻漿15 s，4℃，2 000×離心15 min，棄上清，此操作重復2次。沉淀中加入10 mL 5% SDS（60℃），使肌原纖維蛋白充分溶解，80℃加熱20 min，分裝后-80℃保存。

取-80℃貯存的肌漿蛋白，稀釋15倍后用BCA法測定蛋白濃度，將肌漿蛋白濃度調整為2 μg·μL-1后與上樣緩沖液1﹕1混合，沸水浴煮沸5 min，2 000×離心2 min，分裝后-20℃貯存備用。

肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%，其磷酸化蛋白染色、全蛋白染色過程均同肌漿蛋白。

1.4 圖像分析及統計分析

運用Quantity One（美國Bio-Rad公司）軟件對經熒光染液染色的SDS-PAGE凝膠電泳蛋白條帶的光密度值進行分析，得到每個條帶的磷酸化蛋白染色（Pro-Q Diamond）光密度值（P）和全蛋白染色（SYPRO Ruby）光密度值（T），同一條帶的磷酸化蛋白與全蛋白光密度值之比P/T即為該條帶蛋白質磷酸化水平，樣品整體磷酸化水平為其泳道上所有蛋白條帶的P/T值之和。利用SPSS Statistics 20軟件對試驗結果進行分析，不同處理組間的差異顯著性采用獨立樣本T檢驗進行分析；以貯藏條件、宰后時間及貯藏條件×宰后時間3個因素作為變量，動物作為隨機因素，進行混合模型方差分析。多重比較方法采用Duncan法，顯著性水平為＜0.05。結果均以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 蛋白激酶活性分析

如圖1所示，冰溫貯藏條件下蛋白激酶活性在宰后0.5—12 h顯著升高（＜0.05），隨后逐漸下降。冷藏過程中蛋白激酶活性隨貯藏時間的延長而逐漸顯著降低（＜0.05），且冷藏過程中降低速率高于冰溫貯藏，12 h—9 d的貯藏過程中冰溫組蛋白激酶活性均顯著高于冷藏組（＜0.05）。在貯藏后期，冷藏組蛋白激酶接近失活狀態而冰溫組仍處于較高水平。

2.2 肌漿蛋白各蛋白條帶磷酸化水平分析

冰溫貯藏組及冷藏組在宰后0.5 h、12 h、24 h、3 d、5 d、9 d的肌漿蛋白SDS-PAGE電泳圖如圖2-a、2-b所示。對圖2中分布于15—250 kDa的17個蛋白條帶逐一進行分析，結果如表1所示。不同貯藏溫度下，各個蛋白條帶的磷酸化水平均差異顯著（＜0.001），條帶2、3、5、6、10、14、15的磷酸化在不同貯藏溫度和不同貯藏時間下均產生顯著差異（＜0.05），條帶2、5、6、14、15、17的磷酸化水平在貯藏溫度與貯藏時間的交互作用下差異顯著（＜0.05）。其中，條帶4、7、9的磷酸化水平隨貯藏時間的延長先升高后降低，且分別在第24 h、第5天、第12 h達到最大值。條帶2、5、6、11、15的磷酸化水平在貯藏期內先降低后升高，最小值分別出現在第12 h（及24 h）、第24 h、第5天、第24 h、第12 h。條帶10磷酸化水平隨貯藏時間延長逐漸升高。條帶8、12、13、17在整個貯藏期內磷酸化水平均處于較穩定狀態。另外，冷藏組條帶11、17的磷酸化水平顯著高于冰溫組（＜0.05），而冰溫組條帶6、13、14、15、16的磷酸化水平顯著高于冷藏組（＜0.05）。

2.3 肌漿蛋白整體磷酸化水平隨貯藏時間的變化

對圖2中電泳圖譜進行灰度值分析，不同貯藏處理組的整體磷酸化水平如圖3所示。從圖中可知，宰后冷藏組肌漿蛋白磷酸化水平呈現先上升后下降的趨勢，冰溫組在宰后0.5—24 h時磷酸化水平降低，隨后上升。冷藏組肌漿蛋白最高磷酸化水平出現在貯藏第3天，而冰溫組肌漿蛋白磷酸化水平最高值出現在宰后0.5 h及第5天。其中在貯藏第12、24 h及第3天時，冷藏組肌漿蛋白整體磷酸化水平均顯著高于冰溫組（＜0.05），貯藏第9天時冰溫組肌漿蛋白磷酸化水平顯著高于冷藏組（＜0.05）。

不同小寫字母表示冷藏條件不同貯藏時間之間存在差異顯著（P＜0.05）；不同大寫字母表示冰溫條件不同貯藏時間之間存在差異顯著（P＜0.05）；*表示不同溫度處理間差異顯著（P＜0.05）。下同

a：磷酸化肌漿蛋白；b：全肌漿蛋白 a: Image of phosphoproteins stained with Pro-Q Diamond; b:Image of total proteins stained with SYPRO Ruby

表1 不同貯藏條件對肌漿蛋白磷酸化水平的影響

表中各條帶的磷酸化水平（P/T）均以平均值±標準差表示。不同小寫字母表示同一條帶不同處理間差異顯著（＜0.05）。下同

Phosphorylation level of each band is expressed as the mean±standard error. Different small letters represent significant difference (＜0.05). The same as below

圖3 冷藏、冰溫貯藏過程中肌漿蛋白整體磷酸化水平分析

2.4 肌原纖維蛋白各蛋白條帶磷酸化水平分析

冰溫貯藏組及冷藏組在宰后0.5 h、12 h、24 h、3 d、5 d、9 d的肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳圖如圖4-a、4-b所示，其中圖4-a為Pro-Q Diamond 染色的磷酸化蛋白，圖4-b為SYPRO染色的全肌原纖維蛋白。對圖4中20個蛋白條帶逐個進行分析，結果如表2所示。不同貯藏溫度對所有肌原纖維蛋白條帶的磷酸化水平均產生極顯著影響（＜0.001），不同貯藏時間對所有的肌原纖維蛋白條帶的磷酸化水平產生顯著影響作用（＜0.05），貯藏溫度與貯藏時間的交互作用對條帶2、3、4、5、7、8、9、10、13、14、15、17、18、20的磷酸化水平有顯著影響作用（＜0.05）。其中，條帶10的磷酸化水平隨貯藏時間的延長逐漸減低。條帶8的磷酸化水平在貯藏期內先降低后升高，最小值出現在第12 h。條帶9、11、16、20的磷酸化水平隨貯藏時間的延長先升高后降低，最大值分別出現在第24 h、第12 h、第5天、第24 h。條帶1、3、4、14的磷酸化水平均在貯藏第12 h達到最大值，條帶15、17的磷酸化水平在貯藏第5天達到最大值。另外，冷藏組條帶2、7、8、9、12、14、15、18的磷酸化水平顯著高于（＜0.05）冰溫組，而條帶1、4、10、11、16、19在冰溫組的磷酸化水平顯著高于（＜0.05）冷藏組，說明在不同貯藏條件下，肌原纖維蛋白各蛋白條帶的磷酸化水平變化并不一致。

a：磷酸化肌原纖維蛋白；b：全肌原纖維蛋白 a: Image of phosphoproteins stained with Pro-Q Diamond; b: Image of total proteins stained with SYPRO Ruby

表2 不同貯藏條件對肌原纖維蛋白磷酸化水平的影響

2.5 肌原纖維蛋白整體磷酸化水平隨貯藏時間的變化

對圖4中電泳圖譜進行灰度值分析，不同貯藏處理組的整體磷酸化水平如圖5所示，宰后羊肉肌原纖維蛋白整體磷酸化水平在冰溫貯藏組與冷藏組中均呈現先上升后下降的趨勢，其中冷藏組在宰后24 h時達到最大磷酸化水平，冰溫貯藏組在宰后12 h達到最大磷酸化水平，且從貯藏24 h開始至貯藏期結束，冷藏組肌原纖維蛋白整體磷酸化水平均顯著高于冰溫組（＜0.05）。

圖5 冷藏、冰溫貯藏過程中肌原纖維蛋白整體磷酸化水平分析

3 討論

3.1 不同貯藏處理對蛋白激酶活性的影響

蛋白激酶是一類能夠催化蛋白質磷酸化反應的酶，它們幾乎在每一個細胞功能中都起著重要作用[16]。所有的蛋白激酶都處于基態，在需要時被不同的刺激因素激活，進而催化某些蛋白質的磷酸化反應并激活磷酸酶[17]。SHEN等[8]的研究表明，PSE肉中AMP激活性蛋白激酶（AMPK）在宰后早期被激活并在0.5 h酶活性最高，隨后逐漸降低，而正常豬肉中AMPK酶活性在宰后1 h最高，說明AMPK活性對宰后肉品質存在影響。AMPK在宰后糖酵解進程及PSE肉的形成中起關鍵，宰后早期ATP的消耗與AMP的生成使AMPK被激活，導致肌肉pH快速下降，在豬肉中則表現為PSE肉的形成[18-20]。李培迪等[6]研究發現，冰溫貯藏的肌肉較冷藏晚4 d達到其極限pH。本研究中，冰溫條件下蛋白激酶活性的激活滯后于冷藏，結合李培迪的研究，可以從新的角度揭示冰溫貯藏條件下肌肉達到極限pH所需時間較長的原因。

3.2 不同貯藏處理對肌漿蛋白磷酸化水平的影響

糖酵解作為宰后肌肉最主要的供能方式，與肌肉肉色、pH、系水力及肌肉僵直都有直接關系，肌漿蛋白中糖酵解酶占三分之二以上[21]。宰后肌肉中ATP大量消耗導致糖酵解速率加快，pH快速下降，這將會加速僵直現象的出現，促進成熟，減少僵直總時間[22-23]。另有研究表明，蛋白質磷酸化在調節糖酵解酶活性方面發揮著重要作用[3]，因此，選擇宰后羊肉的肌漿蛋白來檢測并分析其磷酸化水平在不同貯藏條件下6個貯藏時間點的變化。

貯藏12 h至3 d時，冷藏組肌漿蛋白整體磷酸化水平高于冰溫組，而第9天時冰溫組高于冷藏組（圖3），原因可能是貯藏初期冷藏組蛋白激酶活性高于冰溫組（圖1），催化肌漿蛋白發生磷酸化反應的程度較強，而隨著貯藏時間的延長，冷藏組由于糖酵解速率快[6]，ATP消耗較快、含量降低，導致ATP依賴性蛋白激酶活性降低[24]，肌漿蛋白磷酸化反應程度降低，磷酸化水平不再升高。相反，冰溫貯藏有利于維持蛋白激酶活性，進而促進肌漿蛋白整體磷酸化水平的穩定。即使冷藏有利于肌漿蛋白整體磷酸化水平的提高，但并不是所有的冷藏處理組所有的肌漿蛋白磷酸化水平均高于冰溫貯藏組。肌漿蛋白整體磷酸化水平受貯藏條件、貯藏時間及貯藏條件與貯藏時間的交互作用共同影響。

HUANG等[3]的質譜鑒定結果顯示，條帶3主要為糖原磷酸化酶，有研究表明糖原磷酸化酶等大多數糖酵解酶都可以在體外被不同激酶催化發生磷酸化反應，反應后酶活性或其穩定性增強，進而加速糖酵解進程[25-26]，本研究中，冷藏組糖原磷酸化酶磷酸化水平高于冰溫組，因此推測冰溫貯藏會通過下調糖原磷酸化酶的磷酸化水平而使其活性降低，從而延緩糖酵解。條帶4主要為磷酸果糖激酶，磷酸果糖激酶是糖酵解作用的限速酶，其發生磷酸化反應后活性下降，減少了2,6-二磷酸果糖的產生，從而抑制糖酵解進程，減緩肌肉pH下降速率，本試驗結果為冰溫組磷酸果糖激酶磷酸化水平高于冷藏組，所以冰溫貯藏有利于通過上調磷酸果糖激酶磷酸化水平而使其活性升高，對糖酵解進程起到限制作用。條帶7主要為丙酮酸激酶，其為糖酵解途徑的限速酶，可催化磷酸稀醇丙酮酸向丙酮酸轉化，進一步轉變為乳酸，本研究結果為冷藏組丙酮酸激酶磷酸化水平高于冰溫組，此外，李培迪等[6]的研究表明，冰溫貯藏可上調丙酮酸激酶活力，同時延緩肌肉達到極限pH的時間，因此，認為冰溫貯藏可通過調控肌肉中糖酵解酶的活性來影響其成熟進程。但另有研究表明，AMPK會抑制L-丙酮酸激酶的活性，從而抑制糖酵解，說明丙酮酸激酶通過多個途徑影響糖酵解進程。條帶8可能為AMPK，AMPK的激活會引起磷酸果糖激酶2的磷酸化反應，本試驗結果為冰溫組AMPK磷酸化水平高于冷藏組，說明冰溫條件更有利于AMPK催化磷酸果糖激酶發生磷酸化反應，這也是冰溫組磷酸果糖激酶磷酸化水平高于冷藏組的原因。條帶13主要為乳酸脫氫酶，乳酸脫氫酶能夠可逆地催化并氧化L-乳酸生成丙酮酸，李培迪[6]的研究表明冰溫貯藏下調乳酸脫氫酶活力，本研究中，冰溫貯藏中乳酸脫氫酶磷酸化水平低于冷藏條件中其磷酸化水平，因此認為冰溫貯藏能夠通過調控乳酸脫氫酶磷酸化水平而影響其活性，進而影響糖酵解。條帶14可能為熱休克蛋白27，該蛋白是涉及細胞生長及細胞凋亡等功能的重要蛋白，當細胞受到脅迫，熱休克蛋白27表達量將增加，且會被磷酸化從而具有活性，行使保護肌動蛋白的功能，阻礙肌動蛋白與肌球蛋白的結合，進而影響嫩度，本試驗中，冰溫組熱休克蛋白27的磷酸化水平高于冷藏組，說明冰溫條件能夠上調熱休克蛋白27的磷酸化水平使其對肉品嫩度的調控作用發生改變。另外，REISS[27]、SALE[28]等的研究都表明豬背最長肌中的丙酮酸激酶、磷酸果糖激酶等糖酵解酶的活性均受自身磷酸化程度的影響，它們發生磷酸化反應后更加活躍，從而加快肌肉的糖酵解反應。因此，本研究結果表明，肌肉中各種糖酵解酶的磷酸化水平受冰溫貯藏調控，導致其活性受到影響，進而通過影響宰后糖酵解進程調控肉品品質。

3.3 不同貯藏處理對肌原纖維蛋白磷酸化水平的影響

肌原纖維蛋白是骨骼肌蛋白中含量最多的蛋白，其含量占蛋白總量的55%—60%，肌原纖維蛋白與肌肉收縮特性相關，并且與肌肉功能特性及原料肉烹飪特性之間均存在很大聯系[29]。Heeley[10]、Mazzei[11]、Ryder[12]等學者研究發現，肌間線蛋白、肌鈣蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白及肌球蛋白輕鏈等多種肌原纖維蛋白都會發生蛋白質磷酸化反應。結合筆者課題組[30]及Huang等[9]的質譜試驗結果，本試驗選擇了分析部分重要肌原纖維蛋白條帶的磷酸化水平。

條帶3中主要為肌球蛋白結合蛋白C，研究表明肌球蛋白結合蛋白C能夠在蛋白激酶C作用下發生磷酸化反應，磷酸化的肌球蛋白結合蛋白C與肌動蛋白的相互作用將會減弱，不利于肌肉收縮[31]，有利于肌肉嫩化，本試驗結果為冷藏組蛋白激酶C磷酸化水平高于冷藏組，說明冰溫貯藏可通過下調肌球蛋白結合蛋白C的磷酸化水平來延緩肌肉成熟。條帶8、9可能為原肌球蛋白，原肌球蛋白主要功能為調控肌球蛋白與肌動蛋白之間的相互作用，WU等[32]研究表明蛋白激酶C可使原肌球蛋白的絲氨酸位點發生磷酸化反應，從而提高其磷酸化水平，本研究結果為，冷藏組原肌球蛋白磷酸化水平高于冰溫組，說明冰溫貯藏可能會通過影響原肌球蛋白的磷酸化水平而調控肌肉收縮。條帶10與條帶11可能為肌鈣蛋白T3（TNNT3）與肌鈣蛋白T1（TNNT1），肌鈣蛋白是肌肉中主要的調節蛋白，直接參與鈣離子調控的肌肉收縮[33-34]，MOIR等[33]研究發現，肌鈣蛋白T激酶、磷酸化酶b激酶、酪蛋白激酶TS以及Ca2＋依賴性磷脂敏感蛋白激酶均可使肌鈣蛋白T發生磷酸化反應，本研究中冰溫組條帶10、條帶11的磷酸化水平均高于冷藏組，說明相較于冷藏，冰溫貯藏可上調肌鈣蛋白T的磷酸化水平，對肌肉收縮的強度與速度產生重要影響。條帶16可能為肌鈣蛋白I，ENGLAND[35]的研究表明，肌鈣蛋白I的磷酸化現象能夠促進肌肉收縮，本試驗中冰溫組條帶16的磷酸化水平高于冷藏組，說明冰溫條件更有利于肌鈣蛋白I磷酸化水平的升高，有利于其對肌肉收縮的促進作用。條帶20為肌球蛋白輕鏈2，STULL等[36]發現肌球蛋白輕鏈的磷酸化會引起肌球蛋白的結構改變，由此增加肌球蛋白的收縮強度，本試驗中冰溫組肌球蛋白輕鏈2磷酸化水平高于冷藏組，因此冰溫貯藏引起肌球蛋白輕鏈磷酸化水平的升高，從而增強肌球蛋白的收縮。綜上所述，冰溫貯藏可通過影響肌原纖維蛋白中肌肉收縮相關主要蛋白的磷酸化水平，而影響肌肉收縮的速度與強度，從而調控肉品質。

4 結論

冰溫及冷藏條件下蛋白激酶活性均隨貯藏時間的延長而降低，但降低的程度不同，貯藏12 h—9 d時，冷藏組蛋白激酶活性始終顯著低于冰溫組。冷藏組肌漿蛋白整體磷酸化水平最大值出現在貯藏第3天，冰溫組出現在第5天，且在貯藏早期（12 h—3 d）冷藏組顯著高于冰溫組，貯藏9 d時冰溫組顯著高于冷藏組。冷藏組肌原纖維蛋白整體磷酸化水平在貯藏24 h時達到最大值，冰溫組最大值則出現在12 h。綜上所述，冰溫貯藏有利于降低蛋白質磷酸化水平，從而間接調控肉品質，可為宰后貯藏條件的優化提供參考。

References

[1] 孫天利. 冰溫保鮮技術對牛肉品質的影響研究[D]. 沈陽: 沈陽農業大學, 2013.

Sun T L. Influences of controlled freezing point storage on beef [D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2013. (in Chinese)

[2] 錢小紅, 賀福初. 蛋白質組學: 理論與方法. 北京: 北京科學出版社, 2003.

Qian X H, He F C.. Beijing: Beijing Science Press, 2003. (in Chinese)

[3] Huang H G, Larsen M R, Karlsson A H, Pomponio L, Costa L N, Lametsch R. Gel-based phosphoproteomics analysis of sarcoplasmic proteins in postmortem porcine muscle with pH decline rate and time differences., 2011, 11(20): 4063-4076.

[4] Gannon J, Staunton L, O’ connell K, Doran P, Ohlendieck K. Phosphoproteomic analysis of aged skeletal muscle., 2008, 22(1): 33-42.

[5] DOUMIT M E, BATES R O. Regulation of pork water holding capacity, color, and tenderness by protein phosphorylation., 2000, 63(1): 17-22.

[6] 李培迪, 李欣, 李錚, 陳麗, 李仲文, 陳麗娟, 田建文, 張德權. 冰溫貯藏對宰后肌肉成熟進程的影響. 中國農業科學, 2016, 49(3): 554-562.

Li P D, Li X, Li Z, Chen L, Li Z W, Chen L J, Tian J W, Zhang D Q. Effects of controlled freezing point storage on aging from muscle to meat., 2016, 49(3): 554-562. (in Chinese)

[7] ANDERSON M J, LONERGAN S M, Huff-LONERGAN E. Differences in phosphorylation of phosphoglucomutase 1 in beef steaks from the longissimus dorsi with high or low star probe values., 2014, 96(1): 379-384.

[8] SHEN Q W, MEANS W J, UNDERWOOD K R, THOMPSON S A, ZHU M J, MCCORMICK R J, FORD S P, ELLIS M, DU M. Early post-mortem AMP-activated protein kinase (AMPK) activation leads to phosphofructokinase-2 and -1 (PFK-2 and PFK-1) phosphorylation and the development of pale, soft, and exudative (PSE) conditions in porcine longissimus muscle., 2006, 54(15): 5583-5589.

[9] HUANG H G, LARSEN M R, LAMETSCH R. Changes in phosphorylation of myofibrillar proteins during postmortem development of porcine muscle., 2012, 134(4): 1999-2006.

[10] HEELEY D H, WATSEN M H, MAK A S, DUBORD P, SMILLI L B. Effect of phosphorylation on the interaction and functional properties of rabbit striated-muscle alpha-alpha-tropomyosin., 1989, 264(5): 2424-2430.

[11] MAZZEI G J, KUO J F. Phosphorylation of skeletal-muscle troponin I and troponin T by phospholipid-sensitive Ca2+-dependent protein kinase and its inhibition by troponin C and tropomyosin., 1984, 218(2): 361-369.

[12] RYDER J W, LAU K S, KAMM K E, STULL J T. Enhanced skeletal muscle contraction with myosin light chain phosphorylation by a calmodulin-sensing kinase., 2007, 282(28): 20447-20454.

[13] 尹靖東. 動物肌肉生物學與肉品科學. 北京: 中國農業大學出版社, 2011.

Yin J D.. Beijing: China Agricultural University Press, 2011. (in Chinese)

[14] LAMETSCH R, KRISTENSEN L, LARSEN M R, THERKIDSEN M, OKSBIERG N, ERTBJERG P. Changes in the muscle proteome after compensatory growth in pigs., 2006, 84: 918-924.

[15] SMUDER A J, KAVAZIS A N, HUDSON M B, NELSON W B, POWER S K. Oxidation enhances myofibrillar protein degradation via calpain and caspase-3., 2010, 49(7): 1152-1160.

[16] MANNING G, WHYTE D B, MARTINEZ R, HUNTER T, SUDARSANAM S. The protein kinase complement of the human genome., 2002, 298(5600): 1912-1934.

[17] ROBERT R J. A historical overview of protein kinases and their targeted small molecule inhibitors., 2015, 7(10): 1-23.

[18] BARON S J, LI J, RUSSELL 3rd R R, NEUMANN D, MILLER E J, TUERK R, WALLIMANN T, HURLEY R L, WITTERS L A, YOUNG L H. Dual mechanisms regulating AMPK kinase action in the ischemic heart., 2005, 96(3): 337-345.

[19] HWANG J T, HA J, PARK O J. Combination of 5-fluorouracil and genistein induces apoptosis synergistically in chemo-resistant cancer cells through the modulation of AMPK and COX-2 signaling pathways., 2005, 332(2): 433-440.

[20] HWANG J T, LEE M, JUNG S N, LEE H J, KANG I, KIM S S, HA J. AMP-activated protein kinase activity is required for vanadate- induced hypoxia-inducible factor 1alpha expression in DU145 cells., 2004, 25(12): 2497-2507.

[21] HAWLEY S A, PAN D A, MUSTARD K J, ROSS L, BAIN J, EDELMAN A M, FRENGUELLI B G, HARDIE D G. Calmodulin- dependent protein kinase kinase-beta is an alternative upstream kinase for AMP-activated protein kinase., 2005, 2(1): 9-19.

[22] WOODS A, DICKERSON K, HEATH R, HONG S P, MIMCILOVIC M, JOHNSTONE SR, CARLSON M, CARLING D. Ca2+/ calmodulin-dependent protein kinase kinase-beta acts upstream of AMP-activated protein kinase in mammalian cells., 2005, 2(1): 21-33.

[23] SCOPES, R K, STOTER A. Purification of all glycolytic enzymes from one muscle extract., 1982, 90: 479-490.

[24] DICKENS J A, LYON C E. The effects of electric stimulation and extended chilling times on the biochemical reactions and texture of cooked broiler breast meat., 1995, 74(12): 2035-2040.

[25] SAVELL J W, MUELLER S L, BAIRD B E. The chilling of carcasses., 2005, 70(3): 449-459.

[26] WALSH D A, PERKINS J P, KREBS E G. An adenosine 3’,5’-monophosphatedependant protein kinase from rabbit skeletal muscle., 1968, 243(13): 3763-3774.

[27] REISS N, KANETY H, SCHLESSINGER J. Five enzymes of the glycolytic pathway serve as substrates for purified epidermal- growth-factor-receptor kinase., 1986, 239(3): 691-697.

[28] SALE E M, WHITE M F, KAHN C R. Phosphorylation of glycolytic and gluconeogenic enzymes by the insulin receptor kinase., 1987, 33(1): 15-26.

[29] LEE S H, JOO S T, RYU Y C. Skeletal muscle fiber type and myofibrillar proteins in relation to meat quality., 2010, 86(1): 166-170.

[30] CHEN L J, LI X, NI N, LIU Y, CHEN L, WANG Z Y, SHEN Q W, ZHANG D Q. Phosphorylation of myofibrillar proteins in post- mortem ovine muscle with different tenderness., 2016, 96(5): 1474-1483.

[31] WANG L, SADAYAPPANAPPAN S, KAWAI M. CARDIAC. Myosin binding protein C phosphorylation affects cross-bridge cycle’s elementary steps in a site-specific manner., 2014, 9(11): e113417.

[32] WU S C, SOLARO R J. Protein kinase C zeta. A novel regulator of both phosphorylation and de-phosphorylation of cardiac sarcomeric proteins., 2007, 282(42): 30691-30698.

[33] MOIR A J, PERRY S V. The sites of phosphorylation of rabbit cardiac troponin I by adenosine 3’,5’-cyclic monophosphate-dependent protein kinase: Effect of interaction with troponin C., 1977, 167(2): 333-343.

[34] PINNA L A, MEGGIO F, DEDIUKINA M M. Phosphorylation of troponin T by casein kinase TS., 1981, 100(1): 449-454.

[35] ENGLAND P J. Correlation between contraction and phosphorylation of the inhibitory subunit of troponin in perfused rat heart., 1975, 50(1): 57-60.

[36] STULL J T, KAMM K E, VANDENBOOM R. Myosin light chain kinase and the role of myosin light chain phosphorylation in skeletal muscle., 2011, 510(2): 120-128.

（責任編輯 趙伶俐）

Effects of Controlled Freezing Point Storage on the Protein Phosphorylation Level

ZHANG Yan1,2, LI Xin2, LI Zheng2, LI Meng2, LIU Yong-feng1, ZHANG De-quan2

(1College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119;2Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Beijing 100193)

【Objective】 The aim of this study was to investigate the effect of controlled freezing point on protein phosphorylation level, so as to provide a new theoretical basis for controlling meat quality by controlled freezing point. 【Method】 The longissimus doris (LD) of large tail×small tail crossed sheep were obtained and divided into two groups: refrigeration group and controlled freezing point group. Each LD was assigned to 6 storage times (0.5 h, 12 h, 24 h, 3 d, 5 d and 9 d). Kit for protein kinase activity measurement and enzyme linked immunosorbent assay were applied to detect protein kinase activity. A gel-based phosphoproteomic study was performed. And SDS-PAGE electrophoresis and fluorescence staining were applied to gain the protein bands of sarcoplasmic proteins and myofibrillar proteins stained by SYPRO Ruby and Pro-Q Diamond. A software named Quantity One was used to analyze the protein phosphorylation level by measuring the fluorescence intensity.【Result】 At 12 h, the protein kinase activity of controlled freezing point group significantly increased (＜0.05) and that of refrigeration group significantly decreased. The protein kinase activity of the two groups were reduced from 12h to 9 d, which was significantly higher in controlled freezing group compared with refrigeration group (＜0.05). Seventeen protein bands distributed from 15-250 kDa in each sarcoplasmic protein sample were analyzed and the results suggested that storage temperature influenced (<0.001) the protein phosphorylation level of all sarcoplasmic proteins significantly. The total phosphorylation level of sarcoplasmic proteins in refrigeration group increased at first and then decreased while the sarcoplasmic proteins in controlled freezing point group showed an opposite variation trend. The phosphorylation level of 3 d was the highest, while the lowest was 24 h. Globally, the sarcoplasmic proteins of refrigeration group had the higher total phosphorylation level than controlled freezing point group during 12 h to 3 d. However, the total phosphorylation level of the sarcoplasmic proteins of controlled freezing point was higher than refrigeration group on 9 d. Twenty protein bands distributed from 15-250 kDa in each myofibrillar protein sample were analyzed and the results suggested storage temperature influenced the protein phosphorylation level of all myofibrillar proteins very significantly (<0.001). The total phosphorylation level of myofibrillar proteins increased firstly and then decreased in two groups. And the highest phosphorylation level of 24 h in refrigeration group and 12 h in controlled freezing point group was the highest. Total phosphorylation level of myofibrillar protein had no significant difference between two groups from 0.5 h to 12 h. However, total phosphorylation level of myofibrillar protein was higher in refrigeration group compared with controlled freezing group from 24 h to the end of storage.【Conclusion】 The controlled freezing point storage regulated the phosphorylation level of protein by affecting the activity of protein kinase, which can indirectly regulate the meat quality by influencing the glycometabolism, muscle contraction and degradation of skeleton protein.

controlled freezing point; protein kinase; sarcoplasmic proteins; myofibrillar proteins; protein phosphorylation

2016-04-18；接受日期：2016-07-29

國家公益性行業（農業）科研專項（201303083）、國家農業科技創新工程、陜西省科技統籌創新計劃（2015KTTSNY04-07）

張艷，E-mail：zhangwen2255@126.com。通信作者劉永峰，E-mail：yongfeng200@126.com。通信作者張德權，E-mail：dequan_zhang0118 @126.com