一株石韋內生真菌S-34的鑒定及其代謝物檢測與分析

李　姝，李寧浙，陳　沖，齊盼盼，宋麗菊，吳道艷，劉明棟，汪學閣，趙　建

（四川大學生命科學學院資源微生物及生物技術重點實驗室，四川 成都 610064）

一株石韋內生真菌S-34的鑒定及其代謝物檢測與分析

李姝，李寧浙，陳沖，齊盼盼，宋麗菊，吳道艷，劉明棟，汪學閣，趙建

（四川大學生命科學學院資源微生物及生物技術重點實驗室，四川 成都 610064）

以藥用植物有柄石韋葉為材料，采用組織塊法與微量稀釋法分離并篩選出一株具有抑菌活性的內生真菌S-34。經形態學觀察、ITS測序與序列比對鑒定內生真菌S-34為鏈格孢屬（Alternaria sp.）。進一步利用GC-MS對其代謝物進行檢測與分析，結果顯示：內生真菌S-34發酵液乙酸乙酯提取物的抑菌成分主要為氟苯甲酸（20.86%）、苯乙醇（4.89%）、2，3-丁二醇（3.64%），菌體乙酸乙酯提取物的抑菌成分主要為苯甲醛（2.27%）、亞麻醇（2.53%）、亞油酸單甘油酯（1.69%）、亞麻酰氯（9.28%）、反式角鯊烯（7.26%）、麥角甾醇（2.78%）。研究表明，有柄石韋內生真菌S-34的代謝物中蘊藏著較為豐富的抑菌活性物質，是開發天然藥物的潛在資源。

有柄石韋；內生真菌；抑菌活性；代謝物；GC-MS

0　引　言

植物內生真菌是指普遍存在于健康植物組織的內部，但一般不引起植物病害的真菌，其與宿主協同進化形成穩定的生態關系，可產生與宿主植物相同或不同的生物活性物質［1］，在抗腫瘤、抗氧化、抗菌、殺蟲等方面有一定的應用前景。錢一鑫等［2］研究發現白苞蒿內生真菌鏈格孢屬GYBH47的粗提物具有較好的抗腫瘤活性。Tao等［3］從植物taxus chinensis var.mairei內生真菌Phomopsis sp.A240的代謝物中分離出一種具有抗氧化活性的內酯類物質。于淼等［4］對紅豆杉內生真菌Xylariales sp.的代謝物進行分離純化，并從乙酸乙酯相中分離出2種具有抑菌活性的化合物。由此可見，植物內生真菌的代謝物十分豐富。因此，從植物中分離內生真菌是獲得新天然產物與新藥開發的潛在資源，同時也為替代有限的藥用植物資源提供了新的思路和方法。

中藥石韋為水龍骨科（Polypodiaceae）石韋屬（Pyrrosia）多種植物，其主要的植物來源包括有柄石韋（P.petiolosa）、廬山石韋（Pyrrosia sheareri）、氈毛石韋（Pyrrosia drakeana）等［5］。作為我國常用的中藥，石韋具有利水通淋、清肺泄熱、涼血止血等功效，石韋提取物同樣具有抗炎利尿、抑菌、抗病毒、增強免疫力等作用［6］。目前，對于石韋主要化學活性成分研究較多，但對于石韋內生真菌代謝物的研究還未見報道。本文從有柄石韋中分離并篩選出具有抑菌活性的內生真菌S-34，并通過GC-MS對其代謝物的有效成分進行初步研究，以期為進一步利用石韋內生真菌代謝物獲得新的天然產物及開發新藥提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試植物

有柄石韋葉采自四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣，經鑒定后于4℃保存備用。

1.1.2供試病原菌

供試病原細菌6種，其中革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌（Staphylococus aureus），耐久腸球菌（Enterococcus durans），藤黃微球菌（Micrococcus luteus）；革蘭氏陰性菌為大腸桿菌（Escherichia coli），腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis），志賀氏桿菌（Shigella sonnei）。所有菌株均為本實驗室保藏菌種。

1.1.3試劑與儀器

無水乙醇、次氯酸鈉、乙酸乙酯、胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、葡萄糖、瓊脂粉均為國產分析純；氯霉素（Amersco公司）；真菌基因組DNA提取試劑盒（OMEGA公司）；Premix TaqTM（TaKaRa公司）；ITS1、ITS4引物（上海英濰捷基貿易有限公司）。

恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；恒溫振蕩器（上海一恒科技有限公司，THZ-98C）；顯微鏡（OLYMPUS，DP73）；PCR儀（Analytik Jena，Easy Cycler 96）；旋轉蒸發儀（上海申順生物科技有限公司，R-201）；氣相色譜質譜儀（SHIMADZU，QP2010 Plus）。

1.2方法

1.2.1培養基的配制

真菌PDA培養基與細菌LB培養基的配制參照文獻［7］。

1.2.2內生真菌的分離純化

取新鮮有柄石韋葉用自來水沖洗2h，經無菌水漂洗3遍后，用無菌濾紙吸干表面的水分。按無菌操作依次進行表面消毒：75%乙醇浸泡1 min，5.2%次氯酸鈉浸泡5min，75%乙醇浸泡0.5min，無菌水漂洗5次，無菌濾紙吸干表面水分。將處理后葉片剪成0.6cm×0.6cm的小塊貼于含氯霉素（34μg/mL）的PDA培養基表面，每個平板放置4片，于28℃條件下培養3～15d，以最后一次消毒所用無菌水涂布平板作為對照。待葉片周圍長出菌絲后，挑取菌絲頂端部分轉入PDA培養基（含氯霉素）中逐步純化，即得有柄石韋內生真菌，并于4℃保存備用。

1.2.3內生真菌S-34的形態觀察

將內生真菌S-34點接于PDA培養基上培養，分別觀察菌落形態及菌絲體顯微形態。

1.2.4內生真菌S-34的分子鑒定

按照真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取S-34的基因組DNA，以ITS1：5＇-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3＇、ITS4：5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇為通用引物［8］分別擴增內生真菌ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列。PCR反應體系為DNA模板4μL、上下游引物各2μL、Premix Taq 25μL、ddH2O 17μL。PCR反應條件為94℃預變性3min；94℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，循環30次；72℃延伸5 min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送由上海英濰捷基貿易有限公司進行測序。測序結果拼接后通過NCBI的BLAST平臺進行序列同源性分析，選取相似度高的序列進行Clustal W多重序列比對，采用軟件MEGA 6通過N-J法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹，自展值（Bootstrap）為1000。

1.2.5內生真菌S-34提取物的制備

取2塊直徑約6 mm的內生真菌S-34菌餅接種于裝有150 mL PDA培養基的300 mL搖瓶中，120r/min，28℃搖床培養8d。培養物以4層紗布過濾，得內生真菌發酵液和菌絲體。發酵液與乙酸乙酯等體積混合24 h后萃取3次，合并萃取液，乙酸乙酯相40℃減壓旋蒸濃縮至2mL，得發酵液乙酸乙酯提取物A；菌絲體經液氮充分研磨后用乙酸乙酯浸泡24 h，乙酸乙酯相40℃減壓旋蒸濃縮至2 mL，得菌絲體乙酸乙酯提取物B；酯提液分別經微孔膜（0.22μm）過濾除菌后于4℃保存備用。

1.2.6內生真菌S-34提取物抑菌活性的測定

采用微量稀釋法測定提取物的抑菌活性。先將已活化的各供試病原細菌轉接入LB液體培養基中，37℃培養過夜，用LB液體培養基稀釋至108CFU/mL。向96孔板中分別加入0，25，50，100 μL的提取物，用LB液體培養基補齊各孔至190μL，混勻后取10μL菌懸液加入各孔，37℃培養12h。將各孔培養物適當稀釋，取100 μL涂布平板，37℃培養24 h后進行菌落計數，重復3次。以乙酸乙酯作為提取物的陰性對照，以不加任何提取物作為空白對照。抑制率計算方法如下：

抑制率=（陰性對照菌落數-實驗組菌落數）/

空白對照菌落數×100%

1.2.7內生真菌S-34提取物的GC-MS檢測

采用GC-MS分別對內生真菌S-34提取物A與提取物B進行檢測，并初步分析其主要成分。GC-MS條件：載氣為氦氣，柱流量1.0 mL/min，進樣溫度290℃，進樣壓力49.5kPa，進樣體積1μL，分流比：10∶1。柱箱程序：初始溫度40℃，保持5min；以10℃/min升至100℃，保持5 min；以5℃/min升至200℃，保持5min；以10℃/min升至280℃，保持5min；以5℃/min升至300℃，保持5 min。離子源與接口溫度分別為200℃，220℃。電子能量70eV。全掃描范圍22～600m/z。溶劑延遲時間3.5min。

檢測時以PDA培養基乙酸乙酯提取物作為空白對照。

2　結果與分析

2.1內生真菌S-34的形態特征

有柄石韋葉經表面消毒，最后一次清洗所用無菌水涂布平板無雜菌長出，表明消毒徹底，分離到的真菌為有柄石韋的內生真菌。內生真菌S-34在PDA培養基上初期菌落為白色，后期逐漸變為灰褐色，絨毛狀，菌落邊緣較整齊，背面呈深墨綠色（見圖1（a））。S-34菌絲細長，有橫膈，末端有分支（見圖1（b），圖1（c））。

圖1　S-34菌落形態與顯微形態

2.2內生真菌S-34的ITS序列測定及系統進化樹構建

內生真菌S-34的ITS序列大小為566 bp。經BLAST比對顯示，S-34與鏈格孢屬（Alternaria sp.）具有較高同源性，其中與Alternaria brassicae W3（JF439450.1）相似性達99%。篩選與S-34同源性較高的序列通過N-J法構建系統進化樹（見圖2），結果顯示S-34與Alternaria brassicae W3處于同一分支，1000次自展分析完全支持該分支。

2.3內生真菌S-34提取物的抑菌活性測定

內生真菌S-34提取物對不同病原菌的抑制結果見表1、表2。提取物A與提取物B對6種供試病原細菌均有較好的抑菌效果，并隨提取物加入量的增加，抑菌效果增強。在提取物加入量為25 μL時，提取物A對藤黃微球菌的抑菌效果最好，抑菌率達71.02%，提取物B對志賀氏桿菌的抑菌效果最好，抑菌率達73.76%。對于革蘭氏陰性菌而言，提取物B的抑菌效果普遍強于提取物A，對于革蘭氏陽性菌而言，提取物A的抑菌效果普遍強于提取物B。

2.4內生真菌S-34提取物的GC-MS檢測與分析

根據GC-MS的分析結果，對比去除空白對照后，內生真菌S-34提取物A與提取物B分別檢測出26種、34種化合物，主要成分見表3、表4，各類物質所含化合物的數量與相對含量見圖3。由圖可知，提取物A主要包含5類物質，其中以烴類、醇類所含化合物種類最為豐富，分別檢測到8種烴類物質、6種醇類物質，以酸類、烴類、醇類的含量較高，分別占提取物A的21.24%、17.24%、13.34%。提取物B主要包含8類物質，其中以烴類、酯類所含化合物種類最為豐富，分別檢測到8種烴類物質、7種酯類物質，以酯類、烴類、脂類的含量較高，分別占提取物B的18.10%、16.91%、12.56%。

圖2　內生真菌S-34的系統進化樹

表1　內生真菌S-34提取物對病原菌的抑菌作用　CFU/mL

表2　內生真菌S-34提取物對病原菌的抑制率

表3　內生真菌S-34提取物A化學成分檢測結果

3　結束語

本文對新鮮有柄石韋的內生真菌進行分離純化，篩選出一株具有抑菌活性的內生真菌S-34，經形態學與分子學的方法，并結合ITS序列比對與系統進化樹的構建，鑒定其為鏈格孢屬（Alternaria sp.）。Ge［9］、田仁鵬［10］等分別從北方、南方紅豆杉中分離出產抗腫瘤活性物質紫杉醇的內生真菌鏈格孢屬。劉艷等［11］從海南粗榧中分離出產抗癌活性物質高三尖杉酯堿的內生真菌細極鏈格孢。蔡慶秀等［12］從藥用植物辣木中分離出一株內生真菌鏈格孢屬，其發酵液乙酸乙酯提取物的主要抑菌成分為鏈格苝醇。張弘馳等［13］從無花果內生真菌鏈格孢屬FL24的發酵液粗提物中分離出具有抗菌活性的麥角甾醇，與本研究的結果有相似之處。這表明鏈格孢屬作為植物的內生真菌，其代謝物中的活性成分十分豐富。

表4　內生真菌S-34提取物B化學成分檢測結果

圖3　內生真菌S-34提取物種類數量與相對含量

內生真菌S-34發酵上清液與菌體經乙酸乙酯提取后，對6種常見的供試病原細菌均具有明顯的抑制作用。利用GC-MS對兩種酯提物進行分析，結果表明其發酵上清液乙酸乙酯提取物的成分主要為酸類、烴類、醇類，這幾種物質所含化合物種類也相對較多，而菌體乙酸乙酯提取物的成分主要為酯類、烴類、脂類。兩種酯提物所含成分的不同可能導致其對不同病原菌的作用效果不同。

目前已有研究報道，有機酸類、醇類、脂類（甾醇等）具有抑菌效應。李舜等［14］利用苯甲酸與中藥抽提液進行復配，發現其抑菌效果顯著且優于單純中藥提取液。沈生強等［15］以氟苯甲酸為原料合成的化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌均具有較好的抑菌效果。梁海燕等［16］研究證明了苯乙醇的抗真菌能力。李玉珍等［17］從小麥中分離的抗毒素有效成分2，3-丁二醇對小麥赤霉具有較好的抑菌效力。本實驗所研究的內生真菌S-34發酵上清液乙酸乙酯提取物中也含有抑菌物質氟苯甲酸（20.86%）、苯乙醇（4.89%）與2，3-丁二醇（3.64%）。此外，內生真菌S-34菌體乙酸乙酯提取物中也檢測出6種具有抑菌活性的物質，分別是苯甲醛、亞麻醇、亞油酸單甘油酯、亞麻酰氯、反式角鯊烯、麥角甾醇［18-19］，其抑菌成分的總相對含量較高，達26.35%。這表明有柄石韋內生真菌S-34提取物中存在豐富的抑菌活性成分，可望與藥用植物研究相結合以推動藥用植物的可持續性開發利用。

［1］ABRAH?O MRE，MOLINAG，PASTORE GM. Endophytes：Recent developments in biotechnology and the potential for flavor production［J］.Food Research International，2013，52（1）：367-372.

［2］錢一鑫，康冀川，雷幫星，等.貴州白苞蒿抗腫瘤、抗氧化內生真菌的篩選與鑒定［J］.中國中藥雜志，2014，39（3）：438-441.

［3］TAO M H，CHEN Y C，WEI X Y，et al.Chemical constituentsoftheendophyticfungusPhomopsissp. A240 isolated from Taxus chinensis var.mairei［J］.Helvetica Chimica Acta，2014，97（3）：426-430.

［4］于淼，林筱，張連茹.一株紅豆杉內生真菌Xylariales sp.次級代謝產物的研究［J］.時珍國醫國藥，2016，27（2）：319-321.

［5］陳露，劉布鳴，馬軍花，等.中藥石韋的研究概況［J］.廣西醫學，2011，33（11）：1486-1489.

［6］陳麗君，馬永杰，李玉鵬，等.石韋屬植物化學和藥理研究進展［J］.安徽農業科學，2011，39（10）：5786-5787.

［7］沈萍，陳向東.微生物學實驗［M］.北京：高等教育出版社，2007：77-102.

［8］楊迎迎，熊智強，王勇.3種藥用植物內生真菌的多樣性分析及產生物堿菌株的篩選［J］.中國抗生素雜志，2013，38（12）：901-908.

［9］GE J P，PING W X，ZHOU D P.Characterization of a new species of taxol-producing fungus［J］.Nature and Science，2004，2（1）：85-88.

［10］田仁鵬，楊橋，周國玲，等.一株產紫杉醇的南方紅豆杉內生真菌的分離及分類研究［J］.植物科學學報，2006，24（6）：541-545.

［11］劉艷.海南粗榧內生真菌CH1307鑒定及其抗腫瘤活性研究［D］.海口：海南大學，2012.

［12］蔡慶秀，趙金浩，王佳瑩，等.辣木內生真菌LM033的分離鑒定及其代謝產物抗植物病原菌活性［J］.中國新藥雜志，2013（18）：2168-2173.

［13］張弘弛.無花果內生真菌次生代謝產物及抑菌活性的研究［D］.楊凌：西北農林科技大學，2007.

［14］李舜，李筱青，徐守云，等.苯甲酸復配中藥抽提液的抑菌效果及刺激性［J］.上海醫藥，2014（9）：017.

［15］沈生強，孫曉紅，劉源發，等.5-（4-氟苯基）-1，3，4-噁二唑-2-巰基乙酰腙類化合物的合成表征及生物活性［J］.化學通報，2014，77（3）：265-269.

［16］梁海燕，王國昌，秦雪峰，等.6種芳香族揮發性有機物對黃曲霉的抑菌作用［J］.環境與健康雜志，2013（2）：017.

［17］李玉珍，余露.小麥赤霉菌抗毒素有效成分的鑒定［J］.分析化學，1994，22（1）：87-89.

［18］王奎，馮穎，何釗，等.美洲大蠊中兩個有抑菌活性的單甘酯的研究［J］.時珍國醫國藥，2013，24（9）：2102-2103.

［19］JOEL E L，BHIMBA V.Isolation and characterization of secondary metabolites from the mangrove plant Rhizophoramucronata［J］.Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2010，3（8）：602-604.

（編輯：莫婕）

Identification of an endophytic fungus S-34 isolated from Pyrrosia petiolosa and analysis of its metabolites

LI Shu，LI Ningzhe，CHEN Chong，QI Panpan，SONG Liju，WU Daoyan，LIU Mingdong，WANG Xuege，ZHAO Jian
（Key Laboratory of Microbiological Resource and Technology，College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China）

An endophytic fungus S-34 which has antimicrobial activity was isolated from the leaves of the Chinese medicinal plant P.petiolosa through a tissue separating method and a microdilution method.The endophytic fungus S-34 was identified as Alternaria sp.according to the morphologic observation and ITS sequence analysis.Its metabolites were further studied with GC-MS.The findings show that the main antibacterial components of the fermentation liquid of S-34 extracted with ethyl acetate were fluorobenzoic acid（20.86%），phenylethyl alcohol（4.89%），2，3-butanediol（3.64%）.Besides，the main antibacterial components of the mycelia ethyl acetate extract were benzaldehyde（2.27%），linoleny alcohol（2.53%），9，12-octadecadienoicacid（Z，Z）-2，3-dihydroxypropyl ester（1.69%），9，12-octadecadienoylchloride，（Z，Z）-（9.28%），2，6，10，14，18，22-tetracosahexaene，2，6，10，15，19，23-hexamethyl-，（all-E）-（7.26%），neoergosterol（2.78%）.As indicated in the study above，the endophytic fungus S-34 of P.petiolosa contains plenty of antibacterial substances as potential resources for the development of natural medicines.

P.petiolosa；endophytic fungi；antimicrobial activities；metabolite；GC-MS

A

1674-5124（2016）05-0061-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.05.013

2016-01-15；

2016-02-13

國家自然科學基金（31270175）；教育部新世紀人才和川大優秀青年學者項目（NCET-13-0397，2013SCU04B14）

李姝（1991-），女，湖北宜昌市人，碩士研究生，專業方向為資源微生物應用。

趙建（1976-），男，江蘇揚州市人，教授，博士，主要從事資源微生物及微生物天然免疫研究。