抗菌金屬材料抗菌性能檢測方法研究

葉德萍，周李華，王　智，馬麗俠，譚和平

（中國測試技術研究院，四川 成都 610021）

抗菌金屬材料抗菌性能檢測方法研究

葉德萍，周李華，王智，馬麗俠，譚和平

（中國測試技術研究院，四川 成都 610021）

為建立檢測抗菌金屬材料的抗菌性能的方法。分別用ASTM E2149-13a法和ISO 22196——2011法對抗菌金屬的抗菌性能和適用性進行比對研究，得出這兩種方法都不太適合抗菌金屬材料的抗菌性能檢測。提出適宜于抗菌金屬及其制品的抗菌性能檢測方法：采用貼膜法，抗菌金屬材料與菌液的作用時間為2h。經實驗證明：該方法重復性好、再現性佳，3種不同抗菌劑處理的金屬材料抗菌率，其重復性分別為5.5%、5.6%和2.5%，同種抗菌劑處理的金屬材料抗菌率的再現性為5.5%，說明該方法能應用于抗菌金屬及相關材料抗菌性能檢測。

抗菌性能；金屬；檢測方法；抗菌材料

0　引　言

隨著社會生活資料的不斷豐富，人居環境的安全性及材料的抗菌功能日益受到重視；因此，新一代兼有抗菌性能的產品應運而生，在日常家具、廚具及衛生用品方面展示出廣闊的市場前景［1］。抗菌材料是指那些具有抑菌和殺菌性能的功能材料，與普通材料相比，抗菌產品具有衛生自潔功能，可免去許多清潔工作，能有效避免細菌傳播，減少交叉感染，對改善人們生活質量，保護健康具有重要意義［2］。

當前對于“抗菌材料”概念的過度炒作讓產品真假難辨，產品是否使用抗菌材料無從判斷，技術指標無法統一，技術質量監督和管理很困難，消費者的合法權益難以得到保障，對抗菌制品存在信任危機。所謂的抗菌材料是否真正具有抗菌效果，抗菌性能究竟如何？建立一種抗菌材料的抗菌性能檢測方法尤為重要。一方面可以規范市場，提升產品品質，另一方面則防止消費者掉入宣傳的套路中［3］。

我國雖有SN/T 2399——2010《抗菌金屬材料評價方法》［4］，但該標準內容完全參照JIS Z 2801——2000《抗菌測試標準》［5］進行，JIS Z 2801——2000只有紡織品和塑料的抗菌性能檢測方法。

本研究選擇可用于抗菌金屬抗菌性能檢測的標準ASTM E2149-13a［6］和ISO 22196——2011［7］進行復現，在此基礎上研究建立實驗室方法，并對該方法進行方法學考察，得出適合抗菌金屬材料的抗菌性能檢測方法。

1　材料及方法

1.1試劑、材料和菌株

營養肉湯、平板計數瓊脂培養基（購自北京陸橋技術有限公司）；緩沖液（0.3 mmol/L KH2PO4，自制）；覆蓋膜（聚乙烯薄膜，標準尺寸為（40±2）mm×（40±2）mm、厚度為0.05～0.10 mm，用70%乙醇溶液浸泡1min，再用無菌水沖洗，自然干燥）；菌種（大腸埃希氏菌Escherichia coli，ATCC 25922）。

1.2儀器和設備

培養箱（上海智誠ZSD-1270）；高壓蒸汽滅菌器（日本Tomy ES-315）；紫外分光光度計（日本島津UV-1700）；漩渦震蕩儀（廈門XW-80A）；水浴鍋（上海精宏DK-8B）。

1.3菌種活化與菌懸液制備

將E.coli保藏菌轉接到營養瓊脂培養基平板上，在（37±1）℃下培養24 h，后每天轉接1次，不超過2周。試驗時應采用連續轉接2次后的新鮮細菌培養物（24h內轉接的）。

用接種環從營養瓊脂培養基平板上取少量（刮1～2環）新鮮細菌，加入營養肉湯中培養18 h，菌液用磷酸鹽緩沖液稀釋，直至菌液在475nm的吸光度為0.28±0.02；菌液再用磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍，作為工作菌懸液。

1.4樣品

金屬片：分別采用表面經過抗菌處理（抗菌樣品）和未經抗菌處理（對照樣）的直徑5 cm圓形金屬片。

1.5抗菌性能檢測

1.5.1ASTM E2149-13a

分別將抗菌表面積約為25.8 cm2的抗菌金屬樣品和對照金屬樣品，切割成表面積0.5cm2的小片，放入250 mL滅菌三角燒瓶中，每個燒瓶加入（50± 0.5）mL工作菌懸液。并在另一個空三角燒瓶中加入（50±0.5）mL菌懸液作為菌液空白對照，立即對空白對照的菌液作梯度稀釋并利用平板計數法對菌的含量計數，稀釋過程不能超過5min。

將3個三角燒瓶放入恒溫振蕩器，用最大的震蕩速度震蕩（60±5）min，立即對每瓶菌液梯度稀釋至1000倍，并用平板計數法對每個梯度做菌落計數，每個梯度做3個平行，（36±1）℃培養24h。選擇30～300菌落數的平板進行計數，3個平行菌落數的平均數乘以稀釋倍數即為每毫升菌液的菌數。

1.5.2ISO 22196——2011

用平板計數法對工作菌懸液計數并作為菌液空白，同時分別取菌懸液0.2mL滴加在對照金屬片和抗菌金屬片上，對照金屬片做6個平行，每種抗菌金屬片樣品做3個平行，用滅菌鑷子夾起滅菌覆蓋膜分別覆蓋在對照金屬片和抗菌金屬片上，確保鋪平，使菌均勻接觸樣品，且菌液不要超過覆蓋膜邊緣。立即回收3個對照金屬片上的菌，用20mL磷酸緩沖液反復沖洗（最好用鑷子夾起薄膜沖洗）并收集液體，將收集液充分搖勻后，作梯度稀釋，取適宜稀釋的液體傾注平板計數瓊脂，在（36±1）℃下培養24 h后菌落計數，作為對照樣0h的菌落數。將剩余的3片對照金屬片和抗菌金屬片小心置于滅菌平皿中，在（36±1）℃、相對濕度大于90%條件下培養，培養24h。培養完成后取出培養的樣品，采用相同方法沖洗金屬片及覆蓋膜并對收集液做菌落計數。

1.5.3本文改進方法

同1.5.2，對照金屬片做9個平行，0，1，2 h的各培養3個并作菌落計數；每種抗菌金屬片樣品做6個平行，3個培養1h，3個培養2h并作菌落計數。

2　試驗結果及分析

ASTM E2149-13a方法的抗菌性能檢測結果見表1，將抗菌金屬片做了各種抗菌處理，但是幾乎沒有抗菌效果，雖然該方法提出可用于表面有抗菌劑的固體（如金屬片，塑料，玻璃，芯片，或類似堅硬表面的材質），但從本研究看來該方法不適合抗菌金屬片的檢測。

ISO 22196——2011法的抗菌性能檢測結果見表2，樣品在培養了24 h后，菌液基本干了，因此洗脫液培養后都無菌落生長，只有對照樣-3有9CFU，乘以稀釋倍數20，計算出該金屬片上的菌為180CFU，而其他金屬片則是＜20CFU。基于此在金屬片下墊一個無菌的材料作支撐，再在培養皿上滴5mL滅菌水，以保持平皿內的濕度，培養24h，此時金屬片與覆蓋膜之間的菌液未干，洗脫后作菌落計數，結果見表3，培養24h后從金屬片和覆蓋膜上洗脫下來的菌太多，有些甚至無法計數，說明平皿內濕度太高，又造成了菌的迅速增殖。

表1　ASTM E2149-13a法的抗菌性能檢測結果1）

表2　ISO 22196——2011法的抗菌性能檢測結果1）

表3　ISO 22196——2011法的抗菌性能檢測結果（裝金屬片的平皿內滴加滅菌水）1）

表4　本文改進方法的抗菌性能檢測結果1）

由于ISO 22196——2011法培養需要24 h，要保證洗脫的回收率（對照樣0h的菌落數與菌液空白菌落數的百分比不能低于75%，對照樣品接觸24h后的菌落計數應不低于0h菌落計數的1/100）和菌液培養24h不干，試驗的難度很大。基于此，將培養時間從24h縮短到了1h和2h，考察短時作用下抗菌金屬片的抗菌效果；若短時作用下，抗菌金屬片仍能達到很好的抗菌效果，則說明該金屬片的抗菌性能很好，而且也減少了試驗的難度，增加了試驗的準確性。由表4可以看出，處理樣隨著處理時間改為1～2 h，抗菌效果有提高。對照樣在1h時，菌落數下降不明顯，有些還有略微上升，這是因為菌有一定程度的增殖現象，而在2 h時菌落數下降很明顯，可能是隨著時間的增長，水分蒸發，細菌的死亡速度超過了增殖速度。

微生物在相同的條件其生長情況都有可能不同，為滿足試驗的重復性和再現性，每個樣品至少要做3個以上平行，每個數據的相對偏差不能大于15%。本研究中每個樣品（對照和抗菌樣）都做了3個平行，包括每種接觸時間都分別做了3個平行，但ISO 22196——2011法的重復性都不好，只有本文改進的方法滿足要求，1 h的抗菌率相對偏差為7.4%、5.5%和6.0%；2 h抗菌率相對偏差為5.5%、5.6%和2.5%；因此對抗菌效果最好的一種處理方法的抗菌材料做了再現性試驗。3次獨立的試驗，1 h的抗菌率分別為47%、32%和41%，相對偏差7.55%，未超過15%；2 h的抗菌率分別為71%、61%和59%，相對偏差5.48%也未超過15%，說明同種抗菌劑處理的金屬材料抗菌率的再現性為5.5%。

由上可知，培養2h比1 h的抗菌率高，基本能達到70%，而且2 h時菌液也未干，因此將2 h作為抗菌金屬抗菌性能檢測之反應時間（即作用時間），既能達到客觀評價抗菌制品的抗菌功能的目的，又能節省大量時間。解學魁［8］的研究也證明很多抗菌制品在與菌作用2h后抑菌率不再隨著作用時間的延長而明顯增加，如果延長作用時間，抑菌率雖可能有一定的提高，但卻大大增加了實驗時間，同時也為實驗的質量控制提高了難度。

3　結束語

ASTM E2149-13a將抗菌金屬片做了各種抗菌處理，但是幾乎沒有抗菌效果，雖然該標準提出可用于表面有抗菌劑的固體（如金屬片，塑料，玻璃，芯片，或類似有堅硬表面的材質）檢測，但從本研究看來該方法不適合抗菌金屬片，而本文改進方法相比ISO 22196——2011法時間縮短至2h，但抗菌率達到60%～70%。說明本文改進方法更適合用于抗菌金屬片的抗菌性能檢測。

［1］季君暉，史維明.抗菌材料［M］.北京：化學工業出版社，2003：46-60.

［2］劉秀英，呂斌，郭紅蓮，等.我國抗菌產品性能檢測標準體系現狀［J］.中國人造板，2009（8）：27-30.

［3］張曉，魯建國，劉皓男.家電產品抗菌、除菌檢測方法綜述［C］∥2012年中國家用電器技術大會集，2012：621-623.

［4］抗菌金屬材料評價方法：SN/T 2399—2010［S］.北京：中國質檢出版社，2010.

［5］Antimicrobial Products-Test for Antimicrobial Activity and Efficacy：JIS Z 2801—2000［S］.2000.

［6］Standard Test Method for Determining the Antimicrobial ActivityofimmobilizedAntimicrobialAgentsUnder Dynamic Contact Conditions：ASTM E2149-13a［S］.West Conshohocken：ASTM International，2010.

［7］Plastics-Measurement of antibacterial activity on plastics surfaces：ISO 22196—2011（E）［S］.2011.

［8］抗菌制品的抑菌效果檢測方法研究［J］.中國公共衛生，2001，17（7）：634-635.

（編輯：莫婕）

Study on detection method of antibacterial properties of antibacterial metallic materials

YE Deping，ZHOU Lihua，WANG Zhi，MA Lixia，TAN Heping
（National Institute of Measurement and Testing Technology，Chengdu 610021，China）

The purpose of this paper is to design a detection method for antibacterial properties of antibacterial metallic materials.The antibacterial properties were detected and the applicability thereof was comparatively studied with both the ASTM E2149-13a and ISO 22196——2011 methods.The outcome suggests that the two methods were unsuitable for testing the antibacterial properties of antibacterial metallic materials.Then，a scientific and reasonable detection method was put forward.First，the antibacterial metallic materials and bacterial liquid were mixed with the sticking membrane method to react for 2 hours.It is proved from the test results that this method is stable and highly reproductive.The repeatability of the antibacterial rates of metallic materials treatedby three different kinds of antibacterialagents is5.5%，5.6%and2.5% respectively.The reproducibility of the same kind of antibacterial agent is 5.5%.It suggests that the proposed method can be used to detect the antibacterial properties of antibacterial metal and related materials.

antibacterial property；metal；detection method；antibacterial materials

A

1674-5124（2016）05-0066-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.05.014

2016-02-03；

2016-03-13

2015國家科技支撐計劃項目（2015BAK45B00，2015BAK45B01）

葉德萍（1983-），女，四川鹽源縣人，助理研究員，主要從事微生物研究。

譚和平（1957-），男，重慶市人，研究員，享受國務院政府津貼專家，主要從事生物化學研究。