用CIA模型探討壯醫滾克陽證與陰證動物模型的建立

梁江洪　李鳳珍　龍朝陽　鐘麗雁　柏春暉　梁　艷　蔣桂江　王苑儷

廣西壯族自治區民族醫藥研究院,廣西　南寧　530001

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實驗研究

用CIA模型探討壯醫滾克陽證與陰證動物模型的建立

梁江洪李鳳珍*龍朝陽鐘麗雁柏春暉梁艷蔣桂江王苑儷

廣西壯族自治區民族醫藥研究院,廣西南寧530001

目的:以膠原誘導性關節炎(CIA)模型為基礎，附加模擬的風、寒、濕、熱環境，建立符合壯醫病因理論的動物模型。方法:將40只雌性Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、陽證組與陰證組每組各10只，除空白外均采用弗氏不完全佐劑和牛II型膠原蛋白誘導大鼠CAI模型，陽證組在每天附加風、濕、熱刺激持續1h，條件控制：風速5m/s，相對濕度90%，溫度(37±1)℃；陰證組每天附加風、寒、濕刺激持續1h，條件控制：風速5m/s，相對濕度90%，溫度(8±1)℃。比較各組大鼠關節炎-體長溫度差值、計算關節炎癥積分以及ELISA只測定TNF-α、IL-1β水平的差異結果:陰證組關節-體表溫度差值、炎癥指數方面均低于陽證組，差異有統計學意義(P<0.05)；陰證組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均低于陽證組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論:通過風、寒、濕刺激的CIA大鼠可做為陰證模型的參考，通過風、濕、熱刺激的CIA大鼠可做為陽證模型的參考。同時也存在造模復雜化、大鼠死亡率增的缺點，有待進一步完善。

動物模型；滾克；類風濕關節炎；陽證與陰證；壯醫

類風濕關節炎是臨床常見的自身免疫性疾病，其發病機制非常復雜，主要的病理表現為滑膜增生、炎癥細胞浸潤、血管翳形成并造成軟骨和骨質破壞[1-2]。目前常用CIA模型來研究類風濕關節炎的發病機制，但該模型的發生機制目前尚無定論，可以肯定：免疫系統對CⅡ的高度敏感性是該模型建立的主要原因[3]，細胞和體液免疫均參與了病理過程[4-5]。類風濕關節炎在壯醫的病名為滾克，緣由風、寒、濕、熱毒侵襲人體，阻滯三道兩路而致病，臨床辨證分為陽證、陰證。本研究嘗試以CIA模型為基礎，附加模擬的風、寒、濕、熱環境，建立符合壯醫病因理論的動物模型，為后續相關動物實驗提供參考。

1　材料和造模

1.1實驗材料SPF級雌性Wistar大鼠(生產許可證：SCXK2014-0002)，體重(110±20)g，購自廣西中醫藥大學實驗動物中心。牛Ⅱ型膠原蛋白(批號：150230)、弗氏不完全佐劑(批號：150207)、IL-1β(批號：1006-63)、TNF-α試劑盒(批號：1100-86)購于北京博蕾德生物科技有限公司。

1.2造模箱制作參考文獻[6]自制造模箱，以自行改裝的空調系統控制箱內溫度，以超聲霧化器霧化滅菌水控制箱內濕度，以鼓風機提供風源。1.3CIA大鼠造模方法在無菌條件下，用0.1mol/L冰醋酸充分溶解牛II型膠原蛋白，制成濃度為4mg/L溶液，再按1∶1體積與弗氏不完全佐劑混合、震蕩并充分乳化，制成CII乳劑，保存于4℃冰箱備用。試驗時每只大鼠CII乳劑0.25mL于頸、背、尾部分多點皮內注射致炎(初次免疫)，于7d后按上述方法再次免疫。

2　實驗分組及方法

40只大鼠，適應性飼養7d后，隨機選30只按上述方法造模，造模成功后再隨機分為模型組、陽證組、陰證組，每組10只；余下10只未造模大鼠為空白組。均于室溫(恒溫(20±2)℃，相對濕度50%～60%)下正常喂養。陽證組在首次接受膠原蛋白注射開始同時每天給予風、濕、熱刺激持續1h，條件控制：風速5m/s，相對濕度90%，溫度(37±1)℃；陰證組在首次接受膠原蛋白注射開始同時每天給予風、寒、濕刺激持續1h，條件控制：風速5m/s，相對濕度90%，溫度(8±1)℃。

3　觀察和指標

3.1關節-體表溫度差值各組大鼠以最腫脹關節體表溫度與腹部體表溫度差值進行比較。體表溫度測量方法，于室溫下，相同時間點用非接觸式紅外測溫儀在相同的距離內測量。

3.2關節炎癥積分采用關節炎指數積分法評定，評定依據為關節紅腫程度和范圍以及關節腫大和變形情況[7]。0分：無關節炎；1分：有紅色斑點或輕度腫脹；2分：關節部位中度腫脹；3分：關節嚴重腫脹；4分：關節嚴重腫脹且不能負重。每個肢體最高積分為4分，每只鼠最高積分為16分。3.3血清TNF-α、IL-1β含量于第1次膠原蛋白注射后的第22天，水合氯醛麻醉各組大鼠，腹主動脈采血，分離血清待測，未測的血清放入-4℃低溫冰箱保存。IL-1β、TNF-α均采用ELISA法，按照試劑盒說明書進行。

4　統計學處理

5　結果

5.1關節表面-體表溫差關節表面-體表溫差(簡稱差值)比較，空白組大鼠膝關節表面溫度均低于體表溫度，與模型組比較，差值明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01)。陰證組差值小于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)，表明陰證組關節表面溫差低于模型組；陽證組差值與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，表明陽證組關節表面溫差與模型組相當；陰證組差值與陽證組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，表明陰證組關節表面溫差低于陽證組。見表1。5.2關節炎癥指數空白組炎癥指數為0，與模型組比較，炎癥指數增高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，陽證組關節炎癥指數差異無統計學意義(P>0.05)，陰證組關節炎癥指數小于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)，表明陰證組關節炎癥程度低于模型組。與陽證組比較，陰證組關節炎癥指數小于陽證組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明陰證組關節炎癥指數小于陽證組。見表1。

表1　關節表面-體表溫度差、炎癥指數　±s)

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01，#P<0.05；與陽證組比較，△△P<0.05。

5.3炎癥因子與空白組比較，模型組TNF-α、IL-1β值均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，陽證組TNF-α、IL-1β統計學差異(P>0.05)，陰證組TNF-α、IL-1β值小于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明陰證組TNF-α、IL-1β水平低于模型組。與陽證組比較，陰證組TNF-α、IL-1β值小于陽證組，差異有統計學意義(P<0.01)，表明陰證組TNF-α、IL-1β水平明顯低于陽證組。見表2。

表2　血清中TNF-α、IL-1β含量

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與陽證組比較，##P<0.01。

6　結論

本研究結果表明，陰證組關節-體表溫度差值、炎癥指數方面均低于陽證組(P<0.05)，陰證組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均低于陽證組(P<0.05)。表明在比較成熟的CIA模型基礎上，附加風、寒、濕、熱等外界刺激，會對模型大鼠產生影響：通過風、寒、濕刺激的模型大鼠可做為陰證模型的參考；通過風、濕、熱刺激的模型大鼠可做為陽證模型的參考。同時，結果表明，陽證組與模型組在表溫度差值、炎癥指數、血清TNF-α和IL-1β水平方面無統計學意義(P>0.05)，可說明CIA急性期多表現為陽證。本研究探索在CIA模型基礎上建立壯醫滾克病因學說中的陰、陽兩證模型取得初步成效，同時也存在造模復雜化、大鼠死亡率增高的缺點，有待進一步完善。

[1]ScottDL, Wolfe F, Huizinga TW, et al. Rheumatoid arthritis[J].Lancet， 2010，376(9746),1094-1108.

[2]Kourilovitch M, Galarza-Maldonado C, Ortiz-Prado E3.Diagnosis and classification of rheumatoid arthritis[J]. Journal of Autoimmunity， 2014,48-49:26-30.

[3]Trentham D E,Townes A S,Kang A H.Autoimmunity to typeⅡcolla-gen:an experimental model of arthritis[J].J Exp Med,1977,146:857-866.

[4]湯文璐,李俊,徐叔云.Ⅱ型膠原性關節炎動物模型的研究概況[J].中國藥理學通報,1998,14(6):495-498.

[5]陳柏松,徐玉東,鐘淑琦,等.大鼠佐劑性關節炎模型的建立與評價[J].哈爾濱醫科大學學報,2005,39(6):489-491.

[6]肖長虹,顧為望,李留洋,等.類風濕性關節炎風寒濕痹與風濕熱痹動物模型的研究[J].中醫雜志,1996,37(8):492-496.

[7]張鈞用.現代藥理實驗方法[M].北京：北京大學，中國協和醫科大學聯合出版社，1998:1383.

(編輯：梁志慶)

2016-06-23

廣西科學研究與技術開發計劃課題(桂科攻13349006)。

梁江洪(1962-)，女，壯族，大學本科，副主任醫師，從事風濕病的壯醫診治研究，E-mail:gxzyyyfsk2006@163.com

李鳳珍(1967-)，女，壯族，大學本科，主任醫師，從事風濕病的壯醫診治研究，E-mail:lifengzhen2005@163.com

R965.1

A

1007-8517(2016)17-0025-02