糖尿病心肌PTEN蛋白表達變化及其在糖尿病心肌IPo中的影響

梁德賢　李慶軍　陳康榮

廣東省湛江中心人民醫院心血管內科， 廣東　湛江　524037

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糖尿病心肌PTEN蛋白表達變化及其在糖尿病心肌IPo中的影響

梁德賢李慶軍陳康榮

廣東省湛江中心人民醫院心血管內科， 廣東湛江524037

目的：分析糖尿病心肌PTEN 蛋白表達變化及其在糖尿病心肌IPo 中的作用。方法：選取健康成年SD 大鼠，腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)(60mg/kg)誘導糖尿病模型。對照組給予等量的生理鹽水。將糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠隨機分為3組：假手術組(Sham)；缺血/再灌注組(IR)；缺血后處理組(IPo)。部分亞組糖尿病大鼠在缺血前1h 用PTEN 抑制劑BPV(HOpic)干預后再進行缺血/再灌注損傷實驗。免疫組化方法分析心肌PTEN、PI-3K、p-Akt 的表達；TTC 法檢測心肌梗死面積；TUNEL 法檢測心肌細胞凋亡。比較非糖尿病與糖尿病組及BPV 干預前后糖尿病各組相應指標的變化。結果：IPo明顯降低了非糖尿病鼠心肌細胞中PTEN的表達，增加了PI-3K 和p-Akt 的表達，但未能減少PTEN在糖尿病鼠心肌中的表達，相應的PI-3K 和p-Akt 的表達也無明顯改變。與N+S 組相比，N+IR 及N+IPo 組的凋亡指數增高(P<0.05)。但是經后處理干預后N+IPo組的凋亡指數低于N+IR 組(P<0.05)。與DM+S組相比，DM+IR及DM+IPo組的凋亡指數增高(P<0.05)，但后處理并沒有減少糖尿病心肌的凋亡指數。與N+IR 相比，N+IPo的梗死面積減少(P<0.05)。然而，DM+IR組與DM+IPo組的梗死面積無統計學差異(P>0.05)。BPV干預各組的心肌PI-3K 及P-Akt 的表達高于未干預各組(P<0.05)。與未經BPV干預的各組相比，被干預各組的心肌凋亡細胞減少。心肌梗死面積比較BPV干預的各組心肌梗死減少。結論：高血糖導致心肌PTEN 高表達使PI-3K/Akt 信號通路失活，是導致IPo對心肌IRI保護作用喪失的一個重要原因。

糖尿病；缺血再灌注損傷；缺血后處理；PTEN；BPV

有研究發現PTEN(Phosohatase and tensin homologdeleted on chromosometen, PTEN)是PI-3K/Akt信號通路的負性調控因子[1-2]。它起初被發現是一種腫瘤抑制基因。后來越來越多的研究發現它在調節細胞增殖、生長和凋亡中也起到重要作用[3-4]。有研究顯示，與非糖尿病大鼠相比，糖尿病大鼠體內PTEN的表達明顯增多，并會隨著病程的延長增加其表達的程度[5]。增加PTEN的活性會使胰島素的敏感性下降，并且會增加2型糖尿病的風險[6]。Mensah等人[7]實驗證明，通過阿托伐他汀進行IPC，可通過激活PI-3K/Akt信號通路，對非糖尿病大鼠心肌IRI產生保護作用，但對糖尿病大鼠心肌IRI的療效顯著降低，其主要原因是由于PTEN的拮抗作用。Crackower[8]等人通過對PTEN半量表達的PTEN+/-小鼠離體心臟的研究表明，在PTEN+/-的小鼠體內，Akt的活性明顯增加，經4周期的預處理PTEN+/-組的心肌梗死面積明顯小于6周期預處理的PTEN+/+對照組。因此可以看出PTEN在糖尿病心肌IRI中也扮演著重要的角色。然而關于PTEN 在缺血后處理(Ischemic postconditioning, IPo)的作用機制中發揮著怎樣的作用，以及IPo 對糖尿病心肌IRI 保護作用的消失是否與糖尿病心肌中PTEN 高表達有關，現在還不十分清楚。因此，本研究擬探討糖尿病心肌PTEN 蛋白表達變化及其在糖尿病心肌IPo中的作用。對比IPo對糖尿病和非糖尿病心肌PTEN/PI-3K/Akt信號通路的影響情況，及其對心肌IRI 的改善情況；觀察抑制PTEN 的表達是否能改善糖尿病心肌的損傷程度；證明糖尿病心肌PTEN 的高表達是導致心肌IRI 耐受力降低和IPo 保護作用消失的重要原因。

1　材料與方法

1.1材料實驗動物：220～280g 成年SD 大鼠130 只，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。主要試劑及儀器：SureStep血糖儀、血糖試紙(美國強生公司)；Bene View T5型監護儀(西安巨田醫療設備有限公司)；DW-2000型動物呼吸機(上海嘉鵬科技有限公司)；高精度電子天平(精度0.0001g，上海越平科學儀器有限公司)；SHHW21Gr600恒溫水浴箱(北京長安科學儀器廠)；Olympus顯微鏡(日本Olympus公司)；Olympus BX50顯微攝影系統(日本Olympus公司)；EPSON-V30掃描儀(日本Epson公司)；Image-ProPlus6.0計算機圖像分析軟件(美國Media Cybernetics)；鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)，美國Sigma公司；戊巴比妥鈉(Pentobarbital)，美國Sigma公司；伊文氏藍(Evans blue)，美國Sigma公司；三苯基氯化四氮唑(TTC)，美國Sigma公司；Bpv(HOpic)，瑞士Alexis公司；PTEN單克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司；PI3K(P85α亞型)單克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司；P-Akt(Ser-473)單克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司；免疫組化試劑盒，武漢博士德生物制品有限公司；TUNEL試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2方法糖尿病大鼠及非糖尿病大鼠模型的建立：220～280g 成年SD 大鼠130只，喂養一周后，隨機分為糖尿病組(n=90)和非糖尿病組(n=40)，所有大鼠禁食12小時。腹腔注射1%STZ 60mg/kg 誘導糖尿病模型，非糖尿病組的大鼠腹腔注射等量的生理鹽水，其余操作同糖尿病組大鼠。72h 后禁食4h，斷尾取血測空腹血糖。當血糖濃度≥16.7mmol/L，并且出現多飲、多食、多尿的癥狀表示糖尿病鼠模型誘導成功。模型成功后監測大鼠血糖和體重，每2周一次。所有大鼠普食喂養8周。8周后進行手術。淘汰標準：①血糖濃度<16.7mmol/L 的大鼠,②飼養過程中死亡的大鼠。

實驗分組：造模成功的糖尿病和非糖尿病大鼠隨機分為9 組，實驗過程中剔除造模未成功和手術過程中死亡的模型，具體實驗分組如下：非糖尿病+假手術組(N+S 組):n=9；糖尿病+假手術組(DM+S 組):n=9；非糖尿病+缺血再灌注組(N+IR 組)*:n=15；糖尿病+缺血再灌注組(DM+IR 組)*:n=15；非糖尿病+缺血后處理組(N+IPo組)*:n=15；糖尿病+缺血后處理組(DM+IPo組)*:n=15；糖尿病+假手術組+抑制劑組(B+DM+S 組)*:n=9；糖尿病+缺血再灌注+抑制劑組(B+DM+IR 組)*:n=15；糖尿病+缺血后處理+抑制劑組(B+DM+IPo 組)*:n=15。以上標有“*”的各組中6 個心臟標本用于TTC，另外9 個和非“*”的各組標本全部用于組織包埋。

組織學方法(HE 染色)：心臟組織切片放入二甲苯中脫蠟10min，無水酒精洗去二甲苯。經蘇木精染色3min，1%鹽酸酒精分化20s，1%稀氨水返藍30s，伊紅水溶液復染1min 后完成染色。染色好的玻片經過梯度酒精脫水，二甲苯透明后用中性樹膠封片。最后光鏡下觀察染色結果：細胞核呈蘭色, 胞漿呈紅色。

PTEN、PI-3K、p-Akt(Ser473)免疫組化測定及TUNEL 法檢測心肌細胞凋亡。實驗步驟嚴格按照免疫組化試劑盒說明書進行。

心肌梗死面積檢測(TTC 法)：參照文獻[9]方法進行，用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件勾勒出每片薄片的缺血區、梗死區及總面積，得出的梗死面積百分比。心梗死面積百分比=心肌梗死區面積/心肌缺血區面積×100%。

2　結果

2.1糖尿病大鼠與非糖尿大鼠血糖水平及體重比較兩組大鼠在相同的環境下飼養8 周，其中有7 只糖尿病大鼠和1 只非糖尿病大鼠在飼養的過程中死亡，5 只大鼠糖尿病造模未成功,因此予以淘汰。8 周后糖尿病與非糖尿病大鼠在外觀形態上已有明顯區別。糖尿病大鼠毛色暗黃、精神欠佳、行動遲緩、體型明顯小于非糖尿病大鼠,并表現出多飲、多食、多尿的癥狀。非糖尿病大鼠體重明顯增加，毛色亮白，行動靈敏且活躍。飼養8 周后的糖尿病大鼠平均體重為(257.30±47.68)g，4h 平均空腹血糖為(27.17±3.36)mmol/L；非糖尿病大鼠平均體重為(476.46±23.45)g,4h 平均空腹血糖為(3.77±0.33)mmol/L。兩組大鼠的平均體重及平均空腹血糖濃度差異有統計學意義(P<0.05)，具有可比性。2.2心肌組織病理學變化HE 染色后光鏡下觀察，N+S 組大鼠的心肌細胞排整齊有序，結構清晰，細胞顏色均勻，無細胞變性、壞死；DM+S 組大鼠的心肌細胞表現出輕度腫脹，排列紊亂，肌原纖維斷裂，并有炎性細胞浸潤，部分心肌中出現少量脂肪顆粒；N+IR組大鼠的心肌細胞明顯腫脹，并有局灶性的出血、壞死，壞死灶周圍多伴有大量炎性細胞浸潤。N+IPo 組大鼠的心肌細胞雖也有腫脹、局灶性變性、壞死及炎性細胞浸潤，但程度稍輕于N+IR 組；DM+IR 組及DM+IPo 組大鼠心肌的損傷程度明顯高于其它各組。心肌細胞明顯水腫，排列嚴重紊亂，大量變性、壞死，肌纖維嚴重斷裂，部分心肌細胞出現脂肪顆粒,間質充血水腫并伴有大量炎性細胞浸潤，兩組大鼠間心肌的病理變化形態學顯差異。見圖1。

2.3各組心肌細胞中PTEN、PI-3K、p-Akt(Ser473)的表達情況與非糖尿病各組相比，未用抑制劑的糖尿病各組PTEN的表達明顯增高差異具有統計學意義(P<0.05)。IPo 明顯降低了非糖尿病鼠心肌細胞中PTEN 的表達，并增加了PI-3K和p-Akt 的表達差異具有統計學意義(P<0.05)，但未能減少PTEN 在糖尿病鼠心肌中的表達，相應PI-3K 和p-Akt 的表達也無統計學差異(P>0.05)。由此可以看出，糖尿病心肌PTEN 的表達明顯高于非糖尿病心肌；PI-3K/Akt 信號通路在IPo 的非糖尿病心肌中被激活，而在糖尿病心肌中處于被抑制狀態。見表1。

分組PTENPI-3KP-AktN+S0.101±0.0100.076±0.0200.65±0.020DM+S0.129±0.0130.104±0.0260.102±0.017N+IR0.148±0.023*0.112±0.020*0.115±0.021*DM+IR0.169±0.009☆0.085±0.018☆0.085±0.021☆N+IPo0.134±0.024#0.142±0.027#0.137±0.020#DM+IPo0.160±0.0110.084±0.0120.096±0.164

注：與N+S 相比，*P<0.05；與N+IR 組相比，#P<0.05；與DM+S 組相比，☆P<0.05。

2.4心肌細胞凋亡指數與N+S 組相比，N+IR 及N+IPo 組的凋亡指數增高具有統計學意義(P<0.05)，但是經后處理干預后N+IPo 組的凋亡指數低于N+IR組，差異具有統計學意義(P<0.05)。與DM+S 組相比DM+IR及DM+IPo組的凋亡指數明顯增高，差異具有統計學意義(P<0.05)，但與非糖尿病組相反，后處理并沒有減少糖尿病IRI的凋亡指數差異無統計學意義(P>0.05)，由此可見，IPo 并沒有改善IRI 所致的糖尿病心肌細胞凋亡的情況。見表2。2.5心肌梗死面積比較與N+IR 相組比，N+IPo組的梗死面積明顯減少，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明IPo 可以明顯減少非糖尿病鼠心肌缺血/再灌注后的梗死面積。然而IPo 卻未能減少糖尿病鼠心肌的心梗面積，DM+IR 組與DM+IPo 組的心肌梗死面積無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2　糖尿病(無BPV 干預)和非糖尿病各組凋亡指數和心梗面積的比較　±s)

注：與N+S 組相比，☆P<0.05；與DM+S 組相比，#P<0.05；與N+IR 組相比，*P<0.05。

2.6糖尿病BPV干預組及無干預組實驗結果的比較,B+DM+IR 組及B+DM+IPo 組大鼠心肌細胞比未經抑制劑干預組大鼠的心肌細胞的損傷程度均有所改善。雖然也有細胞水腫，壞死，心肌纖維斷裂、排列紊亂。但程度略輕于未經BPV 干預組。還觀察到炎性細胞也相對減少。見圖2。經過BPV 干預后，B+DM+S 組中有5 例(占該組的56%)，B+DM+IR 組中有6 例(占該組的67%)B+DM+IPo 組中有4例(占該組的44%)PTEN 表達在細胞核，胞漿中幾乎沒有什么表達。而未經BPV干預的各組PTEN 均表達在胞漿。見圖3。

BPV干預各組的心肌PI-3K及P-Akt的表達明顯高于未干預各組,差異具有統計學意義(P<0.05)。BPV干預后的缺血/再灌注組與后處理組之間無統計學差異(P>0.05)。但在B+DM+S 組心肌PI-3K 及P-Akt 的表達還是高于這兩組。從這一結果可以看出，BPV 對PTEN功能的抑制作用可明顯增加PI-3K、P-Akt 的表達；BPV干預后的各組PI-3K 和P-Akt的表達仍然維持原有的趨勢，所以BPV 可能并沒有完全阻斷PTEN 的作用。見表3。

分組PI-3KP-AktDM+S0.106±0.0200.105±0.020DM+IR0.074±0.026*0.082±0.017*DM+IPo0.072±0.020*0.075±0.021*B+DM+S0.175±0.018#0.178±0.021☆B+DM+IR0.148±0.027△0.153±0.020#B+DM+IPo0.144±0.012△0.146±0.164△

注：與DM+S組相比，#P<0.05；與標有“*”的組相比，△P<0.05。

與未經BPV 干預的各組相比，被干預各組的心肌凋亡細胞明顯減少(P<0.05)。 B+DM+IR 與B+DM+IPo 組相比凋亡指數無明顯區別(P>0.05)。B+DM+S 組的凋亡指數明顯低于其他各組。見表4。

表4糖尿病BPV干預和未干預各組細胞凋亡指數、心肌梗死面積比較

分組凋亡指數/%心梗面積/%DM+S14.22±0.81—DM+IR25.20±1.01*48.52±2.19DM+IPo27.77±0.10*49.10±2.07B+DM+S3.34±1.53#—B+DM+IR16.69±1.90△29.02±3.11B+DM+IPo18.53±1.49△32.49±2.79

注：與DM+S 相比，#P<0.05；與標有“*”的組相比，△P<0.05。

BPV 干預的各組心肌梗死面積明顯減少(P<0.05)。而BPV干預的兩組之間的心肌梗死面積無明顯區別。見表4。

3　討論

研究發現，支配缺血心肌的血管如果再通后反而會對缺血心肌造成再次損傷，即心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, IRI)，這反而加重了心肌細胞的凋亡和壞死，是再灌注的血液對缺血心肌造成的一種不可逆損傷[9]。糖尿病患者對這種損傷的敏感程度更為明顯。臨床研究顯示，在心肌缺血再灌注治療后，有30～70%的糖尿病患者比非糖尿病患者的心肌梗死面積大[10],與實驗結果一致。與非糖尿病大鼠相比，缺血再灌注對糖尿病大鼠心肌的損害程度更明顯。促使糖尿病心肌IRI加重一個重要原因就是PI-3K/Akt信號通路的失活[11]。糖尿病不但會使心肌細胞缺血再灌注后的損傷程度更加嚴重，還會使其保護性干預(IPo、IPC等)的效果減弱或消失[12]。缺血后處理(Ischemic postconditioning,IPo)是一種通過激發機體內源性保護機制來對抗心肌IRI的方法。由于它操作簡便且效果顯著，現在已被越來越頻繁地應用于臨床治療。在IPo的作用機制中，PI-3K/Akt信號通路的激活發揮著重要的作用。然而有研究認為，IPo對糖尿病患者心肌IRI的保護作用明顯很弱，甚至消失。這可能與糖尿病患者的血糖水平相關[13]。本研究的結果和Ferdinandy都認為PI-3K/Akt信號轉導通路功能障礙是IPo對糖尿病患者保護效應喪失的原因[14]。除此之外本研究還發現，PTEN的高表達是導致PI-3K/Akt信號轉導通路功能障礙，進而使心肌對IRI耐受力降低和對IPO保護作用敏感性降低的重要原因。

10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)是PI-3K/Akt信號通路的負性調控因子，它最早是作為一種抑癌基因在1997年被發現的。其轉錄產物是一種膜結合型脂質磷酸酶，作為腫瘤抑制因子在多種系統中下調PIP3的表達，并在胚胎發育、細胞生長、分化、凋亡和遷移的調控中發揮重要的作用。PTEN具有PI-3K活性，能拮抗PI-3K的作用，通過催化PIP3的3位脫磷酸下調PIP3的水平。然而在心肌細胞中PI-3K/PTEN傳導系統無論在空間結構及功能上均能相互制約。有研究發現[25]，缺血缺氧可導致神經細胞中PTEN的表達增高，并導致一定程度的神經損傷，而抑制PTEN的表達可產生明顯的神經保護作用。因此我們可以看出，PTEN在IRI中也扮演著重要角色。

本研究發現，在非糖尿病模型中，缺血/再灌注雖然能激活PTEN/PI-3K/Akt信號通路而產生心肌損傷，但IPo可通過拮抗PTEN/PI-3K/Akt信號通路，改善心肌IRI的情況。在糖尿病模型中，PTEN在心肌中的表達高于非糖尿病組(P<0.05)；IPo對PTEN/PI-3K/Akt信號通路并沒有表現出抑制作用，PTEN在糖尿病心肌中依然呈現出高表達的狀態，心肌IRI的情況也沒有得到改善。因此我們設想，PTEN的持續高表達就是導致糖尿病心肌對IPo敏感性降低的重要原因,抑制糖尿病心肌中PTEN蛋白的活性有助于恢復糖尿病心肌對IPo的敏感性。

PTEN普遍存在于正常細胞中，其表達的程度和活性取決于它在細胞中的水平及其與其它蛋白或脂質的相互作用。有人認為PTEN磷酸化后會產生與之前相反的作用。BPV(HOpic)是PTEN特異性的抑制劑，它是一種釩的化合物，它的主要作用是結合到PTEN酪氨酸的磷酸位點上，使PTEN磷酸化。從而恢復PI-3K/Akt信號通路的活性。Keyes等[9]人研究了BPV(HOpic)在心肌缺血再灌注大鼠模型中抑制PTEN的最佳時間點和最佳劑量，發現在缺血前1h靜脈注射BPV1mg/kg可以最大限度的抑制PTEN在心肌中的表達。筆者在糖尿病模型上使用了相同的方法，發現抑制PTEN的表達可以重新恢復PI-3K/Akt信號通路的活性，并且減少心梗面積和心肌細胞的凋亡。因此筆者認為，糖尿病心肌中PTEN的高表達是導致心肌IRI損傷及IPo作用喪失的重要原因。在實驗中筆者還意外的發現，經抑制劑干預后的糖尿病心肌，PTEN蛋白有明顯向細胞核內轉移的趨勢。然而這一現象的產生是否與其產生的心肌保護作用有關，還有待進一步的研究。

本實驗通過對比IPo對正常大鼠和糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注的保護作用，發現經IPo干預后的糖尿病心肌PTEN仍然持續高表達，糖尿病狀態下心肌對IPo敏感性降低與PTEN增高所導致的PI-3K/Akt信號通路失活有關，抑制心肌PTEN的活性可恢復糖尿病心肌對IPo的敏感性。探討PTEN在糖尿病心肌IPo中的作用和機制為進一步研究糖尿病心肌缺血再灌注損傷及缺血后處理的相關機制提供了理論依據。

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(編輯：梁志慶)

To investigate the changes of PTEN protein expression in diabetic myocardium and its effect on IPo in diabetic myocardium

LIANG DexianLI QingjunCHEN Kangrong

Cardiovascular department of internal medicine, Zhanjiang People′s Central Hospital,ZhanJiang 524037,China

Objective Explore the expression of PTEN protein in diabetic myocardium and the role of PTEN protein in IPo of the diabetes myocardial.Method This experiment used healthy adult male SD rats .The diabetic model was induced by intraperitoneal injection of 1% streptozotocin(STZ) (60mg/kg). The control group was given equivalent liposomes saline.The changes of blood glucose and body weight were measured after 8 week.The diabetes and non-diabetic rats were randomly divided into 3 groups: sham operated group(S); ischemia reperfusion group(IR); ischemic postconditioning group(IPo).Some of diabetes rats are first intervene by PTEN inhibitors 1 hours before ischemia.Immunohistochemical method was for the determination of PTEN, PI-3K,P-Akt expression.Infarct size was assessed by triphenyl-tetrazolium-chloride (TTC) staining. Cardiomyocyte apoptosis was detected by TUNEL method.After the experiment, measure compare and analyse the changes of the relevant indicators.Result IPO significantly reduced the expression of PTEN in non diabetic rat myocardial cells, increased PI-3K and p-Akt expression, but can not decrease the expression of PTEN in the myocardium of diabetic rats and corresponding PI-3K and p-Akt expression no obvious change. Compared with the N+S group, the apoptotic index of N+IR and N+IPo group were significantly higher (P<0.05). However, the apoptotic index of N+IPo group was significantly lower than that of N+IR group (P<0.05). Compared with the DM+IR group, the apoptotic index of DM+S and DM+IPo groups was significantly higher (P<0.05), but the latter did not reduce the myocardial apoptosis index of diabetic patients. Compared with N+IPo, the infarct size of N+IR was significantly decreased (P<0.05). However, there was no significant difference in infarct size between DM+IR group and DM+IPo group (P>0.05). The expression of PI-3K and P-Akt in the myocardium of BPV intervention group were significantly higher than those in the intervention group. Compared with the untreated group, the apoptotic cells were significantly decreased in the groups of BPV. Myocardial infarct size was significantly reduced in all groups of BPV intervention.Conclusion The high expression of myocardial PTEN caused by high blood sugar is an important factor to cause the inactivate PI-3K/Akt signaling pathway and lead to the declined protection of IPo on myocardial IRI.

Diabetes; Ischemia-reperfusion Injury;Ischemic Postconditioning; PTEN; BPV

2016-05-11

湛江市科技攻關計劃項目，NO:2013B01031。

梁德賢(1971-)，本科，研究方向為心血管疾病的診療。E-mail：fhq000@126.com

R587.1

A

1007-8517(2016)17-0032-05