Slit/Robo信號通路在胰腺癌細胞中的表達及其對胰腺癌細胞生長的影響

梁剛　何盟國　馬清涌

1陜西核工業215醫院肝膽外一科病區，陜西咸陽712000

2西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科，陜西西安710000

Slit/Robo信號通路在胰腺癌細胞中的表達及其對胰腺癌細胞生長的影響

梁剛1何盟國1馬清涌2#

1陜西核工業215醫院肝膽外一科病區，陜西咸陽712000

2西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科，陜西西安710000

目的探討Slit/Robo信號通路在胰腺癌細胞中的表達情況，及其對胰腺癌細胞增殖的影響。方法分別采用RT-PCR、免疫細胞化學、免疫熒光方法檢測胰腺癌細胞株BxPC-3、Panc-1中Slit和Robo的表達；通過Slit/Robo信號通路阻斷劑RoboN阻斷該通路，采用MTT法觀察其對細胞生長的影響。結果胰腺癌細胞株Bx-PC-3、Panc-1中存在著Slit2、Robo1基因和蛋白表達；在RoboN的作用下，胰腺癌細胞體外生長受到抑制，增殖能力下降。結論胰腺癌細胞中可能存在著Slit2/Robo1信號通路，它能夠負性調節胰腺癌細胞的生長，提示Slit/ Robo信號通路可能參與了胰腺癌的發生發展的過程。

Slit/Robo信號通路；胰腺癌細胞；細胞生長

1　材料與方法

1.1實驗材料

人胰腺癌細胞株BxPC-3（中度分化）、Panc-1（低分化），由西安交通大學醫學院肝膽外科實驗室提供；兔抗人Slit2多克隆抗體（博士德生物工程有限公司）；兔抗人Robo1多克隆抗體（Abcam公司）；阻斷劑Robo1（N-20）P（RoboN，Santa Cruz Biotechnology）；MTT試劑（西唐生物科技有限公司）；引物由北京三博志遠生物工程技術服務有限公司合成：Slit2：P1 5-CTGTAACTGCTACCTGGCTTGG-3（2205-），P25-ACTCTGTGACATCTCTTGGAATACC-3（-2497）；product：275 bp。

Robo1：P1 5-CCTACTCCTTACGCCACCACTC-（34054-），P25-GCCACTTCTTGTTTCTGCTGTCC-3（-4175）；product：122 bp。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養人胰腺癌細胞株BxPC-3、Panc-1用含10%新生牛血清的DMEM培養基，培養于含5%CO2、37℃恒溫、飽和濕度培養箱中。

1.2.2RT-PCR法檢測各組細胞中Slit、Robo基因表達分別提取胰腺癌細胞株BxPC-3、Panc-1中細胞總RNA，將其逆轉錄成cDNA，將Slit2、Robo1

引物稀釋至工作濃度100 pmol/μl，按照PCR反應體系加入引物及cDNA合成DNA，最后通過瓊脂糖凝膠電泳得到目的基因條帶。

1.2.3免疫細胞化學法檢測Slit2、Robo1蛋白在各組細胞中的表達取對數生長細胞，將其接種于鋪有蓋玻片的24孔培養板中，待細胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定，中性樹膠固定蓋玻片，滴加0.5%Tritonx-100、3%H2O2，血清封閉，滴加一抗（PBS配制，濕盒）4℃孵育過夜，滴加生物素化的二抗孵育（濕盒），DAB顯色，蘇木素復染，脫水，固定，拍照。陰性對照組免去一抗滴加。陽性結果判斷標準：光鏡下觀察到以細胞質內有棕褐色細顆粒染色為陽性信號。

1.2.4免疫熒光染色法檢測Slit2、Robo1蛋白在各組細胞中的表達免疫熒光法步驟大體同免疫組化法，不同的是：在滴加一抗過夜后，滴加熒光標記的二抗工作液，脫水、透明、封片后于熒光顯微鏡下觀察照相。陰性對照組免去一抗滴加。陽性結果判斷標準：熒光顯微鏡下觀察到細胞受激發出的綠色熒光。

1.2.5MTT法檢測Slit/Robo信號通路阻斷后對胰腺癌細胞增殖的影響取對數生長期的胰腺癌細胞，胰酶消化后，以5～10×103個細胞接種于96孔培養板中。設定1個對照組和3個實驗組，對照組不加阻斷劑，實驗組加競爭性阻斷劑Robo1（N-20）P（簡寫為RoboN）的濃度分別為5、10、20 μg/ml。胰腺癌細胞分別培養24、48、72 h后，加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續孵育5 h，吸棄培養孔上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使甲瓚充分溶解，酶聯免疫檢測儀上測定各孔490 nm光吸收值（OD值），計算細胞生長抑制率繪制生長曲線。抑制率=1-實驗孔OD值/對照孔OD值×100%。

1.3統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行數據錄入和統計分析，實驗所得數據以均數±標準差（x-±s）表示。采用t檢驗，比較各組間是否存在統計學差異，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1Slit2、Robo1基因在胰腺癌細胞中的表達

在胰腺癌細胞株BxPC-3（圖1）、Panc-1（圖2）中，通過RT-PCR法發現Slit2和Robo1均有基因表達。其中Slit2的退火溫度為55℃，Robo1的退火溫度為64℃，β-actin的退火溫度為56℃。

圖1　Slit2、Robo1基因在BxPC-3細胞中的表達

圖2　Slit2、Robo1基因Panc-1細胞中的表達

2.2免疫細胞化學法檢測出Slit2、Robo1蛋白在胰腺癌細胞中的表達

通過免疫細胞化學法，檢測出Slit2、Robo1蛋白在胰腺癌細胞株BxPC-3（圖3）、Panc-1（圖4）中均有表達。

在BxPC-3中，圖3中A圖示為對照組，細胞質內未見棕褐色細顆粒，只見染成藍紫色的細胞核；B圖示為加了Slit2蛋白一抗組，細胞內可見棕色細顆粒，及染成藍紫色的細胞核；C圖示為Robo1蛋白一抗組，細胞內可見棕色細顆粒，及染成藍紫色的細胞核。上述實驗結果說明，Slit2、Robo1蛋白可以在胰腺癌BxPC-3中表達。

在Panc-1中，圖4中A圖示為對照組，細胞質內未見棕褐色細顆粒，只見染成藍紫色的細胞核；B圖示為加了Slit2蛋白一抗組，細胞內可見棕色細顆粒，及染成藍紫色的細胞核；C圖示為Robo1蛋白一抗組，細胞內可見棕色細顆粒，及染成藍紫色的細胞核。上述實驗結果說明，Slit2、Robo1蛋白可以在胰腺癌Panc-1中表達。

圖3　Slit2、Robo1蛋白在BxPC-3細胞中的表達

2.3免疫熒光法檢測出Slit2、Robo1蛋白在胰腺癌細胞中的表達

通過免疫熒光法，檢測出Slit2、Robo1蛋白在胰腺癌細胞株BxPC-3（圖5）、Panc-1（圖6）中均有表達。

在BxPC-3中，圖5中A圖示為對照組，細胞上未見綠色熒光，只見發出藍色熒光的細胞核；B圖示為加了Slit2蛋白一抗組，細胞上可見綠色熒光，及發出藍色熒光的細胞核；C圖示為Robo1蛋白一抗組，細胞上可見綠色熒光，及發出藍色熒光的細胞核。上述實驗結果說明，Slit2、Robo1蛋白可以在胰腺癌BxPC-3中表達。

在Panc-1中，圖6中A圖示為對照組，細胞上未見綠色熒光，只見發出藍色熒光的細胞核；B圖示為加了Slit2蛋白一抗組，細胞上可見綠色熒光，及發出藍色熒光的細胞核；C圖示為Robo1蛋白一抗組，細胞上可見綠色熒光，及發出藍色熒光的細胞核。上述實驗結果說明，Slit2、Robo1蛋白可以在胰腺癌Panc-1中表達。

圖5　Slit2、Robo1蛋白在BxPC-3細胞中的表達

圖6　Slit2、Robo1蛋白在Panc-1細胞中的表達

2.4胰腺癌細胞生長能力

2.4.1 MTT法繪測定各組胰腺癌細胞的OD值及抑制率表1為MTT法檢測BxPC-3胰腺癌細胞在培養24、48、72 h后的OD值及抑制率。從表中可以看出：阻斷Slit/Robo信號通路后，隨著胰腺癌細胞培養時間的延長，胰腺癌細胞生長抑制率逐漸增高。

表1　BxPC-3細胞培養24、48、72 h各組的OD值及抑制率

表2為MTT法檢測Panc-1胰腺癌細胞在培養24、48、72 h后的OD值及抑制率。從表中同樣可以看出：阻斷Slit/Robo信號通路后，隨著胰腺癌細胞培養時間的延長，胰腺癌細胞生長抑制率也逐漸增高。

表2　Panc-1細胞培養24、48、72 h各組的OD值及抑制率

2.4.2細胞生長抑制率在胰腺癌BxPC-3細胞中，實驗組對胰腺癌細胞生長的抑制率存在濃度依賴性，在24、48、72 h時，實驗組20 μg/ml與10 μg/ml的抑制率存在統計學差異（P＜0.05）；在48、72 h時實驗組10 μg/ml與5 μg/ml的抑制率也存在統計學差異（P＜0.05），見圖7。

和胰腺癌BxPC-3細胞類似，在Panc-1細胞中，在24、48、72 h時，實驗組10 μg/ml與5 μg/ml間，實驗組20 μg/ml與10 μg/ml間的抑制率均存在統計學差異（P＜0.05），見圖8。

圖7　不同濃度RoboN對胰腺癌BxPC-3細胞的生長影響差異

圖8　不同濃度RoboN對胰腺癌BxPC-3細胞的生長影響差異

3　討論

胰腺癌是一種具有高度侵襲行為的消化道惡性腫瘤，在我國，發病率呈逐年增長趨勢。胰腺癌的發生、發展、侵襲和轉移是嚴重影響預后的因素，而有關上述方面的研究仍是目前研究的熱點問題。

Slit/Robo信號通路較早是在中樞神經系統中進行研究的，其在中樞神經系統中有抑制神經細胞遷移，阻止合縫處神經軸突穿過神經管中線，控制神經軸突在神經系統中準確定位［14］的作用。Slit/Robo信號通路對感覺神經元的中樞突分支及延伸有抑制作用，而對其周圍突分支及延伸有促進作用［15］。此外，Slit/Robo信號通路在外周自主神經系統的形成和發展中也具有一定作用［16］。

Slit/Robo信號通路對腫瘤發生發展也有作用，但各方面的研究報道結果尚不統一，主要表現在以下三個方面，第一，Slit/Robo信號通路在腫瘤中表達情況不同，表現在其是癌基因與抑癌基因方面的認識不同；第二，Slit/Robo信號通路對腫瘤新生血管形成的作用報道不一，來源于該信號通路可以通過誘導血管內皮細胞的遷移促進新生血管形成，還是抑制血管內皮細胞的遷移減少新生血管形成的結論不同；第三，Slit/Robo信號通路對腫瘤細胞遷移作用的報道也尚不一致，出現該信號通路可以抑制腫瘤細胞遷移，或者誘導腫瘤細胞遷移，從而促進腫瘤細胞的侵襲、擴散及轉移。

目前尚無Slit/Robo信號通路在胰腺癌中的研究報道，由于胰腺癌具有神經浸潤的特征性表現，其神經浸潤機制可能與某些神經導向因子有關。Slit/Robo信號通路不僅能調節神經的生長及分支，且其已被發現存在于許多惡性腫瘤細胞中發揮一定作用。基于以上研究報道，本實驗首先通過RTPCR、免疫細胞化學、免疫熒光兩種方法證實胰腺癌細胞中存在Slit2、Robo1基因及蛋白的表達。表明在胰腺癌細胞中同樣存在Slit/Robo信號通路，即Slit2/Robo1信號通路。與肝癌、直腸癌、乳腺癌、胃癌、宮頸癌等其他惡性腫瘤類似，Slit/Robo信號通路可能對胰腺癌的發生發展具有一定作用。

為了進一步探討Slit/Robo信號通路對胰腺癌細胞的作用，本實驗通過用不同濃度的Robo1胞外區阻斷劑RoboN，它可以競爭性結合Robo第1個免疫球蛋白功能區，從而阻斷Slit2/Robo1信號通路活性，通過檢測細胞生長情況，發現添加阻斷劑RoboN的實驗組較正常對照組胰腺癌細胞的吸光度下降，細胞生長的抑制率上升，表明Slit2/Robo1信號通路對胰腺癌細胞的生長具有一定影響作用。通過統計學方法驗證各組間細胞生長抑制率差異的顯著性，發現在24、48、72 h時，各濃度組的抑制率存在顯著性差異（P＜0.05），并且隨著實驗組對Slit2/Robo1信號通路阻斷時間的延長，這種抑制作用也越來越明顯。

本實驗研究發現，阻斷Slit/Robo信號通路可以抑制胰腺癌細胞的生長，這和馬宇光［17］用Slit/Robo信號阻斷劑R5預處理人舌鱗狀上皮癌細胞系Tb細胞后，Tb細胞的增殖率減弱，PCNA蛋白表達水平下降結果一致，表明Slit/Robo信號通路也參與了胰腺癌細胞生長的過程。

隨著進一步的研究，Slit家族和Robo家族的其他成員可能在胰腺癌其他細胞株中將會被發現；Slit/Robo信號通路對胰腺癌生長、浸潤、轉移的生物學行為作用也將被揭示；此外通過研究，具有神經導向和促進腫瘤發生發展雙重作用的Slit/Robo信號通路，可能為胰腺癌的神經浸潤機制提供新的分子水平上的理論依據。

胰腺癌預后極差，本實驗結果發現，通過添加Slit/Robo信號通路阻斷劑RoboN可以抑制胰腺癌細胞的生長。因此，進一步深入研究Slit/Robo信號通路對胰腺癌的作用及機制，治療方法提供新的理論支持。目前關于Slit/Robo信號通路在腫瘤中的作用報道不多，且現有的報道結果尚不統一，各種不明確的研究結果均揭示了Slit/Robo信號對腫瘤發生發展作用的復雜性，而這種不統一的研究結果可能與該信號通路中不同配、受體的相互作用有關，其機制也需要進一步深入研究。

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Expression of Slit/Robo signaling pathway in pancreatic cancer cells and its effect on cell growth

LIANG Gang1HE Meng-guo1MAQing-yong2#1Department of Hepatobiliary Surgery，Xianyang 215 Hospital of the Nuclear Industry in Shaanxi Province，Xianyang 712000，Shaanxi，China2Department of Hepatobiliary Surgery，First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710000，Shaanxi，China

ObjectiveTo detect the expression of Slit/Robo signaling pathway in pancreatic cancer cells，and to analyze its impact on cell growth.MethodThe expression of Slit/Robo signaling pathway was detected in pancreatic cancer cell line BxPC-3 and Panc-1 by RT-PCR，immunohistochemistry，and immunofluorescence，respectively.Then the blocker RoboN was used to block the Slit/Robo signal pathway，and the cell proliferation was observed as per MTT method. ResultThe gene and protein expression of Slit2 and Robo1 was observed in pancreatic cancer cell line BxPC-3 and Panc-1.With the addition of inhibitor RoboN，the in-vitro cell growth and proliferation of pancreatic cancer cells was suppressed.ConclusionThere may be a Slit2/Robo1 signaling pathway in pancreatic cancer cells，which may negatively regulate the growth of pancreatic cancer cells，suggesting that the Slit/Robo signaling pathway is potentially engaged in the occurrence and development of pancreatic cancer.

Slit/Robo signaling pathway；pancreatic cancer；cell growth

R735.9

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.02.15

Oncol Prog，2016，14（2）

（corresponding author），郵箱：qyma56@mail.xjtu.edu.cn作用。但Slit/Robo信號在胰腺癌細胞中是否也有表達，是否參與調控胰腺癌細胞的生長，國內外尚未見報道。本研究通過檢測胰腺癌細胞中Slit、Robo的表達情況及阻斷Slit/Robo信號通路，分析該通路對胰腺癌細胞生長的影響。

2015-06-30）

較早的研究發現，Slit/Robo信號通路作為神經導向因子在神經系統中具有軸突排斥［1］、軸突導向［2］、抑制神經元遷移［3］等作用。目前，已知Slit家族由Slit1、Slit2、Slit3組成，它們在神經系統、其他細胞中均有表達，如白細胞、肺臟、腎臟、黃體等。Slit蛋白含有4個亮氨酸富有區序列（LRRs，D1～D4）、7～9個EGF樣的重復序列、一個半胱氨酸富有區C末端序列和一個層黏素G序列，其中LRRs參與和受體結合。Robo家族是一類保守跨膜受體蛋白，由4個成員組成：Robo1、Robo2、Robo3、Robo4，它們主要在神經系統中表達，也可表達于非神經系統，如血管內皮細胞、肌細胞等。Robo1、Robo2、Robo3由含有5個Ig樣功能區及3個纖連蛋白Ⅲ組件（fibronectin typeⅢmodule，FN）的胞外區、跨膜區和一個胞內區組成，胞內區含有分別命名為：CC0、CC1、CC2、CC3的4個小區域。Robo4胞外區域只含兩個Ig樣功能區以及3個纖連蛋白Ⅲ組件，胞內區域只有CC0和CC2。研究表明，在硫酸類肝素（heparan sulfate，HS）蛋白多聚糖的參與下，Slit主要通過第2個LRR（D2）結合Robo胞外前兩個Ig樣功能區，激活Robo受體胞內區域，使其與一些重要信號分子，如srGAPs等相互作用，而產生相應的生物學作用［4-6］。現有的研究發現，Slit/Robo信號通路在多種腫瘤細胞中都有表達，不同腫瘤細胞中該信號通路基因表達亞型不同［7-8］，并且其對腫瘤新生血管的形成［7，9-10］、細胞的遷移［11-13］都具有一定