兩種藥物誘導小鼠高血糖模型在降糖實驗中的運用比較與問題探討

首都醫科大學醫學實驗與測試中心（100069）曹麗歌 蔣雪云 田蜜 高麗芳 羅葵 崔淑香

目前常用的糖尿病動物模型可分為自發性、實驗性和轉基因模型三種。國外多采用自發傾向的糖尿病近交系純種動物制作模型，如BB（Bio Breeding）鼠，DB（Diabetes）鼠和NOD（Non-Obestiy Diabetes）鼠[1]。國內一般是使用化學藥物選擇性地破壞胰島細胞，形成急性糖尿病模型，最常用的藥物是鏈脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）和四氧嘧啶（Alloxan, ALX）。本文結合國家食品藥品監督管理局（SFDA）頒布保健食品輔助降血糖功能評價方法[2]，分別采用STZ和ALX腹腔注射誘導小鼠高血糖模型，通過比較兩者在降血糖實驗中的效果差異，探討建模和血糖測定的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康ICR雄性小鼠（6周齡），體重為24±2g，由維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2012－0001。動物飼養場所由首都醫科大學實驗動物部提供，合格證號：SYXK（京）2010－0020，室內溫度（22±2）℃，相對濕度（50±20）%。喂飼真空包裝無菌飼料由北京科澳協力飼料有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2014-0010。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 儀器，ACCU-AHEK卓越型血糖儀（羅氏公司生產）。

1.2.2 試劑 STZ和ALX（Sigma公司生產）；注射用生理鹽水（山東華魯制藥有限公司生產）；葡萄糖（北京現代東方精細化學品有限公司生產）；干預用保健食品地黃玉片（由某科技有限公司提供）；血糖試紙（羅氏公司生產）。

附表1 兩種藥物誘導小鼠高血糖模型體重變化（x±s，n=10）

附表2 兩種藥物造模結果的比較（x±s，n=10）

附表3 糖耐量實驗血糖儀測定出現HI值情況（n=10）

附表4 糖耐量實驗血糖值測定結果推測（x±s，n=10）

1.3 試劑配制

1.3.1 按照禁食24h后空腹體重計算稱取STZ和ALX試劑，分別溶于注射用生理鹽水中，配制成濃度為1.2%和1.3%的溶液，由于兩種水溶液不穩定，配制后需立即進行腹腔注射。

1.3.2 干預用保健食品按其推薦劑量，加純凈水配制成16%的水溶液。

1.3.3 葡萄糖溶液配制濃度為10%，純凈水溶解。

1.4 方法

1.4.1 高血糖模型的建立 動物購入后，適應環境3天，按體重隨機分為兩組，每組45只小鼠。將兩組動物禁食（不禁水）4h后，尾部末梢血測定空腹血糖，作為兩組動物的基礎血糖，即造模前血糖。隨后，禁食24h（自由飲水），分別腹腔注射劑量為120mg/kgBW的STZ溶液和130mg/kgBW的ALX溶液造模。6天后動物禁食4h，血糖儀測血糖，血糖值10～25mmol/L為高血糖模型成功動物。比較兩組的成模率和死亡率。

1.4.2 糖耐量實驗 選高血糖模型動物按禁食4h的血糖水平隨機分成4個組，分別是STZ模型組、STZ干預組、ALX模型組和ALX干預組（組間差不大于1.1mmol/L）。干預組經口給予保健食品，模型組給予純凈水，連續30天。各組動物禁食4h小時，血糖儀測定給葡萄糖前（即0小時）血糖值，干預組最后一次給予保健食品，模型組給予同體純凈水，20分鐘后各組經口給予葡萄糖2.0g/kg BW，剪尾測定給予葡萄糖后各組0.5h、2h的血糖值。

1.5 觀察指標

1.5.1 體重 動物適應環境后稱量體重即實驗前體重；成模分組后體重及糖耐量實驗（實驗結束前）禁食前體重。

1.5.2 血糖值 造模前基礎血糖值；造模后血糖值；糖耐量實驗中0h、0.5h和2h血糖值及血糖儀HI值的出現頻率比較；比較生化儀和血糖儀測定血糖值。

1.5.3 觀察造模后比較STZ和ALX的成模率和死亡率以及分組后的死亡率。

1.5.4 觀察實驗中動物的精神狀態、進食量、飲水量及排尿量。

1.6 數據處理 數據用均數和標準差（X±S）表示，采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，體重和血糖值采用單因素方差分析，HI值的出現頻率、成模率和死亡率采用卡方檢驗，儀器比對血糖值采用t檢驗，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 建模后動物的大體觀察 建模后小鼠飲水及排尿量明顯增加，進食量正常，皮毛蓬松，精神尚可。1只出現尾部潰爛，2只出現前肢潰爛。尾部潰爛可能與多次取血有關，而前肢潰爛可能為高血糖的并發癥所致。

2.2 體重變化 兩種藥物誘導小鼠高血糖模型體重變化見附表1。兩種藥物誘導在造模前、造模后6天和36天時的體重均無顯著性差異（P＞0.05），但是ALX干預組在造模后6天體重出現略微下降，ALX兩個組的體重標準差（4.75；3.49）均大于STZ誘導的兩個組（1.45；1.93）。

2.3 血糖值的變化、成模率和死亡率兩種藥物造模結果的比較見附表2。造模前與造模6天血糖值均無顯著性差異（P＞0.05），但ALX組6天血糖值（16.08；16.22）高于STZ組（13.85；13.90），存在生物學意義；成模率和成模前后的死亡率均無統計學上的顯著性差異（P＞0.05）。ALX組成模率稍低于STZ組，死亡率出現在ALX組成模期間和STZ干預組成模后。

2.4 糖耐量實驗結果

附圖 STZ組與ALX誘導小鼠高血糖模型血糖水平變化

2.4.1 HI值的出現 在糖耐量實驗中，用血糖儀測定尾部末梢血糖值時出現了“HI”值情況，提示測定結果超過了儀器的檢測上限，通過統計出現的這種情況（見附表3），發現兩種藥物誘導模型在0.5h時存在明顯的差異，具體表現在ALX模型組出現HI值數量明顯少于STZ模型組（P＜0.01）；ALX干預組出現HI值數量少于STZ干預組（（P＜0.05）；綜合兩者出現情況統計出現率，ALX組出現HI值頻率明顯少于STZ組（P＜0.01）。在0h和2h時，兩組HI值出現沒有統計學差異，但總體上在這兩個時間點ALX組也有少于STZ組的趨勢。

2.4.2 血糖值測定結果推測 由于HI值的出現，血糖值無法準確到數值，根據血糖儀檢測限值（0.6～33.3mmol/L），假設HI值均為≥33.4mmol/L，得到下面的結果（見附表4），與造模結果不同，ALX誘導的兩個組別血糖值在3個時點均低于STZ誘導的組別，且ALX模型組在0h和2h由于沒有出現HI值情況所得數值為真實血糖值（x ±s）。

通過以上實驗可以得出兩種藥物誘導血糖值變化曲線見附圖（排除保健食品影響，只顯示STZ模型組和ALX模型組的血糖變化）。

附圖顯示，STZ組與ALX組在造模前血糖值幾乎沒有差異，隨著造模開始，ALX組（16.08±4.01）在第6天的血糖已經超過了STZ組（13.85±4.27），而在36天時，STZ組（22.22±8.43）的血糖因為持續升高反而高于ALX組（16.44±8.58）。

3 討論

采用藥物建立糖尿病動物模型受多種因素影響，包括動物種屬、性別、體重、藥物種類、給藥次數、給藥途徑、溶媒及劑量等。本研究所選擇的藥物STZ和ALX誘導高血糖動物模型的機制都是選擇性地破壞β細胞，使胰島細胞分泌功能喪失，造成胰島素缺乏，引起內分泌功能及三大物質代謝紊亂，從而使血糖升高。

實驗結果表明，兩種藥物誘導的小鼠沒有表現出明顯的“三多一少”的癥狀，與相關學者的研究結果相同。但造模后6天時，體重上升并不明顯，說明兩種藥物對于小鼠造模后短期體重存在一定的影響，ALX模型組還出現了微降的現象，ALX組體重標準差大于STZ組，ALX的誘導可能對于體重的影響更大。ALX組出現動物死亡的情況，是由于造模后動物一度處于低血糖期，血糖過低可致驚厥死亡[3]。而STZ組在糖尿病期出現的死亡，可能與個別動物的胰島β細胞呈現較持續的、嚴重的損傷與破壞導致機體免疫力下降有關。從6天血糖值可以看出，ALX較STZ在ICR小鼠體內更為敏感，存在生物學意義。而成模率則STZ組略高于ALX，是由于ALX誘導產生的低血糖相較為嚴重，出現動物死亡，如果能在造模后及時給予一定質量分數的葡萄糖就可以降低死亡率，同時有助于提高成模率。

血糖儀由于其采血便捷、方便攜帶、檢測快速等優勢成為測定血糖的常用儀器，糖尿病的研究也多采用血糖儀。在糖耐量實驗中，我們發現使用血糖儀測定會導致實驗結果出現缺失的現象，并且ALX和STZ誘導產生的結果存在顯著性差異，這種差異主要體現在血糖儀HI值（超過儀器檢測上限值）的出現頻率上。為了更真實的反映結果，我們采用了一種保健品進行干預，模擬保健食品輔助降血糖功能評價實驗的某個劑量組給藥30天，發現干預組在0h就會出現HI值，0.5h出現數量達到高峰，并且ALX干預組少于STZ干預組（P＜0.05），而在模型組產生的差異更為明顯（P＜0.01），評價總的HI值出現率，ALX組同樣明顯少于STZ組（P＜0.01）。在2h時ALX模型組恢復到0h的情況，沒有出現HI值，而其他組別雖然數量均有下降，仍然有HI值出現。上述現象出現的原因可能與參與干預的保健品有關，此次使用的為含輔料樣品，因此在最后一次空腹給藥會使血糖值升高，隨后在給予葡萄糖時產生蓄積作用，使血糖值濃度太高而超過血糖儀的檢測上限。總體來看，STZ對葡萄糖過于敏感，ALX對于血糖蓄積升高的影響較小。繼續分析糖耐量實驗的血糖值變化，經假設推測可以得出ALX組在3個時點的血糖值都要低于STZ組的結論，這也與上面HI值出現的結果統計有相輔相成的關系，同時也對STZ模型組在0小時出現HI值的現象提供了依據。并且，根據各期血糖值，我們繪制出STZ和ALX誘導小鼠高血糖模型血糖值變化圖，ALX組在造模后血糖升高迅速，36天血糖值與6天基本相當，血糖濃度仍然保持較高水平，沒有出現自發緩解現象；STZ組血糖升高比ALX組有延遲，36天血糖與6天時比較上升明顯，出現HI值的風險加大。兩者比較，ALX在不超過5周給藥周期的降血糖實驗中能夠獲得相對理想的結果。

綜上所述，通過比較兩種藥物誘導小鼠高血糖模型在降糖實驗中的效果，盡管ALX毒性大，對造模動物的體重等指標存在影響，但由于其造模速度快，動物的高血糖濃度較穩定且維持時間較長，并且價格低廉，仍然是建立高血糖動物模型的首選藥物。同時在采用ICR小鼠進行保健食品降血糖功能實驗時，受試物應該去除輔料以避免對糖耐量實驗結果的干擾。