c-junN端蛋白激酶1磷酸化與糖尿病大鼠早期心肌損傷關系研究

陳昕明，劉曉亮，吳 偉

?

·論著·

c-junN端蛋白激酶1磷酸化與糖尿病大鼠早期心肌損傷關系研究

陳昕明，劉曉亮，吳 偉

目的探討c-junN端蛋白激酶1(JNK1)磷酸化與糖尿病(DM)大鼠早期心肌損傷的關系。方法2013年10月—2014年7月，80只SPF級雌性SD大鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字表法選取60只作為DM模型組，給予高糖高脂飲食飼養4周，一次性左下腹腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液(35 mg/kg)；另外20只作為對照組(A組)，給予普通飲食飼養4周，一次性左下腹腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。最終共48只大鼠造模成功，采用隨機數字表法分為B組、C組、D組，各16只。C組大鼠腹腔注射SP600125，D組大鼠皮下埋置含有血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)+0.9%氯化鈉溶液的植入式膠囊滲透壓泵，A組、B組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液。飼養6周后，采用隨機數字表法從4組大鼠中分別選取10只，檢測大鼠心體比(H/B)、左心室質量指數(LVMI)，HE染色觀察心肌組織形態學改變，免疫組化SABC法檢測JNK1、磷酸化JNK1(p-JNK1)、瞬時受體電位通道C亞族(TRPC)6、膠原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ)表達水平。結果B組、C組、D組大鼠H/B大于A組，B組、D組大鼠LVMI大于A組(P<0.05)；C組大鼠H/B、LVMI小于B組、D組(P<0.05)。A組大鼠心肌細胞排列整齊，細胞間連接緊密，心肌紋理清晰；B組、C組、D組大鼠心肌細胞均有不同程度的肥大性改變，細胞間隙增寬，心肌細胞排列紊亂，心肌紋理欠清晰。B組、C組、D組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達水平高于A組(P<0.05)；C組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達水平低于B組(P<0.05)；D組大鼠p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達水平高于B組、C組，JNK1表達水平高于C組(P<0.05)。結論高糖環境可誘導JNK1磷酸化，進而影響下游TRPC6信號表達，造成膠原蛋白沉積過多，導致心肌細胞肥大和纖維化，從而引起糖尿病心肌病的發生發展。

糖尿病；心肌疾病；c-junN端蛋白激酶1；瞬時受體電位通道C亞族

陳昕明，劉曉亮，吳偉.c-junN端蛋白激酶1磷酸化與糖尿病大鼠早期心肌損傷關系研究[J].中國全科醫學，2016，19(27)：3281-3286.[www.chinagp.net]

CHEN X M,LIU X L,WU W.Relationship between c-junN terminal kinase 1 and early injury in the myocardium of diabetic rats[J].Chinese General Practice，2016，19(27)：3281-3286.

多數糖尿病(DM)患者死于心血管疾病，部分原因為特異性心肌病的存在[1]，即糖尿病心肌病(DCM)[2]。DCM是DM引起心臟微血管病變和心肌代謝紊亂所致的心肌廣泛性壞死，早期常表現為心肌順應性降低和舒張期充盈受阻為主的舒張功能不全，晚期以收縮功能不全為主，易發生充血性心力衰竭[3-4]。但DCM的發病機制目前尚未明確。近年來研究認為，可能存在c-junN端蛋白激酶1(JNK1)等信號分子通過瞬時受體電位通道C亞族(TRPC)影響下游信號造成心肌損傷，但其調控機制尚不明確[5]。既往研究表明，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可以與血管緊張素Ⅱ 1型(AT-1)受體結合，通過活化AT-1受體而激活JNK1信號通路，在一系列心血管系統疾病以及代謝性疾病中起到重要作用[6-7]。SP600125是一種常用的JNK1信號通路高選擇性抑制劑，可以通過競爭性結合ATP位點抑制JNK1活性。本研究在既往研究的基礎上[8]，探討JNK1磷酸化與DM大鼠早期心肌損傷的關系，尋找DCM發生發展的關鍵環節，以達到早期預防疾病、開發新型藥物乃至提供靶向治療的目的。

1　材料與方法

1.1實驗動物SPF級雌性SD大鼠80只，6周齡，體質量(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2主要儀器與試劑鏈脲佐菌素(STZ)、AngⅡ購自美國Sigma公司，SP600125購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3研究方法

1.3.1動物模型制備及分組2013年10月—2014年7月，將80只SD大鼠于屏障環境大鼠飼養盒內適應性喂養1周后，采用隨機數字表法選取60只作為DM模型組，給予高糖高脂飲食飼養4周后，禁食24 h，期間自由飲水，一次性左下腹腹腔注射1% STZ溶液(35 mg/kg)，另外20只作為對照組(A組)，給予普通飲食飼養4周后，禁食24 h，期間自由飲水，一次性左下腹腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。分別于24 h、48 h后檢測血糖，以空腹血糖>11.1 mmol/L，餐后2 h血糖>16.7 mmol/L，且大鼠出現多飲、多食、多尿為成模標準。最終共48只大鼠造模成功，采用隨機數字表法分為B組、C組、D組，各16只。C組大鼠腹腔注射SP600125(溶于1%二甲基亞砜)，15 mg/kg，隔日1次；D組大鼠皮下埋置含有AngⅡ+0.9%氯化鈉溶液的植入式膠囊滲透壓泵，700 ng·kg-1·d-1；A組、B組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，20 μg·kg-1·d-1。各組大鼠分組處理，連續飼養6周，其中A組大鼠繼續給予普通飲食，B組、C組、D組大鼠給予高糖高脂飲食，自由飲水。

1.3.2檢測大鼠心體比(H/B)、左心室質量指數(LVMI)飼養6周后，采用隨機數字表法從4組大鼠中分別選取10只，稱取體質量后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剪開胸骨，暴露心臟，于主動脈根部水平離斷，0.9%氯化鈉溶液充分沖洗后，用濾紙吸干，稱全心質量，分離左心室，稱左心室質量。分別計算H/B(H/B=全心質量/體質量)及LVMI(LVMI=左心室質量/體質量)。

1.3.3HE染色觀察心肌組織形態學改變垂直于心臟縱軸常規組織切片，經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，流動清水漂洗2 min，蘇木素染色5 min，再次流動清水漂洗1 min，1%鹽酸乙醇分化20 s，流動清水漂洗15 min返藍，伊紅染色1 min，流動清水漂洗30 s，85%乙醇脫水20 s，90%乙醇脫水30 s，95%乙醇脫水1 min (2次)，無水乙醇脫水2 min(2次)，二甲苯脫水2 min(2次)，中性樹膠封固，觀察心肌組織形態學改變。

1.3.4免疫組化SABC法檢測JNK1、磷酸化JNK1(p-JNK1)、TRPC6、膠原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ)表達水平將經免疫組化染色處理過的切片置于顯微鏡下觀察，每份樣本觀察5個視野，每個視野選取5處染色區，根據積分光密度與面積的比值，計算單位面積平均光密度(MOD)，以各個視野的MOD計算每個標本的MOD，以MOD作為JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagenⅠ表達水平的半定量參數。

2　結果

2.1一般情況A組大鼠精神狀態良好，反應敏捷，毛色白，有光澤，無死亡。DM模型組大鼠出現多飲、多食和消瘦等癥狀，且精神萎靡，動作遲緩，皮毛無光澤，部分出現爛尾、白內障等癥狀。其中B組、D組上述癥狀較為明顯，B組死亡4只，D組死亡3只；C組上述癥狀相對較輕，死亡2只。

2.2H/B、LVMI比較4組大鼠H/B、LVMI比較，差異有統計學意義(P<0.01)。B組、C組、D組大鼠H/B大于A組，B組、D組大鼠LVMI大于A組，差異有統計學意義(P<0.05)；C組大鼠H/B、LVMI小于B組、D組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.3心肌組織形態學改變A組大鼠心肌細胞排列整齊，細胞間連接緊密，心肌紋理清晰；B組大鼠心肌細胞有肥大性改變，細胞間隙增寬，心肌細胞排列明顯紊亂，細胞間組織疏松，且有局灶性壞死，心肌紋理欠清晰；C組大鼠心肌細胞肥大、排列紊亂，細胞間組織疏松，心肌紋理欠清晰的現象較B組有所改善，但無法達到A組程度；D組大鼠心肌組織形態學改變較B組更為顯著(見圖1，本文圖1～5彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

2.4JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達水平比較4組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.01)。B組、C組、D組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達水平高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)；C組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達水平低于B組，差異有統計學意義(P<0.05)；D組大鼠p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達水平高于B組、C組，JNK1表達水平高于C組，差異有統計學意義(P<0.05，見圖2～5、表3)。

表1　4組大鼠H/B、LVMI比較

注：H/B=心體比，LVMI=左心室質量指數；a為F值；與A組比較，bP<0.05；與B組比較，cP<0.05；與C組比較，dP<0.05

Table 2Comparison of expression level of JNK1,p-JNK1,TRPC6,and collagen Ⅰ among rats in four groups

組別只數JNK1p-JNK1TRPC6collagenⅠA組100.133±0.0150.150±0.0040.291±0.0480.141±0.021B組100.389±0.057a0.391±0.027a0.409±0.012a0.395±0.105aC組100.246±0.108ab0.201±0.016ab0.381±0.013ab0.295±0.141abD組100.431±0.012ac0.438±0.019abc0.442±0.018abc0.498±0.293abcH值23.73035.51834.31136.589P值<0.01<0.01<0.01<0.01

注：JNK1=c-junN端蛋白激酶1，p-JNK1=磷酸化JNK1，TRPC=瞬時受體電位通道C亞族，collagenⅠ=膠原蛋白Ⅰ；與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

圖1　各組大鼠心肌組織HE染色結果(×400)

圖2　4組大鼠心肌組織JNK1陽性表達情況(免疫組化SABC法染色，×400)

圖3　4組大鼠心肌組織p-JNK1陽性表達情況(免疫組化SABC法染色，×400)

圖4　4組大鼠心肌組織TRPC6陽性表達情況(免疫組化SABC法染色，×400)

圖5　4組大鼠心肌組織collagenⅠ陽性表達情況(免疫組化SABC法染色，×400)

3　討論

JNK1是絲裂原活化蛋白激酶家族成員，可以受各種細胞外刺激而激活，表現為酪氨酸和蘇氨酸殘基發生磷酸化，即p-JNK1。TRPC6是位于細胞膜上的重要陽離子通道，是TRPC家族的重要亞型。DCM是DM患者的心血管并發癥之一，關于DCM的發生機制，以往主要圍繞糖脂代謝異常、離子紊亂、氧自由基異常等方面進行研究[9]。JNK1信號通路是一系列心血管系統疾病以及代謝疾病中的關鍵因子，其中JNK1磷酸化起到重要作用[10]。心肌纖維化是DCM的重要病理表現之一，與心肌間質膠原蛋白大量沉積有關，其中collagenⅠ是膠原蛋白的重要亞型。

本研究結果顯示，B組、C組、D組大鼠H/B大于A組，B組、D組大鼠LVMI大于A組，B組、C組、D組大鼠心肌細胞均有不同程度的肥大性改變、心肌紋理欠清晰，提示在DM早期即出現心臟質量增加，原因主要包括兩方面，一是心肌細胞肥大，二是間質纖維增生。既往研究表明，JNK1磷酸化與胰島素抵抗、心肌細胞肥大、心肌纖維化以及細胞凋亡密切相關[11]，作為JNK1的下游基因，TRPC在鈣信號轉導通路中發揮了重要作用，TRPC相互結合形成同型或異型聚合體后，可形成非選擇性離子通道，鈣、鈉和鎂均可由此通道進入細胞內，是鈣池操縱性離子通道和受體操縱性離子通道的分子基礎，介導鈣內流[12-13]。B組、C組、D組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達水平高于A組，提示高糖可以通過激活JNK1磷酸化，促進TRPC6的表達，鈣通道的建立使心肌中鈣水平升高，活化多種心肌細胞肥大和心肌纖維化的相關基因，collagenⅠ大量表達、心肌間質膠原沉積，心肌細胞蛋白核酸合成增加，造成心肌細胞肥大以及心肌纖維化[14]。既往研究中，TRPC抑制劑對于DM模型動物血管系統、腎臟系統、神經系統的保護效應已經得到初步證實，抑制TRPC表達可以減輕缺氧引起的心肌肥厚[15]，降低血管張力，減輕心臟負荷[16]。干擾RNA抑制TRPC6表達能明顯抑制心肌細胞肥大時的肌動蛋白重組和蛋白合成[17]。心肌細胞肥大依賴于TRPC6表達水平，低TRPC6表達水平心肌細胞無形態學改變，但已出現胚胎基因表達，并對肥大刺激因子敏感，隨著TRPC6表達水平增加，會出現心臟質量增加等形態學改變，且二者呈正相關[18]。本研究結果顯示，C組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達水平較B組降低，表明阻斷TRPC6上游JNK1信號通路可明顯下調TRPC6表達水平，減少鈣離子內流，抑制成纖維細胞增殖，減輕心肌細胞肥大及心肌纖維化，降低DCM病變程度。D組大鼠p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達水平高于B組、C組，JNK1表達水平高于C組，這從另一方面驗證了激活JNK1磷酸化對TRPC6的表達有促進作用。DCM病理改變主要為心肌細胞肥大、變性、局灶性壞死，肌絲纖維大量丟失，心肌細胞外間質不溶性膠原蛋白積聚、纖維化[19]。其中間質纖維化是DCM致病重要因素之一，膠原蛋白大量沉積，增加心室壁的僵硬度，降低心室順應性，致使心室舒縮功能不全。

人體內環境復雜，JNK1信號通路受多種因素影響，單一的動物模型無法完全模擬DM患者的實際狀態，因此尚需大量臨床研究佐證本研究結果，今后需進一步完善。

綜上所述，高糖環境可誘導JNK1磷酸化，進而影響下游TRPC6信號表達，造成膠原蛋白沉積過多，導致心肌細胞肥大和纖維化，從而引起DCM的發生發展。

作者貢獻：陳昕明進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；陳昕明、劉曉亮進行實驗實施、評估、資料收集；吳偉指導論文書寫，并進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

[1]RUBLER S,DLUGASH J,YUCEOGLU Y Z,et al.New type of cardiomyopathy associated with diabetic glomerulosclerosis[J].Am J Cardiol,1972,30(6):595-602.

[2]HAMBY R I,ZONERAICH S,SHERMAN L.Diabetic cardiomyopathy[J].JAMA,1974,229(13):1749-1754.

[3]BUGGER H,BODE C.The vulnerable myocardium.Diabetic cardiomyopathy[J].Hamostaseologie,2014,35(1):17-24.

[4]MURTAGH G,O CONNELL J,O CONNELL E,et al.Importance of risk factor management in diabetic patients and reduction in stage B heart failure[J].QJM,2015,108(4):307-314.

[5]PACHORI A S,CUSTER L,HANSEN D,et al.Bone morphogenetic protein 4 mediates myocardial ischemic injury through JNK-dependent signaling pathway[J].J Mol Cell Cardiol,2010,48(6):1255-1265.

[6]PALOMEQUE J,DELBRIDGE L,PETROFF M V.Angiotensin Ⅱ:a regulator of cardiomyocyte function and survival[J].Front Biosci (Landmark Ed),2009,14:5118-5133.

[7]MEHTA P K,GRIENDLING K K.Angiotensin Ⅱ cell signaling:physiological and pathological effects in the cardiovascular system[J].Am J Physiol Cell Physiol,2007,292(1):C82-97.

[8]LIU X,QI F,WU W.Effect of intervention in the diacylglycerol-protein kinase C signaling pathway on JNK1 expression and its downstream signaling in diabetic cardiomyopathy[J].Mol Med Rep,2014,9(3):979-984.

[9]ANEJA A,TANG W H,BANSILAL S,et al.Diabetic cardiomyopathy:insights into pathogenesis,diagnostic challenges,and therapeutic options[J].Am J Med,2008,121(9):748-757.

[10]LIANG Q,MOLKENTIN J D.Redefining the roles of p38 and JNK signaling in cardiac hypertrophy:dichotomy between cultured myocytes and animal models[J].J Mol Cell Cardiol,2003,35(12):1385-1394.

[11]JIANG S,GAVRIKOVA T A,PEREBOEV A,et al.Adenovirus infection results in alterations of insulin signaling and glucose homeostasis[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2010,298(6):E1295-1304.

[12]JOZSEF L,TASHIRO K,KUO A,et al.Reticulon 4 is necessary for endoplasmic reticulum tubulation,STIM1-Orai1 coupling,and store-operated calcium entry[J].J Biol Chem,2014,289(13):9380-9395.

[13]HOGAN P G,LEWIS R S,RAO A.Molecular basis of calcium signaling in lymphocytes:STIM and ORAI[J].Annu Rev Immunol,2010,28:491-533.

[14]LIN C H,LEE E H.JNK1 inhibits GluR1 expression and GluR1-mediated calcium influx through phoshorylation and stabilization of Hes-1[J].J Neurosci,2012,32(5):1826-1846.

[15]CHU W,WAN L,ZHAO D,et al.Mild hypoxia-induced cardiomocyte hypertrophy via up-regulation of HIF-1α-mediated TRPC signalling[J].J Cell Mol Med,2012,16(9):2022-2034.

[16]SANDOW S L,SENADHEERA S,GRAYSON T H,et al.Calcium and endothelium-mediated vasodilator signaling[J].Adv Exp Med Biol,2012,740:811-831.

[17]ONOHARA N,NISHIDA M,INOUE R,et al.TRPC3 and TRPC6 are essential for angiotensin Ⅱ-induced cardiac hypertrophy[J].EMBO J,2006,25(22):5305-5316.

[18]KUWAHARA K,WANG Y,MCANALLY J,et al.TRPC6 fulfills a calcineurin signaling circuit during pathologic cardiac remodeling[J].J Clin Invest,2006,116(12):3114-3126.

[19]李延輝,吳偉,于艷秋,等.siRNA干擾HIF-1α表達對高糖高胰島素誘導的肥大心肌細胞的影響[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2011,20(3):241-245.

(本文編輯：崔麗紅)

Relationship between c-junN Terminal Kinase 1 and Early Injury in the Myocardium of Diabetic Rats

CHENXin-ming,LIUXiao-liang,WUWei.

DepartmentofEmergency,theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,ChinaCorrespondingauthor:WUWei,DepartmentofEmergency,theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;E-mail：wuwei196010@126.com

ObjectiveTo investigate the relationship between c-jun N terminal kinase 1 (JNK1) and early injury in the diabetic myocardium(DM) rats.MethodsFrom October 2013 to July 2014,after one-week adaptive feed of the 80 female Sprague-Dawley (SD) rats at SPF levels,60 rats were selected by random number table method.They were established as DM model group by four-week high glucose and high fat diet and a one-time left lower quadrant intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) at a dose of 35 mg/kg.The other 20 rats,one-time intraperitoneally injected of citrate buffer solution of same volume,were regarded as the control group (group A) with four-week normal diet.In the end,modeling of the 48 rats was established successfully.They were divided into group B,group C and group D with 16 rats in each group by random number table method.Rats in group C were given an intraperitoneal injection of SP600125,rats in group D were subcutaneously implanted with an osmotic pump to infuse angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) and 0.9% sodium chlo-ride,rats in group A and group B were given an intraperitoneal injection of 0.9% sodium chlo-ride.After six-week feeding,10 rats were selected from each group through random number table method.The heart/body weight ratio (H/B) and left ventricular mass index (LVMI) were detected.The Hematoxylin and Eosin staining were used to observe the myocardial pathological changes.Immunohistochemistry SABC method was used to measure the expression level of JNK1,phosphorylation JNK1 (p-JNK1),transient receptor potential canonical channels (TRPC) 6 and collagen Ⅰ.ResultsThe H/B in group B,group C and group D was higher than that in group A,and LVMI in group B and group D was higher than that in group A (P<0.05);H/B and LVMI of rats in group C were lower than those in group B and group D (P<0.05).The myocardial cells of rats in group A arranged in neat rows with tight junctions and clear myocardial texture;while the myocardial cells of rats in group B,group C and group D had hypertrophic changes of different degrees,characterized by dilated intercellular space,disordered cell arrangement and less clear myocardial texture.The expression level of JNK1,p-JNK1,TRPC6,and collagen Ⅰ of rats in group B,group C and group D was higher than that in group A (P<0.05);the expression level of JNK1,p-JNK1,TRPC6,and collagen Ⅰ of rats in group C was lower that in group B (P<0.05);the expression level of p-JNK1,TRPC6,and collagen Ⅰ of rats in group D was higher than that in group B and group C,the expression level of JNK1 in group D was higher than that in group C (P<0.05).ConclusionHigh glucose environment may induce JNK1 phosphorylation,and affect the expression of TRPC6,which will lead to an increased collagen deposition,and finally result in cardiomyocyte hypertrophy and fibrosis,and cause the occurrence and development of diabetic cardiomyopathy.

Diabetes mellitus;Cardiomyopathies;c-junN terminal kinase 1;Transient receptor potential canonical channels

全國臨床醫藥研究專項基金(L201257)；遼寧省科技廳科學技術計劃項目(2013225049)

110001 遼寧省沈陽市，中國醫科大學附屬第一醫院急診科

吳偉，110001 遼寧省沈陽市，中國醫科大學附屬第一醫院急診科；E-mail：wuwei196010@126.com

R 587.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.27.005

2015-11-18；

2016-04-05)