Ⅱ型膠原誘導性關節炎大鼠血清抗角蛋白抗體和抗環瓜氨酸肽抗體及類風濕因子的檢測分析

羅德梅，李文紅，王 倩，杜文靜，孟 巖，李慧君，閆 怡，馮 寧，馬秀敏，羅 莉

?

·論著·

Ⅱ型膠原誘導性關節炎大鼠血清抗角蛋白抗體和抗環瓜氨酸肽抗體及類風濕因子的檢測分析

羅德梅，李文紅，王 倩，杜文靜，孟 巖，李慧君，閆 怡，馮 寧，馬秀敏，羅 莉

目的對Ⅱ型膠原誘導性關節炎(CIA)大鼠血清抗角蛋白抗體(AKA)、抗環瓜氨酸肽(Anti-CCP)抗體及類風濕因子(RF)進行檢測，并分析其與人類類風濕關節炎(RA)的血清免疫學是否相似。方法2014年11月—2015年3月，15只SPF級7～8周健康雌性Wistar大鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字表法選取5只作為空白對照組，10只用于建立CIA模型，最終8只造模成功(CIA模型組)。造模成功后，采集CIA模型組和空白對照組大鼠股動脈血，常規分離血清，分別采用間接免疫熒光(IIF)法檢測兩組大鼠血清AKA，酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法檢測Anti-CCP抗體和RF-IgM抗體；分離膝關節滑膜，用40 g/L多聚甲醛固定作為病理標本，進行HE染色。結果CIA模型組大鼠血清AKA陽性5例，空白對照組均陰性。空白對照組和CIA模型組大鼠血清Anti-CCP抗體及RF-IgM抗體水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。空白對照組大鼠關節滑膜病理HE染色可見滑膜細胞排列清晰，組織學結構正常，未見增生，無明顯炎性細胞聚集和浸潤；CIA模型組大鼠關節滑膜病理HE染色可見滑膜細胞排列紊亂，毛細血管增生，滑膜增生明顯，滑膜下大量炎性細胞浸潤。結論CIA大鼠血清中出現AKA陽性，與人類RA的血清免疫學類似，適用于RA的基礎研究。

關節炎,類風濕；大鼠,Wistar；類風濕因子；抗角蛋白抗體；抗環瓜氨酸肽抗體

羅德梅，李文紅，王倩，等.Ⅱ型膠原誘導性關節炎大鼠血清抗角蛋白抗體和抗環瓜氨酸肽抗體及類風濕因子的檢測分析[J].中國全科醫學，2016，19(27)：3287-3290.[www.chinagp.net]

LUO D M,LI W H,WANG Q,et al.Detection analysis of serum anti-keratin antibody,anti-cyclic citrullinated peptide antibody and rheumatoid factor in rats with type Ⅱ collagen-induced arthritis[J].Chinese General Practice，2016，19(27)：3287-3290.

類風濕關節炎(RA)是一種慢性自身免疫性疾病(AID)，以關節滑膜、軟骨損害為主要表現，早期常表現為對稱性多關節腫痛，病情反復后逐漸進展為關節畸形、關節功能喪失，從而嚴重影響患者的生活質量[1]。大量研究證實，在RA的發病過程中，多種細胞因子及炎性遞質共同參與其中，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、滑膜細胞、各種細胞因子及膠原酶等[2]；T淋巴細胞活化的同時又激活了B淋巴細胞，使其轉化為漿細胞，產生抗角蛋白抗體(AKA)、抗環瓜氨酸肽 (Anti-CCP) 抗體、類風濕因子(RF)等。本實驗對Ⅱ型膠原誘導性關節炎(typeⅡcollagen induced arthritis，CIA)模型大鼠血清中AKA、Anti-CCP抗體、RF-IgM抗體進行檢測，并分析其免疫特點和人類RA是否相似。

1　材料與方法

1.1實驗動物2014年11月—2015年3月，SPF級7～8周健康雌性Wistar大鼠15只，體質量(180±20)g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供。實驗期間由新疆醫科大學第一附屬醫院實驗動物科學研究部進行飼養。

1.2方法

1.2.1CIA大鼠模型的建立15只大鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字表法選取5只作為空白對照組，其余10只用于建立CIA模型(CIA造模組)。造模過程：參照文獻[3]方法，將牛Ⅱ型膠原(美國SIGMA公司)溶于提前預冷的0.1 mol/L的冰乙酸溶液中，最終濃度為 4 mg/ml，4 ℃過夜；將等體積的完全弗氏佐劑加入牛Ⅱ型膠原冰乙酸溶液中，在冰浴條件下使二者充分乳化；于大鼠左足跖肉墊及尾根部多點皮內注射牛Ⅱ型膠原乳劑(0.2 ml/只)進行初次免疫。空白對照組5只大鼠則在大鼠左足跖肉墊及尾根部進行多點皮內注射0.9%氯化鈉溶液(0.2 ml/只)。初次免疫后第8天，使用上述乳劑于CIA造模組大鼠左足跖肉墊及尾根部再次加強免疫；空白對照組仍在大鼠左足跖肉墊及尾根部進行多點皮內注射0.9%氯化鈉溶液(0.2 ml/只)。每日用游標卡尺記錄兩組大鼠左足踝關節腫脹情況。

自初次免疫后，每周參照關節炎癥指數(AI)[3]對兩組大鼠進行評分，直至第3周末。AI評分具體操作如下：依據大鼠關節炎表現分為0～4分，0 分即無關節炎癥狀，1 分為單個爪或趾(指)紅腫，2 分為2個關節受累，3 分為2 個以上關節受累，4 分為爪和趾(指)均發生嚴重關節炎。每只大鼠AI評分為4只包括趾(指)在內的整個爪評分之和。初次免疫后第3周末，AI評分≥6分提示造模成功，可用于實驗[3]。剔除未發病的2只大鼠，剩余8只大鼠AI評分均≥6分，造模成功(CIA模型組)。空白對照組5只大鼠均未出現關節腫脹表現。

1.2.2檢測指標造模成功后，兩組大鼠均以10%水合氯醛溶液0.3 ml/100 g 腹腔麻醉，采集股動脈血，常規分離血清。AKA(1∶10)的檢測采用間接免疫熒光(IIF)法，以大鼠食管中1/3冷凍切片為底物，以局限于角質層板層狀、線狀熒光為陽性，AKA試劑盒購自德國歐蒙醫學實驗診斷有限公司。Anti-CCP抗體和RF-IgM抗體的檢測采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法，Anti-CCP抗體試劑盒購自德國歐蒙醫學實驗診斷有限公司，RF-IgM抗體試劑盒購自加拿大Hermes Criterion Biotechnology公司。均嚴格按照說明書步驟進行操作。分離膝關節滑膜，用40 g/L多聚甲醛固定作為病理標本，采用熒光顯微鏡(EUROStarⅡ，addcare2000全自動酶免分析儀)觀察HE染色結果。

2　結果

2.1AI評分結果CIA模型組初次免疫后第2周末部分大鼠出現左足踝及足跖關節腫脹，第3周末上述關節腫脹程度加重，足跖呈鼓槌樣，無法負重，AI評分均≥6分；空白對照組大鼠未出現關節腫脹表現，AI評分均為0分(見圖1)。

注：CIA=Ⅱ型膠原誘導性關節炎，AI=關節炎癥指數

圖1兩組大鼠AI評分

Figure 1AI score of rat in two groups

2.2AKA、Anti-CCP抗體及RF-IgM抗體檢測結果CIA模型組大鼠AKA陽性5例，空白對照組均陰性(見圖2，本文圖2、3彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。空白對照組和CIA模型組大鼠血清Anti-CCP抗體、RF-IgM抗體均陰性。空白對照組和CIA模型組血清Anti-CCP抗體和RF-IgM抗體水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。

Table 1Comparsion of serum Anti-CCP and RF-IgM antibody of rats between two groups

組別只數Anti-CCP抗體RF-IgM抗體空白對照組51.07±0.011.11±0.24CIA模型組81.06±0.032.61±0.51t值0.118.44P值0.360.71

注：CIA=Ⅱ型膠原誘導性關節炎，Anti-CCP=抗環瓜氨酸肽，RF=類風濕因子

圖2　兩組大鼠血清AKA間接免疫熒光結果(×400)

Figure 2Indirect immunofluorescence results of serum AKA of rats in two groups

2.3關節滑膜病理結果空白對照組大鼠關節滑膜病理HE染色可見滑膜細胞排列清晰，組織學結構正常，未見增生，無明顯炎性細胞聚集和浸潤；CIA模型組大鼠關節滑膜病理HE染色可見滑膜細胞排列紊亂，毛細血管增生，滑膜增生明顯，滑膜下大量炎性細胞浸潤(見圖3)。

圖3　兩組大鼠關節滑膜病理結果(HE染色，×200)

3　討論

RA是一種臨床常見的自身免疫性疾病，病因尚未闡明。其主要發病機制是由T細胞介導的異常免疫反應，自身反應性T細胞活化后分泌細胞因子，輔助B細胞產生自身抗體，自身抗體的產生是自身免疫性疾病的特征性表現[4-5]。目前，研究RA疾病的動物模型包括佐劑性關節炎模型(ajudvant arthritis，AA)和CIA。AA雖然在制作上方便簡單，可廣泛應用于多種動物[6]，但其與RA有較大差異，病變具有自限性；CIA是由Ⅱ型膠原誘發的一種免疫性炎癥模型，已被公認為是研究RA的經典動物模型。本研究對CIA模型組大鼠血清中AKA、Anti-CCP抗體和RF進行分析，探討其與人類RA的血清免疫學是否類似。

3.1關節炎表現和HE染色本研究中，空白對照組5只大鼠均未出現關節腫脹表現；CIA模型組部分大鼠在初次免疫第 2周末出現后踝及足跖關節腫脹，第3周末上述關節腫脹程度加重，足跖呈鼓槌樣，無法負重，AI評分≥6分；病理HE染色顯示，空白對照組大鼠滑膜細胞排列清晰，組織學結構正常，未見增生，無明顯炎性細胞的聚集和浸潤，而CIA模型組關節滑膜增生明顯，滑膜細胞排列紊亂，毛細血管增生，滑膜下大量炎性細胞浸潤，說明造模成功。

3.2AKA、Anti-CCP抗體、RF-IgM抗體AKA是一種能與大鼠食管角質層反應的IgG抗體，有文獻報道AKA對RA的診斷靈敏度較低，特異度較高[7]，被認為是RA最特異的生物學指標，并在RA早期甚至臨床癥狀出現前即可出現。本研究中，CIA模型組大鼠血清中AKA陽性率為5/8，空白對照組大鼠血清AKA均陰性，與文獻報道一致[7]。盡管RF是第一個公認的RA免疫標志物，對RA診斷的靈敏度為50%～90%，特異度為50%～95%，但Anti-CCP抗體的靈敏度、特異度在國內外均被肯定優于RF，其檢測在動物模型中未見報道[8]。本研究CIA模型組大鼠血清中僅檢測到Anti-CCP抗體和RF-IgM抗體低水平表達，未檢測到Anti-CCP、RF-IgM抗體陽性。也有文獻報道CIA模型中腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子的滴度升高，未檢測到RF陽性[9]，本研究結果與其相似。考慮原因可能為本研究中CIA模型組大鼠關節滑膜雖有增生、滑膜細胞排列紊亂、滑膜下大量炎性細胞的浸潤，但病變時間短，關節軟骨的破壞程度尚輕，與文獻報道的Anti-CCP抗體陽性者出現骨質破壞較陰性者嚴重[10]相符；也可能與Anti-CCP抗體是判斷RA預后的免疫指標有關。

綜上所述，CIA模型大鼠的免疫特點和人類RA較為相似，進一步證實CIA模型大鼠適用于RA的基礎研究。但本研究納入樣本量較小，今后應擴大樣本量進一步研究。

作者貢獻：羅德梅進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；李文紅進行資料收集；王倩、杜文靜、孟巖、李慧君、閆怡、馮寧進行實驗實施、評估、資料收集；馬秀敏、羅莉進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

[1]UEMURA Y,HAYASHI H,TAKAHASHI T,et al.MMP-3 as a biomarker of disease activity of rheumatoid arthritis[J].Rinsho Byori,2015,63(12):1357-64.

[2]GRANET C,MIOSSEC P.Combination of the proinflammatory cytokines IL-1,TNF-alpha and IL-17 leads to enhanced expression and additional recruitment of AP-1 family members,Egr-1 and NF-kappaB in osteoblast-like cells[J].Cytokine，2004,26(4):169-177.

[3]石磊，李小峰，王彩虹，等.大鼠膠原誘導性關節炎模型的制備及評價[J].臨床醫藥實踐，2011，20(4)：245-247.

SHI L,LI X F,WANG C H,et al.Preparation and evaluation of collagen-induced arthritis model in rats[J].Clinical Medicine,2011，20(4)：245-247.

[4]YANG Z,MATTESON E L,GORONZY J J,et al.T-cell metabolism in autoimmune disease[J].Arthritis Res Ther,2015，17(1):29.

[5]趙小瑩，白寧.甲氨蝶呤聯合阿達木單抗治療類風濕關節炎療效觀察[J].疑難病雜志，2014，13(4)：381-384.

[6]李雅娟，趙麗娜，李莉，等.青蒿琥酯對膠原誘導型關節炎模型大鼠IL-17表達的影響研究[J].中國煤炭工業醫學雜志，2015，19(5)：799-802.

[7]HEIDARI B,FIROUZJAHI A,HEIDARI P,et al.The prevalence and diagnostic performance of anti-cyclic citrullinated peptide antibody in rheumatoid arthritis:the predictive and discriminative ability of serum antibody level in recognizing rheumatoid arthritis[J].Ann Saudi Med,2009,29(6):467-470.

[8]AFZAL N,KARIM S,MAHMUD T E,et al.Evaluation of Anti-CCP antibody for diagnosis of rheumatoid arthritis[J].Clin Lab,2011,57(11/12):895-899.

[9]HOU W,MENG L,TIAN L,et al.A systematic comparison between collagen-induced arthritis and pristane-induced arthritis in Dark Agouti rats[J].Clin Exp Rheumatol,2010,28(4):532-538.

[10]MATUSZEWSKA A,MADEJ M,WILAND P.Immunological markers of rheumatoid arthritis[J].Postepy Hig Med Dosw,2016,70:251-257.DOI:10.5604/17322693.1198270.

(本文編輯：趙躍翠)

Detection Analysis of Serum Anti-Keratin Antibody,Anti-Cyclic Citrullinated Peptide Antibody and Rheumatoid Factor in Rats with Type Ⅱ Collagen-induced Arthritis

LUODe-mei,LIWen-hong,WANGQian,DUWen-jing,MENGYan,LIHui-jun,YANYi,FENGNing,MAXiu-min,LUOLi.

TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,ChinaCorrespondingauthor:MAXiu-min,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;E-mail:maxiumin1210@163.comLUOLi,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;E-mail:luoli.6@163.com

ObjectiveTo detect serum anti-keratin antibody (AKA),anti-cyclic citrullinated peptide (Anti-CCP) antibody and rheumatoid factor (RF) in rats type Ⅱ collagen-induced arthritis (CIA),and to analyze whether they are similar with serum immunology of human rheumatoid arthritis (RA).MethodsAfter one-week adaptive feed,among 15 healthy female Wistar rats (SPF level) aged 7 to 8 weeks,5 were selected as blank control group by random number table method,and 10 for building type Ⅱ CIA model from November 2014 to March 2015,and finally 8 rats′ modeling was successfully built(CIA model group).After successful modeling,femoral artery blood of rats in CIA model group and blank control group was collected,and serum was routinely separated,serum AKA of rats in two groups and Anti-CCP antibody and RF-IgM antibody were detected by indirect immunofluorescence (IIF) method and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method respectively;40 g/L paraformaldehyde fixation was used as pathological specimens to isolate synovium of knee joint.The pathological specimens were conducted with HE staining.ResultsSerum AKA of 5 cases (5/8) were positive in CIA model group,all were negative in blank control group.There was no significant difference in levels of serum Anti-CCP antibody and RF-IgM antibody between rats in blank control group and CIA model group (P>0.05).Pathological HE staining observation of joint synovium of rats in blank control group presented clear arrangement of synovial cells,normal histology structure,no hyperplasia,no significant accumulation and infiltration of inflammatory cells;pathological HE staining observation of joint synovium of rats in CIA model group showed disordered arrangement of synovial cells,capillary proliferation,significant synovial hyperplasia,synovial infiltration of large amount of inflammatory cells.ConclusionSerum of CIA rats group in shows positive AKA,which is similar with serum immunology of human RA,and suits for basic research of RA.

Arthritis,rheumatoid；Rats,Wistar；Rheumatoid factor；Anti-keratin antibody；Anti-cyclic citrullinated peptide antibody

新疆維吾爾自治區自然科學基金資助項目(2014211C047)

830011新疆烏魯木齊市，新疆醫科大學第一附屬醫院(羅德梅，王倩，杜文靜，孟巖，馮寧，馬秀敏，羅莉)；頭屯河區中心醫院(李文紅)；新疆醫科大學基礎醫學院(李慧君，閆怡)

馬秀敏，830011新疆烏魯木齊市，新疆醫科大學第一附屬醫院；E-mail：maxiumin1210@163.com

羅莉，830011新疆烏魯木齊市，新疆醫科大學第一附屬醫院；E-mail：luoli.6@163.com

R 593.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.27.006

2016-02-10；

2016-07-15)