白介素10、E26轉錄因子1和腫瘤相關巨噬細胞在宮頸癌中的表達研究

張 琪，馬 冬，常凌雅，張麗杰，閆錫釗，王 洋，陳麗蓉，李 鷗

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白介素10、E26轉錄因子1和腫瘤相關巨噬細胞在宮頸癌中的表達研究

張 琪，馬 冬，常凌雅，張麗杰，閆錫釗，王 洋，陳麗蓉，李 鷗

背景宮頸癌是女性高發的惡性腫瘤之一。白介素10(IL-10)作為一種具有免疫抑制作用的細胞因子對宮頸癌變的發生、發展具有重要作用。腫瘤相關巨噬細胞(TAM)、E26轉錄因子1(Ets1)均可促進腫瘤的生長、侵襲和遷移。目的探討宮頸癌組織中IL-10、Ets1和TAM的表達情況及其與宮頸癌的關系。方法選取2014年9月—2016年3月唐山工人醫院住院部收治的宮頸上皮內瘤變(CIN)患者72例為CIN組，宮頸鱗癌患者76例為鱗狀細胞癌(SCC)組，行全子宮切除術的子宮良性病變患者40例為正常組。采用簡單隨機抽樣法選取3例SCC組宮頸組織及3例正常組宮頸組織進行基因芯片雜交測序；采用RT-qPCR法檢測所有患者宮頸組織中IL-10、Ets1 mRNA表達水平，免疫雙熒光共定位法檢測宮頸組織中TAM情況及表達IL-10、Ets1的TAM(IL-10+TAM、Ets1+TAM)水平，分析IL-10+TAM、Ets1+TAM水平與SCC組患者臨床資料的關系。結果與正常組宮頸組織比較，IL-10在SCC組宮頸組織中表達上調3.4倍，Ets1表達上調2.9倍(P<0.05)。CIN組、SCC組IL-10、Ets1 mRNA表達水平高于正常組(P<0.05)；SCC組IL-10、Ets1 mRNA表達水平高于CIN組(P<0.05)。CIN組、SCC組IL-10 mRNA表達水平與Ets1 mRNA表達水平均呈正相關(r=0.453，P<0.01；r=0.456，P<0.01)。正常組、CIN組、SCC組宮頸組織中TAM逐漸增多。CIN組、SCC組IL-10+TAM、Ets1+TAM水平高于正常組(P<0.05)；SCC組IL-10+TAM、Ets1+TAM水平高于CIN組(P<0.05)。SCC組患者IL-10+TAM、Ets1+TAM水平與年齡、腫瘤大小無關(P>0.05)；SCC組患者IL-10+TAM、Ets1+TAM水平與分化程度、臨床分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)。結論IL-10、Ets1和TAM表達水平隨宮頸病變進展而升高，TAM及其分泌的IL-10、Ets1可能與宮頸癌及臨床預后有關。

宮頸腫瘤；白細胞介素10；E26轉錄因子1；巨噬細胞

張琪，馬冬，常凌雅，等.白介素10、E26轉錄因子1和腫瘤相關巨噬細胞在宮頸癌中的表達研究[J].中國全科醫學，2016，19(27)：3306-3310.[www.chinagp.net]

ZHANG Q,MA D,CHANG L Y,et al.Expression of interleukin-10,E26transformation factor-1 and tumor-associated macrophages in cervical cancer[J].Chinese General Practice，2016，19(27)：3306-3310.

【Abstract】BackgroundCervical cancer is one of the women malignant tumors with high incidence.Interleukin 10 (IL-10),as a kind of cytokine with immunosuppressive effects,plays an important role in the occurrence and development of cervical cancer.Both tumor-associated macrophages (TAM) and E26transcription factor 1 (Ets1) can promote tumor growth,invasion and migration.ObjectiveTo investigate the expression of IL-10,Ets1 and TAM in cervical carcinoma tissues and their correlation with cervical cancer.Methods72 cervical intraepithelial neoplasia (CIN) patients,76 cervical squamous cell carcinoma (SCC) patients and 40 benign uterine lesion patients underwent total hysterectomy,who were under treatment in Inpatient Department of Tangshan Gongren Hospital from September 2014 to March 2016,were selected into CIN group,SCC group and normal group separately.3 subjects with cervical tissues in SCC group and 3 with cervical tissues in normal group were selected to make microarray hybridization sequencing by simple random sampling method;the expression levels of IL-10 and Ets1 mRNA in cervical tissues were detected by RT-qPCR method in all patients,the status and expression of TAM and TAM that IL-10 and Ets1 levels expressed by TAM (IL-10+TAM,Ets1+TAM) were detected by double immunofluorescence colocalization method,and the relationship between levels of IL-10+TAM,Ets1+TAM and clinical data was analyzed.ResultsComparing with cervical tissues of normal group,the expression of IL-10 in cervical tissues of SCC group upregulated 3.4 times,and Ets1 upregulated 2.9 times (P<0.05).Expression levels of IL-10 and Ets1 mRNA in CIN group and SCC group were higher than those in normal group (P<0.05);expression levels of IL-10 and Ets1 mRNA in SCC group were higher than those in CIN group (P<0.05).The expression level of IL-10 mRNA in CIN group and SCC group was positively correlated with the expression level of Ets1 mRNA (r=0.453,P<0.01;r=0.456,P<0.01).TAM increased gradually in cervical tissues in normal group,CIN group and SCC group.The levels of IL-10+TAM and Ets1+TAM in CIN group and SCC group were higher than those in normal group (P<0.05);the levels of IL-10+TAM and Ets1+TAM in SCC group were higher than those in CIN group (P<0.05).The levels of IL-10+TAM and Ets1+TAM in patients of SCC group were not related to age and tumor size (P>0.05);the levels of IL-10+TAM and Ets1+TAM in patients of SCC group were related to differentiated degree,clinical stage of cervical cancer and lymph node metastasis (P<0.05).ConclusionThe expression level of IL-10,Ets1 and TAM increases with the progression of cervical lesions,TAM and its secreted IL-10 and Ets1 may be related to cervical cancer and clinical prognosis.

近年來宮頸癌的發病呈現低齡化趨勢[1]。白介素10(IL-10)作為一種與宮頸癌的發生、發展密切相關的免疫抑制因子，其表達調控主要發生在轉錄期間。因此，研究參與IL-10轉錄調控的轉錄因子進而對轉錄因子干預進行抗炎治療[2]。E26轉錄因子1(Ets1)是一種癌基因，其參與細胞生長和細胞外基質侵襲，在腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲中起重要作用[3]。研究報道，在宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤中，Ets1通過高表達在腫瘤浸潤、轉移中發揮重要作用[4]。另外，在腫瘤微環境中，腫瘤相關巨噬細胞(TAM)很少發揮抗原提呈和吞噬作用，而是通過自分泌、旁分泌多種細胞因子，誘導腫瘤周圍微血管和淋巴管的生成，進而促進腫瘤細胞附著于血管表面，催化腫瘤外基質的降解和重建，對腫瘤的生長、侵襲和遷移發揮重要作用[5]。盡管已有研究報道，鱗狀細胞癌(SCC)組織中TAM高表達高遷移率族蛋白1(HMGB1)促進淋巴管的生成[6]，但是TAM相關免疫調節基因的表達是否促進宮頸腫瘤細胞的免疫逃逸和侵襲的研究尚未見報道。因此，本研究通過基因芯片雜交測序及RT-qPCR法檢測免疫調節相關基因IL-10和Ets1在宮頸組織中的表達水平，通過免疫雙熒光共定位法檢測宮頸組織中TAM情況及表達IL-10、Ets1的TAM(IL-10+TAM、Ets1+TAM)水平，并分析宮頸癌患者IL-10+TAM、Ets1+TAM水平與臨床資料的關系，旨在為宮頸癌的預防、診斷和治療提供分子靶點和實驗依據。

1　對象與方法

1.1研究對象選取2014年9月—2016年3月唐山工人醫院住院部收治的宮頸上皮內瘤變(CIN)患者72例為CIN組，宮頸鱗癌患者76例為SCC組，行全子宮切除術的子宮良性病變患者40例為正常組。CIN組及SCC組納入標準：(1)臨床資料完整；(2)病理明確診斷為CIN、SCC；(3)術前未接受過放、化療。排除標準：(1)術前3個月內曾行宮頸治療，如陰道用藥、激光治療等；(2)患者為妊娠狀態；(3)同時合并其他婦科惡性腫瘤，如子宮內膜癌、卵巢癌等；(4)同時合并其他臟器腫瘤，如腸道、乳腺腫瘤等。正常組納入標準：宮頸薄層液基細胞學檢查未見非典型鱗狀細胞或癌細胞。排除標準與CIN組及SCC組相同。所取標本均經本院病理科主任醫師證實，且取材前均未行放、化療或免疫治療。標本收集后于-80 ℃冰箱保存。所有患者知情同意，本研究經唐山工人醫院倫理委員會批準。按宮頸癌國際婦產科聯盟(FIGO)(2000年)臨床分期標準分期，病理類型及分級按WHO標準[7]。

1.2研究方法

1.2.1基因芯片雜交測序采用簡單隨機抽樣法選取3例SCC組宮頸組織及3例正常組宮頸組織，采用Trizol試劑提取組織總RNA(總含量>100 ng)，送康成生物公司進行mRNA芯片篩查。

1.2.2RT-qPCR法檢測宮頸組織中IL-10、Ets1 mRNA表達水平將液氮保存的宮頸組織按Trizol試劑盒說明書提取組織總RNA，以RNA為模板，采用反轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)合成cDNA，然后以cDNA為模板進行qPCR反應，采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參。IL-10上游引物序列為5′-ACAAAGGAAGGAGGGGTTCAC-3′，下游引物序列為5′-AGAAGTGGACTCAGCATGGG-3′；Ets1上游引物序列為5′-GATCTGCTCTCCGGCAAAGT-3′，下游引物序列為5′-GTGTTGCTAGGTCCTTGCCT-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3′，下游引物序列為5′-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3′。擴增反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，72 ℃ 35 s，共40個循環。采用2-△△Ct法計算目的基因mRNA表達水平，每組實驗重復3次。

1.2.3免疫雙熒光共定位法檢測宮頸組織中TAM情況及IL-10+TAM、Ets1+TAM水平組織切片二甲苯脫蠟至水后進行高壓抗原修復，10%山羊血清室溫下封閉1 h，隨后共孵育鼠抗人多克隆抗體CD68(1∶50稀釋)和兔抗人單克隆抗體IL-10(1∶50稀釋)及鼠抗人多克隆抗體CD68(1∶50稀釋)和兔抗人多克隆抗體Ets1(1∶50稀釋)，4 ℃孵育過夜，Fluorescein標記的抗鼠二抗(anti-CD68，1∶100稀釋，綠色)和Rhodamine標記的抗兔二抗(anti-IL-10、anti-Ets1，1∶100稀釋，紅色)，室溫孵育45 min，二脒基苯基吲哚(DAPI)染核呈藍色。anti-CD68確定TAM(綠色)，同時anti-IL-10及anti-Ets1共染色確定IL-10、Ets1表達情況(黃色)。熒光顯微鏡下觀察宮頸組織中TAM情況及IL-10+TAM、Ets1+TAM熒光強度，采用Image Pro-Plus 6.0定量分析IL-10+TAM、Ets1+TAM水平。

2　結果

2.1基因芯片雜交測序結果與正常組宮頸組織比較，免疫調節相關基因(Tnf、IL-10、Prox1、Rad23a、Tarbp2、Hpn、Ccl4、Stat3、Ccl20、Il2rg、Ets1)在SCC組宮頸組織中表達上調，其中IL-10表達上調3.4倍，Ets1表達上調2.9倍(P<0.05，見圖1、表1，本文圖1、2彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

2.2IL-10、Ets1 mRNA表達水平比較正常組、CIN組、SCC組IL-10、Ets1 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.01)；其中CIN組、SCC組IL-10、Ets1 mRNA表達水平高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；SCC組IL-10、Ets1 mRNA表達水平高于CIN組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3相關性分析CIN組、SCC組IL-10 mRNA表達水平與Ets1 mRNA表達水平均呈正相關(r=0.453，P<0.01；r=0.456，P<0.01)。

注：IL-10=白介素10，，Ets1=E26轉錄因子1

圖1正常組宮頸組織與SCC組宮頸組織基因芯片雜交測序結果

Figure 1Results of gene chip hybridization sequencing of cervical tissues between normal group and SCC group

表1正常組宮頸組織與SCC組宮頸組織基因表達差異分析

Table 1Differential analysis of gene expression of cervical tissues between normal group and SCC group

P值基因調節倍數基因編碼基因名稱0.007上調5.27124Tnf0.007上調3.43586IL-100.036上調3.35629Prox10.011上調2.85886Rad23a0.032上調2.76895Tarbp20.014上調2.53249Hpn0.031上調2.16351Ccl40.012上調2.06774Stat30.018上調2.46364Ccl200.013上調2.53561Il2rg<0.01上調2.92113Ets1

Table 2Comparison of expression level of IL-10 and Ets1 mRNA in normal group,CIN group and SCC group

組別例數IL-10mRNAEts1mRNA正常組401.00±0.111.00±0.38CIN組722.13±0.96a1.73±0.97aSCC組763.02±1.75ab2.87±1.64abF值33.9834.60P值<0.01<0.01

注：CIN=宮頸上皮內瘤變組，SCC=鱗狀細胞癌，IL-10=白介素10，Ets1=E26轉錄因子1；與正常組比較，aP<0.05；與CIN組比較，bP<0.05

2.4宮頸組織中TAM情況及IL-10+TAM、Ets1+TAM水平比較正常組、CIN組、SCC組宮頸組織中TAM逐漸增多(見圖2)。正常組、CIN組、SCC組IL-10+TAM、Ets1+TAM水平比較，差異有統計學意義(P<0.01)；其中CIN組、SCC組IL-10+TAM、Ets1+TAM水平高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；SCC組IL-10+TAM、Ets1+TAM水平高于CIN組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

2.5SCC組患者IL-10+TAM、Ets1+TAM水平與臨床資料的關系SCC組患者IL-10+TAM、Ets1+TAM水平與年齡、腫瘤大小無關(P>0.05)；SCC組患者IL-10+TAM、Ets1+TAM水平與分化程度、臨床分期、淋巴結轉移有關(P<0.05，見表4)。

3　討論

宮頸癌具有較強的轉移能力，給臨床治療和患者預后帶來巨大挑戰。已有研究顯示，腫瘤細胞轉移與TAM分泌炎性細胞因子有關[8]。腫瘤微環境一直處于復雜的慢性炎癥狀態，其周圍充滿豐富的炎性遞質和炎性細胞。TAM作為一種關鍵的炎性細胞在腫瘤相關炎癥中扮演極其重要的角色，其分泌多種細胞因子幫助腫瘤細胞生長，促進新生血管生成，同時還能抑制機體的獲得性免疫，從而為腫瘤細胞的浸潤和轉移創造條件[9-10]。IL-10處于免疫調節的中心環節，通過多種途徑抑制機體免疫系統對腫瘤的殺傷作用，進而促進腫瘤發生、發展及轉移[11]。IL-10基因的表達主要是通過啟動子區一系列轉錄因子的結合進行調控，這些轉錄因子包括Ets1、猴病毒40(SV40)基因啟動子區(SP1)、CCA AT/增強子結合蛋白β和信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3)[12]。Ets1在腫瘤的浸潤、轉移中，參與降解途徑基因的調節，同時也可調節更為廣泛的細胞外基質(ECM)的相關靶基因，包括基質蛋白以及其他參與細胞-基質反應的細胞成分[13]。由此看出，TAM、IL-10、Ets1在細胞的增殖、變異、凋亡和淋巴細胞的發展、轉化、侵襲中均起作用，而三者間的相互關系及其與臨床預后的關系尚未見報道。

Table 3Comparison of IL-10+TAM,Ets1+TAM levels in normal group,CIN group,and SCC group

組別例數IL-10+TAMEts1+TAM正常組2.48±1.522.16±1.52CIN組7.20±4.36a6.98±4.75aSCC組10.83±6.35ab9.20±5.62abF值38.3829.63P值<0.01<0.01

注：與正常組比較，aP<0.05；與CIN組比較，bP<0.05

注：CIN=宮頸上皮內瘤變，SCC=鱗狀細胞癌，DAPI=二脒基苯基吲哚；DAPI染核呈藍色，IL-10、Ets1陽性表達呈紅色，CD68陽性表達呈綠色，IL-10+TAM、Ets1+TAM呈黃色

圖2宮頸組織中TAM情況及IL-10+TAM、Ets1+TAM熒光強度(免疫雙熒光染色，×200)

Figure 2TAM in cervical tissues and fluorescence intensity of IL-10+TAM,Ets1+TAM

表4　SCC組患者IL-10+ TAM、Ets1+ TAM水平與臨床資料的關系

本研究結果顯示，與正常組宮頸組織比較，IL-10在SCC組宮頸組織中表達上調3.4倍，Ets1表達上調2.9倍；CIN組、SCC組IL-10、Ets1 mRNA表達水平高于正常組，SCC組IL-10、Ets1 mRNA表達水平高于CIN組。提示IL-10、Ets1的表達水平隨著宮頸病變進展而升高，說明IL-10、Ets1與宮頸病變的進展有關。CIN組、SCC組IL-10 mRNA表達水平與Ets1 mRNA表達水平均呈正相關，提示IL-10、Ets1在宮頸惡性病變進展中有協同作用。正常組、CIN組、SCC組宮頸組織中TAM逐漸增多，CIN組、SCC組IL-10+TAM、Ets1+TAM水平高于正常組，SCC組IL-10+TAM、Ets1+TAM水平高于CIN組，提示TAM與宮頸病變進展有關。SCC組患者IL-10+TAM、Ets1+TAM水平與分化程度、臨床分期、淋巴結轉移有關，提示TAM及其分泌的IL-10、Ets1對宮頸癌的臨床預后有影響，可以為宮頸癌的預防、診斷和治療提供分子靶點和實驗依據。研究顯示，IL-10是腫瘤的危險指標和預后的影響因子[14]；在不同病理宮頸組織中，Ets1轉錄和翻譯水平與腫瘤惡性程度和生物學行為如淋巴結轉移和遠處轉移密切相關[15]，本研究結果與之相似。

本研究僅局限在臨床組織水平，未深入探討分子機制，這是本研究的一個限制。因此本課題組后續將進一步從細胞水平研究轉錄因子Ets1是否調控IL-10及其促進宮頸病變的分子機制。另外，本研究只證實了TAM是IL-10表達升高促使腫瘤細胞免疫抑制的來源之一，而其他免疫細胞如自然殺傷細胞、樹突狀細胞也可能是其來源，這有待進一步證實。

綜上所述，IL-10、Ets1和TAM表達水平隨宮頸病變進展而升高，TAM及其分泌的IL-10、Ets1可能與宮頸病變及臨床預后有關。本研究結果為課題組進一步研究免疫細胞中Ets1調控表達IL-10的分子機制及以TAM作為治療靶點的研究提供線索。

作者貢獻：張琪進行試驗實施、樣本收集、資料整理、撰寫論文；常凌雅、張麗杰、閆錫釗、王洋、陳麗蓉進行資料收集、數據處理；馬冬、李鷗進行試驗設計、質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Expression of Interleukin-10,E26Transformation Factor-1 and Tumor-associated Macrophages in Cervical Cancer

ZHANGQi,MADong,CHANGLing-ya,ZHANGLi-jie,YANXi-zhao,WANGYang,CHENLi-rong,LIOu.

GraduateSchool,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,ChinaCorrespondingauthor:MADong,SchoolofPublicHealth,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China;E-mail:mamamadong@163.comLIOu,DepartmentofObstetricsandGynecology,TangshanGongrenHospital,Tangshan063000,China;E-mail:tsliou@163.com

Uterine cervical neoplasms;Interleukin-10;Ets1 transcription factor;Macrophages

國家自然科學基金資助項目(81541149)；河北省自然科學基金(青年科學基金)資助項目(H 2016209046)

063000 河北省唐山市，華北理工大學研究生學院(張琪，常凌雅，張麗杰，閆錫釗)，公共衛生學院(馬冬，王洋)；遷西縣中醫院(陳麗蓉)；唐山工人醫院婦產科(李鷗)

馬冬，063000 河北省唐山市，華北理工大學公共衛生學院；E-mail：mamamadong@163.com

李鷗，063000 河北省唐山市，唐山工人醫院婦產科；E-mail：tsliou@163.com

R 737.33

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.27.010

2016-06-12；

2016-08-03)