羧胺三唑與SAHA聯合用藥抑制Lew is肺癌細胞的體內外研究Δ

郭磊　陳晨　吳宏亮　鞠瑞　朱蕾　李娟　葉菜英#中國醫學科學院基礎醫學研究所藥理學系，北京00005中國醫學科學院腫瘤醫院麻醉科，北京　000

羧胺三唑與SAHA聯合用藥抑制Lew is肺癌細胞的體內外研究Δ

郭磊1*陳晨1*吳宏亮2鞠瑞1朱蕾1李娟1葉菜英1#
1中國醫學科學院基礎醫學研究所藥理學系，北京1000052中國醫學科學院腫瘤醫院麻醉科，北京100021

目的研究羧胺三唑（CAI）與組蛋白去乙酰化酶抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）聯合用藥對Lew is肺癌細胞的抑制作用，對比聯合用藥與單藥使用的藥效差異。方法采用SRB法檢測體外培養的Lew is肺癌細胞系在單獨使用CAI或SAHA以及聯合用藥時的細胞活力變化；建立C57小鼠Lew is肺癌細胞皮下移植瘤模型，隨機分為4組：溶劑對照組、CAI組、SAHA組、CAI+SAHA聯合治療組，連續給藥25天，觀察各組小鼠體質量變化、腫瘤體積、腫瘤抑制率及動物死亡情況。結果CAI分別和兩種劑量的SAHA聯合用藥后，對Lew is肺癌細胞活力的抑制作用高于CAI組，細胞活力的抑制率分別達到46.09%±5.50%和54.43%±3.69%，差異均有統計學意義（P＜0.01）。動物實驗顯示，與對照組相比，CAI組、SAHA組以及聯合治療組均抑制小鼠皮下腫瘤生長，且聯合治療組的腫瘤體積小于其他3組；除對照組外，各藥物治療組動物死亡率均低于20%。結論SAHA與CAI聯合使用能顯著抑制Lew is肺癌細胞活力，并在Lew is肺癌細胞荷瘤動物中顯現抗瘤增效作用。

Lew is肺癌細胞；羧胺三唑；辛二酰苯胺異羥肟酸；聯合用藥；體內外研究

Kew words:Lew is lung carcinoma；carboxyam idotriazole；suberoylanilide hydroxam ic acid；combined treatment；in vitro and in vivo study

Oncol Prog，2016，14（4）

肺癌是目前全球死亡率最高的腫瘤之一，雖然針對特定類型的肺癌治療已取得突破性進展，但大部分肺癌依然無法攻克，關于肺癌的藥物治療仍有極大的探索空間。羧胺三唑（carboxyam idotriazole，CAI）是本課題組多年來一直研究的一種小分子藥物，該藥物能夠抑制多種腫瘤細胞系的增殖、侵襲和轉移，并可誘導多種腫瘤細胞凋亡。體外實驗中，CAI對于Lew is肺癌細胞、A549肺腺癌細胞、NCI-H209和H345小細胞肺癌細胞的增殖均有顯著抑制作用［1-2］，且CAI用于治療非小細胞肺癌的III期臨床試驗也正在進行中。本課題組在體內實驗中發現，CAI單獨使用時相比細胞毒類藥物其抗腫瘤作用較弱，但其突出特點是不良反應輕微。為了改進羧胺三唑的抗腫瘤效果，特選取了一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilide hydroxam ic acid，SAHA）進行聯合用藥，從細胞水平和動物水平評估兩種小分子藥物聯合使用的抗腫瘤效果，為建立高效低毒的肺癌治療方案提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料

Lew is肺癌（lew is lung carcinoma，LLC）細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，用DMEM高糖培養基（加入10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、50 mg/m l青霉素和100 mg/m l鏈霉素）在37℃、5%CO2培養箱中培養。CAI由本課題組合成，高效液相色譜法檢測其純度達99%以上。SAHA購自美國Selleck公司，用DMSO配制成10 mmol/L儲存液，-20℃保存。磺酰羅丹明B（sulforhodamine B，SRB）染料、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、乙酸、Tris堿購自國藥集團化學試劑有限公司，羥丙基-β-環糊精（hydroxypropyl-beta-cyclodextrin，HOP-β-CD）購自百靈威科技有限公司。

1.2實驗動物

C57BL/6小鼠，雄性［許可證號：SCXK（京）2014-0004］，6～8周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。常溫環境飼養［溫度（22±2）℃，濕度40%～70%］，12 h明/暗周期。動物自由攝食、飲水。

1.3實驗方法

1.3.1SRB法測定細胞活力將LLC細胞接種至96孔板，1×104/孔，培養12 h，待細胞貼壁后，棄去原培養基，分別加入空白培養基（不含血清）和含有DMSO、CA（I20 μM）、SAHA（1 μM和5 μM）以及SAHA（1 μM和5 μM）+CA（I20 μM）的完全培養基（含血清）200 μl進行孵育，SAHA單藥及聯合用藥劑量參照同類研究用量而定［3］，每個劑量組4孔。藥物作用24 h后，每孔加入50 μl預冷的50%三氯乙酸進行固定。4℃靜置1 h，去離子水洗滌5次。在空氣中晾干后，每孔加入1%乙酸配制的0.4%SRB染料100 μl，室溫靜置20 min。棄去染料后，用1%的乙酸洗滌5次，在空氣中晾干。用pH值為10.5的10 mM非緩沖Tris堿液150 μl溶解，振搖5 min后用全波長酶標儀在515 nm處測定吸光度。

1.3.2動物接種腫瘤LLC細胞貼壁長滿單層后用0.25%胰蛋白酶消化，將細胞懸液緩慢吹打混勻，1000 r/min離心5 m in，收集細胞，用滅菌的PBS重懸，調整細胞密度為1×107/m l。每只小鼠取100 μl細胞懸液，皮下接種至左側腋窩。接種腫瘤細胞后第5天，在動物腋窩下可觸到瘤結節，荷瘤動物隨機分組并給藥，給藥方案如表1所示。

表1　CAI及SAHA單獨用藥與聯合用藥給藥方案

1.3.3測量腫瘤體積并評價腫瘤抑制率自接種腫瘤后第8天，每周測量3次腫瘤長、寬直徑，根據如下公式，計算腫瘤體積（長、寬單位：cm）：

1.3.4評價藥物毒性每日稱量小鼠體質量，并繪制小鼠體質量變化曲線。根據接種腫瘤后第5天（給藥前）和接種腫瘤后第29天（給藥后）的動物體質量，計算末體質量（FBW）/初體質量（IBW），其中FBW為29天時小鼠的去瘤體質量。FBW/IBW≥0.85，提示藥物毒副作用輕微，小鼠能夠耐受；FBW/IBW＜0.85則提示小鼠對藥物有一定的不良反應［4］；治療期間如果給藥組動物死亡超過20%，表示藥物具有毒性。

1.4統計學分析

實驗結果采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。體外實驗中，不同藥物處理組進行單因素方差分析后，再進行兩兩組間LSD-t檢驗；動物荷瘤實驗結果采用重復測量方差分析，評價藥物單用及聯合用藥的抑瘤作用。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1CAI和SAHA單獨或聯合作用后對細胞活力的抑制作用

藥物作用24 h后，CAI（20 μM）和SAHA（1 μM和5 μM）以及SAHA（1 μM和5 μM）+CAI（20 μM）均能夠顯著地降低LLC細胞的增殖活力，與溶劑對照組相比，分別下降了29.64%±2.42%（P＜0.01），13.03%±4.67%（P＜0.05）和39.56%±4.23%（P＜0.01）。CAI和兩種劑量SAHA聯合用藥組對細胞活力的抑制作用明顯高于CAI單獨治療組，細胞活力的抑制率分別達到46.09%±5.50%和54.43%± 3.69%，差異均有統計學意義（P＜0.01），SAHA對CAI的增效作用非常顯著（圖1）。

2.2CAI和SAHA單獨或聯合用藥對荷瘤小鼠腫瘤體積的影響

從接種腫瘤后第20天（動物用藥第16天）開始，CAI（30 mg/kg）與SAHA（50 mg/kg）聯合治療組的腫瘤體積開始明顯小于溶劑對照（Control）組（P＜0.05），同時也小于單藥治療組；接種腫瘤后第22、25、27、29天，SAHA單藥治療組的抑瘤作用逐步明顯，腫瘤體積相比對照組顯著縮小（P＜0.05，P＜0.01）；CAI單藥治療組腫瘤體積雖有縮小趨勢，但第22天和第25天的腫瘤體積與溶劑對照組相比差異無統計學意義；自第27天起，溶劑對照組腫瘤體積進一步增大，CAI組表現出顯著的抑瘤作用（P＜0.05）。CAI與SAHA聯合治療組的腫瘤體積則顯著小于對照組和各單藥治療組，兩者合用后的抗瘤增效作用十分明顯（圖2、圖3）。

圖1　CAI（20 μM）和SAHA（1μM和5μM）單獨或聯合作用后對細胞活力的抑制作用

圖2　CAI組、SAHA組和聯合治療組荷瘤小鼠的腫瘤體積隨時間的變化

圖3　接種腫瘤后第8～29天各組小鼠腫瘤體積分布圖

2.3小鼠給藥前后的體重比值（FBW/IBW）及各組動物的死亡情況

如表2所示，采用CAI（30 mg/kg）單藥、SAHA（50 mg/kg）單藥以及兩者聯合用藥治療25天后，各藥物治療組FBW/IBW值均大于0.85，提示藥物毒副作用不明顯，聯合用藥組的FBW/IBW為（0.99±0.05），相比單藥治療組并未減小，初步說明在此劑量下聯合用藥時藥物的毒副作用沒有增加。除對照組有4只小鼠因腫瘤體積過大死亡外，藥物治療組動物死亡比例均低于20%，亦說明藥物的毒性低。

3　討論

羧胺三唑是一種非細胞毒類的新型抗癌藥物，它通過影響腫瘤細胞的信號傳導體系干擾腫瘤細胞周期及促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增生和轉移［5-8］；此外，CAI還能夠阻滯腫瘤血管生長因子（VEGF）的信號傳導通路，抑制腫瘤新生血管內皮細胞，從而抑制腫瘤新生血管的生成，抑制腫瘤的生長和轉移［9-10］。近年來，我們還證實CAI能明顯地減輕化學物質引起的炎性反應及減輕炎癥引起的疼痛，這一作用與其抑制多種炎性介質釋放有關［11-12］。在美國進行的有關CAI抗腫瘤作用的一些臨床試驗未能得到理想的結果，迄今該藥物尚未通過美國FDA的批準，但由于其作用靶點的特殊性，CAI不良反應輕微，明顯低于細胞毒類藥物，在腫瘤治療領域仍具備獨特的優勢，尋找高效低毒的聯合用藥方案或可彌補CAI的不足。

表2　CAI、SAHA及CAI+SAHA組荷瘤小鼠的體質量變化和死亡情況（±s）

表2　CAI、SAHA及CAI+SAHA組荷瘤小鼠的體質量變化和死亡情況（±s）

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組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylases inhibitor，HDACi）是一類新型的抗腫瘤藥物，具有高效、低毒的特點，其作用于腫瘤細胞后能夠抑制腫瘤細胞增殖，阻滯細胞周期，促進細胞分化或凋亡［13-14］。SAHA是最具代表性的組蛋白去乙酰化酶抑制劑之一，它能通過組蛋白的乙酰化使染色質重塑為促進基因轉錄的疏松結構，重新激活腫瘤細胞中由于異常的組蛋白去乙酰化而表達受阻的基因，誘導腫瘤細胞凋亡［15］。本研究首次考察了CAI與SAHA聯合用藥的抗腫瘤效果，體外實驗結果顯示，較低濃度的SAHA（1 μM和5 μM）能夠明顯增強CAI抑制Lew is肺癌細胞增殖的能力；體內實驗則進一步證實SAHA（50 mg/kg）與CAI聯合使用較單藥更能有效地降低腫瘤負荷。而且，從荷瘤動物的體質量變化和死亡情況判斷，該劑量的SAHA并未增加藥物的毒性。

課題組近幾年對CAI的抗腫瘤機制進行了深入研究后發現，CAI能夠抑制腫瘤相關巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），基于此機制，體外實驗顯示其可抑制LLC細胞增殖、遷移和侵襲，在LLC荷瘤動物中降低腫瘤負荷并延長荷瘤動物生存期［2］。同樣，SAHA除了具有抗腫瘤作用之外，還具有抗炎和抑制血管新生的特性。SAHA可阻斷臍靜脈內皮細胞中VEGF信號通路，抑制體內外致炎細胞因子的產生［16-17］。因此，關于SAHA與CAI合用時的抗瘤增效機制，一方面可能源于SAHA通過組蛋白的乙酰化，重新激活腫瘤細胞中表達受阻的基因，與CAI協同誘導腫瘤細胞凋亡；另一方面也可能是兩者通過不同的、互補的機制抑制炎癥，從而延緩腫瘤的發生發展。從分子、細胞和整體水平上證實上述作用機制將是我們后續的重點研究內容。

SAHA與CAI聯合使用增加了對Lew is肺癌細胞的抑瘤效果而未增加毒副作用，這一優勢為兩者今后在臨床上聯合使用、增效互補提供了理論依據，也代表了一種可能的新型、有效、耐受良好的化療方案。

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In vitro and in vivo study of the inhibitory effect of the combination of CAI and SAHA on Lew is lung carcinoma cellsΔ

GUO Lei1*CHEN Chen1*WU Hong-liang2JU Rui1ZHU Lei1LI Juan1YE Cai-ying1#
1Department of Pharmacology，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100005，China
2Department of Anesthesiology，Cancer Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China

Objective To study the inhibitory effect of the combination of CAI and SAHA on Lew is lung carcinoma（LLC）and evaluate the pharmacodynam ic difference between the combined and single-agent treatment.Method SRB was performed to investigate the viability of LLC cells treated w ith CAI or SAHA alone，or in combination；LLC transplanted model was established in C57 m ice and the models were random ized into 4 groups，namely vehicle control group，CAI group，SAHA group and CAI+SAHA combination group.The indicated solvent or drugs were adm inistered continuously for 25 days and the change of body weight，tumor volume，tumor inhibition rate and death of mice were observed. Result The combinations of CAI and two different doses of SAHA showed stronger inhibitory effect on LLC cells viability than single CAI treatment.The inhibition rate of the combined treatment was 46.09%±5.50%and 54.43%±3.69%，（P＜0.01），respectively.In vivo experiment showed that all treatments，including single CAI，single SAHA and combined treatment significantly inhibited LLC tumor grow th compared w ith vehicle control.Moreover the tumor volume in mice treated w ith the combination was significantly smaller than that in control group and single-drug treated groups.Death rate of animals in all study groups but the control group was below 20%.Conclusion The combination of CAI and SAHA inhibits LLC cells viability significantly and shows synergistic anti-tumor effect in vivo.

R734.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.09

2016-03-16）

國家自然科學基金青年基金（81402923）；北京協和醫學院2015協同創新基金（3332015168）

*兩位作者對本文的貢獻一致

（corresponding author），郵箱：caiyingye@126.com