外周血鐵調(diào)素25 mRNA及蛋白表達(dá)水平在白血病患兒中的臨床價值

楊衛(wèi)紅　李培嶺　李樹軍

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1兒科，2小兒內(nèi)一科，3小兒內(nèi)三科，河南　新鄉(xiāng)　453100

外周血鐵調(diào)素25 mRNA及蛋白表達(dá)水平在白血病患兒中的臨床價值

楊衛(wèi)紅1#李培嶺2李樹軍3

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1兒科，2小兒內(nèi)一科，3小兒內(nèi)三科，河南新鄉(xiāng)453100

目的觀察急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）患兒外周血鐵調(diào)素25（Hepc-25）mRNA和蛋白表達(dá)情況，并探討其與ALL化療療效的關(guān)系。方法選取接受MR方案治療的白血病患兒93例作為觀察組，另選取同期20例健康體檢兒童作為對照組。采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定兩組外周血中Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平。分析Hepc-25與ALL療效的關(guān)系。結(jié)果白血病患兒外周血Hepc-25 mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)治療好轉(zhuǎn)組患兒外周血Hepc-25 mRNA及蛋白表達(dá)水平較治療前均下降（P＜0.05）；而治療無效組患兒Hepc-25 mRNA及蛋白表達(dá)水平較治療前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論ALL患兒外周血Hepc-25過表達(dá)對疾病復(fù)發(fā)有一定的預(yù)測價值，與白血病患兒的化療療效有密切關(guān)系。

急性淋巴細(xì)胞白血病；患兒；Hepc-25；化療療效

Oncol Prog，2016，14（4）

急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一類造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，其特點是骨髓及其他造血組織中大量無核細(xì)胞增殖失控，分化障礙，凋亡受阻，停止在細(xì)胞發(fā)育的不同階段，而白血病細(xì)胞大量增生累積，并浸潤其他組織和器官，進(jìn)而導(dǎo)致正常造血功能受到抑制。主要臨床癥狀有不同程度的貧血、出血、感染、發(fā)熱以及肝、脾、淋巴結(jié)腫大和骨骼疼痛［1-2］。白血病的發(fā)病率在兒童惡性腫瘤中占首位，且病死率高，是5歲以上兒童死亡的主要原因之一。近年來對白血病的研究主要集中在臨床診斷和治療方面，其相關(guān)流行病學(xué)、病因?qū)W的研究也獲得了一些進(jìn)展［3-5］。鐵調(diào)素（hepcidin，Hepc）是一種由肝臟細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣譜殺菌抑菌作用的抗菌肽，可以抑制腸道鐵吸收和單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)鐵釋放，是一種重要的負(fù)性鐵調(diào)節(jié)激素［6-7］。此外，慢性感染、炎癥、缺氧以及其他慢性疾病所引起的貧血也與Hepc有密切聯(lián)系，近幾年的研究證實，Hepc過表達(dá)可作為炎癥引發(fā)貧血的重要病理指標(biāo)，而Hepc缺乏則導(dǎo)致多數(shù)家族性血色沉著病和無效性紅細(xì)胞生成性貧血伴隨鐵離子吸收增加，其中，Hepc-25是其主要活性部分［8-10］。目前，國內(nèi)外對Hepc-25在白血病中的發(fā)生與疾病進(jìn)展機(jī)制研究鮮見報道，本研究觀察分析了白血病患兒外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)情況，并探討其在白血病疾病發(fā)展以及治療中的臨床意義。現(xiàn)報道如下。

1　對象與方法

1.1研究對象

經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，選取2011年2月至2014年2月該院接受治療的白血病患兒93例作為觀察組。入選標(biāo)準(zhǔn)：①所有患兒均根據(jù)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議（第四次修訂草案）確診為ALL［11］；②排除慢性炎癥、貧血或者其他自身免疫性疾病患兒；③排除肝功能異常患兒；④所有參與研究者均由家長簽署知情同意書。觀察組男性63例，女性30例，年齡2～13歲，平均年齡（8.7±2.4）歲。所有患兒均根據(jù)文獻(xiàn)［11］的標(biāo)準(zhǔn)化療方案進(jìn)行治療。同時隨機(jī)選取接受體檢的20例健康兒童作為對照組。

1.2儀器與試劑

人淋巴細(xì)胞分離液購自美國MP Biomedicals公司；SYBR Green通用型qPCR Master M ix購自Roche生物公司；RT-PCR擴(kuò)增儀購自Bio-Rad公司；逆轉(zhuǎn)率試劑盒購自TAKARA公司；Hepc-25蛋白ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.3檢測方法

1.3.1RT-PCR分析外周血Hepc-25 mRNA變化抽取觀察組患兒治療前與治療后抗凝外周血各5 m l，并抽取對照組健康兒童外周血作為對照。根據(jù)RNA提取試劑盒說明書和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GeneBank提供的Hepc-25序列，設(shè)計如下引物：Hepc-25-F：5'-ACGGCACGATCGCACTGAGC-3'；Hepc-25-R：5'-TCGCCTCCTTCGCCTCTGGA-3'。β-Actin-F：5'-GCGGGAAATCGTGCGTGAC-3'；β-Actin-R：CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3'。采用實時熒光定量PCR儀分析Hepc-25mRNA的表達(dá)水平。

1.3.2ELISA分析外周血Hepc-25蛋白表達(dá)水平抽取觀察組患兒治療前和治療后抗凝外周血各2 m l，于4000 r/m in離心10 m in，取血清用于ELISA檢測，嚴(yán)格規(guī)范采用ELISA檢測Hepc-25蛋白表達(dá)情況，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)置3個復(fù)孔，并于酶標(biāo)儀上以492 nm波長測OD值。采用同種方法檢測對照組兒童外周血Hepc-25蛋白表達(dá)水平。

1.4隨訪與觀察終點

治療后根據(jù)《兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議（第三次修訂草案）》療效評判標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效評價［11］，分為完全緩解、部分緩解和未緩解。好轉(zhuǎn)率=（完全緩解+部分緩解）例數(shù)/總例數(shù)×100%，未緩解視為治療無效。隨訪至2014年12月，對93例患兒均完成全部隨訪觀察，隨訪率為100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟-件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組兒童外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

結(jié)果顯示，觀察組患兒外周血Hepc-25 mRNA水平高于對照組健康兒童（P=0.008）；觀察組患兒外周血Hepc-25蛋白表達(dá)水平亦高于對照組健康兒童，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1　兩組兒童外周血Hepc-25 mRNA和蛋白水平比較（±s）

表1　兩組兒童外周血Hepc-25 mRNA和蛋白水平比較（±s）

組別對照組（n=20）觀察組（n=93）Hepc-25 mRNA 1.01±0.32 5.48±1.01 Hepc-25蛋白（μg/m l）1.14±0.35 3.15±0.79

2.2觀察組患兒治療前后外周血Hepc-25 m RNA和蛋白表達(dá)水平比較

觀察組患兒經(jīng)治療后隨訪結(jié)果顯示，完全緩解14例，部分緩解47例，未緩解32例。好轉(zhuǎn)率為64.89%。根據(jù)療效評價結(jié)果將觀察組分為好轉(zhuǎn)組（61例）與無效組（32例），好轉(zhuǎn)組患兒治療前外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于無效組患兒，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014、P=0.007）；治療后好轉(zhuǎn)組患兒Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平亦低于治療前（P＜0.01、P=0.012）；而無效組患兒Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平較治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）2.3 Hepc-25 m RNA及蛋白表達(dá)水平與療效的關(guān)系

表2　觀察組不同療效患兒外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2　觀察組不同療效患兒外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（±s）

?

如上結(jié)果所述，Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平較高的患兒療效較差，而Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平較低的患兒療效較好。相關(guān)性分析顯示Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平與患兒的療效呈負(fù)相關(guān)（r=-1.032，P＜0.05）。

3　討論

急性淋巴細(xì)胞白血病是造血系統(tǒng)中惡性增生性疾病，亦是一個多因素，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的兒童最常見的惡性腫瘤。該病具有病程長、反復(fù)發(fā)作、需長期治療的特點，直接影響了兒童的身體發(fā)育、心理發(fā)展和社會適應(yīng)能力，從而降低兒童的生存質(zhì)量。近年來該病發(fā)病率呈上升趨勢，因此越來越受到研究人員的重視，但其致病因素仍無定論，因而較缺乏針對性的病因預(yù)防手段［12-13］。根據(jù)白血病細(xì)胞不成熟的程度和自然病程，將白血病分為急性淋巴細(xì)胞白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病兩類。由于白血病細(xì)胞惡性、無限制地增生，浸潤全身組織和臟器，直接影響了重要器官的功能以及正常血細(xì)胞的產(chǎn)生數(shù)量，使血細(xì)胞發(fā)生量與質(zhì)的變化，從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)貧血、出血和感染癥狀［14］。

Hepc-25具有廣譜殺菌、抑菌作用，屬于防御性蛋白家族。目前國內(nèi)外多項研究已證實Hepc-25是Hepc的主要活性成分。Hepc由肝細(xì)胞分泌，又叫肝臟抗菌多肽。Hepc作為一種炎癥急性期反應(yīng)蛋白，積極參與了機(jī)體對貧血、組織缺氧和炎癥的反應(yīng)，不僅是鐵代謝重要的負(fù)性調(diào)節(jié)激素，而且在固有免疫、慢性炎癥性貧血等與鐵代謝相關(guān)性疾病中也具有一定作用［15-17］。研究顯示，貧血、組織缺氧和炎癥均可影響肝臟Hepc產(chǎn)生。此外，學(xué)者們亦發(fā)現(xiàn)Hepc-25還與多種炎性和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，它們共同影響了炎性反應(yīng)的發(fā)生［18-20］。Nicolas等［21］對慢性炎癥和貧血小鼠尿液的分析結(jié)果顯示，與對照組比較，Hepc的升高可達(dá)100倍，而在較輕的炎性疾病中，尿液中Hepc-25相應(yīng)減少，且與血清急性期反應(yīng)蛋白-鐵蛋白水平成正比。陳姣等［22］采用RT-PCR和ELISA法分析了54例多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Hepc-25 mRNA及蛋白表達(dá)水平，研究Hepc-25的動態(tài)變化與患者臨床表現(xiàn)的相關(guān)性及對預(yù)后的臨床預(yù)測價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者的Hepc-25蛋白表達(dá)水平高與慢性貧血密切相關(guān)，且較高水平的Hepc-25蛋白表達(dá)對臨床復(fù)發(fā)具有一定的預(yù)測價值，并與患者療效、預(yù)后有密切關(guān)系。

本研究檢測了白血病患兒外周血中Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平，研究結(jié)果顯示，與對照組比較，白血病患兒外周血中Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，提示Hepc-25蛋白表達(dá)水平是白血病發(fā)生過程中較敏感指標(biāo)，并有可能成為白血病臨床輔助診斷指標(biāo)。另外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，好轉(zhuǎn)組患兒Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平低于無效組患兒，提示Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平可作為臨床判斷白血病患兒化療療效的預(yù)測指標(biāo)。好轉(zhuǎn)組患兒在接受治療后Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，無效組患兒治療前后Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步說明Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平與白血病患兒化療療效存在密切關(guān)系，原因可能是Hepc-25蛋白是一種炎癥急性期蛋白，其水平代表患兒機(jī)體炎性水平的高低，炎性水平愈高，則治療效果越不佳。

綜上所述，白血病患兒體內(nèi)Hepc-25 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于正常兒童，且與患兒的化療療效密切相關(guān)，對白血病患兒的臨床治療與復(fù)發(fā)診斷亦具有指導(dǎo)意義。

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The clinical significance of the expression of Hepc-25 mRNA and protein in peripheral blood of children w ith leukem ia

YANG Wei-hong1#LI Pei-ling2LI Shu-jun3
1Department of Pediatrics，2Department of Pediatric First Medical，3Pediatric Third Medical，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Xinxiang 453100，He'nan，China

Objective To study the expression of Hepc-25 mRNA and protein in peripheral blood of children w ith leukemia and to explore the correlation between expression level and efficacy of chemotherapy.Method 93 cases of children w ith leukemia who were administered w ith MR regimen were included as study group，while another 20 cases of healthy children were enrolled as control group；peripheral blood was extracted to determine the Hepc-25 mRNA and protein levels using RT-PCR and ELISA；the correlation between Hepc-25 and efficacy was analyzed.Result Hepc-25 mRNA and protein levels in study group were significantly higher than those in the control group（P＜0.05）.After treatment，Hepc-25 mRNA and protein levels in children w ith response were significantly decreased（P＜0.05），and there were no significant differences before and after treatment in children w ithout response（P＞0.05）.Conclusion The expression of Hepc-25 in peripheral blood of children w ith leukem ia is high，which is useful in predicting recurrence，and is closely correlated w ith the efficacy of chemotherapy.

acute lymphoblastic leukem ia；children；Hepc-25；efficacy

R733.7

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.19

2015-07-06）

（corresponding author），郵箱：YWH120@163.com