蘇淮豬VRTN基因克隆、組織表達特征與多態性分析

吳一塵，杜　星，李平華，2，吳　艷，王鈞順，劉紅林，李齊發

（1南京農業大學動物科技學院，南京 210095；2南京農業大學淮安研究院，江蘇淮安 223005；3淮陰種豬場，江蘇淮安 223322）

蘇淮豬VRTN基因克隆、組織表達特征與多態性分析

吳一塵1，杜星1，李平華1，2，吳艷3，王鈞順3，劉紅林1，李齊發1

（1南京農業大學動物科技學院，南京 210095；2南京農業大學淮安研究院，江蘇淮安 223005；3淮陰種豬場，江蘇淮安 223322）

【目的】獲得蘇淮豬VRTN基因編碼區序列，了解其序列特征和組織表達特征，分析蘇淮豬VRTN基因ins291位點的多態性。【方法】以蘇淮豬卵巢組織cDNA為模板，采用克隆測序技術分離獲得蘇淮豬VRTN基因編碼區序列。利用BioEdit 7.0軟件分析其序列特征和蛋白理化性質。利用Clustal W軟件進行核苷酸和蛋白質序列比對分析。利用UCSC基因組瀏覽器與NCBI基因組數據庫進行豬VRTN基因的染色體定位和基因組結構分析。利用SMART軟件預測蛋白質功能域，CPHmodels軟件預測蛋白質三級結構。隨機選取3頭成年蘇淮豬母豬，屠宰后立即采集心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、肌肉和卵巢等組織，提取組織總RNA，采用RT-PCR技術分析蘇淮豬VRTN基因的組織表達譜。采集106頭成年蘇淮豬繁殖母豬耳組織樣，提取基因組DNA，采用 PCR-凝膠電泳分析蘇淮豬VRTN基因ins291位點的多態性。【結果】蘇淮豬VRTN基因編碼區序列全長為2 097bp，與其它哺乳動物如人、小鼠、牛和羊的一致性分別為84.98%、74.53%、85.84%和86.45%，而與雞的一致性只有54.42%。基因組結構分析發現豬VRTN基因由2個外顯子和1個內含子構成，定位在豬7號染色體上。蘇淮豬VRTN基因編碼蛋白含有698個氨基酸殘基，與人、小鼠、牛和羊等的一致性分別為85.55%、70.07%、86.20%和86.06%，但與雞的一致性只有51.17%，可見哺乳動物VRTN基因在進化過程中比較保守。氨基酸組分分析顯示蘇淮豬VRTN蛋白氨基酸序列存在全部20種氨基酸，其中Leu（亮氨酸）含量最高，達到10.44%，而Asp天冬氨酸含量最低，只有1.43%。蛋白結構分析發現蘇淮豬VRTN蛋白含有 HTH結構域等典型結構域，由6個α螺旋、5個β折疊以及若干無規則卷曲組成。RT-PCR分析表明VRTN基因在蘇淮豬心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、卵巢和肌肉組織等組織中均有表達，說明VRTN基因是一個廣泛表達的基因。在蘇淮豬群體中檢測到VRTN基因ins291位點的3種基因型，其中僅有93bp條帶的為野生純合型（wt/wt），僅有384bp條帶的為突變純合型（Q/Q），含有384和93bp條帶的為雜合型（wt/Q）。在蘇淮豬群體中wt/wt型為優勢基因型，基因型頻率為0.717；wt為優勢等位基因，基因頻率是0.816；高脊椎數等位基因Q的頻率為0.184。遺傳多態性分析發現蘇淮豬VRTN基因ins291位點的多態信息含量為0.331，為中度多態位點，雜合度為0.40，變異程度相對較低。【結論】 獲得了蘇淮豬VRTN基因序列，其表達無組織特異性；蘇淮豬群體中存在高脊椎數等位基因Q。

蘇淮豬；VRTN基因；克隆；組織表達譜；多態性

0　引言

【研究意義】脊椎數是影響豬胴體長和產肉量的重要經濟性狀，也是一個高遺傳力性狀（遺傳力可達0.7以上）［1］。家豬的祖先野豬的胸腰椎數共有19根［2］，而西方商業豬種在長期選育的過程中對體型的大小特別是體長進行了高強度的人工選擇，胸腰椎數可達20—23根［3-4］。研究發現每增加一根脊椎數可使成年豬的胴體增長80mm，體重可增加4—8 kg，單位產肉效率明顯提高［5-6］。因此，揭示豬脊椎數性狀形成的分子機制對提高豬的產肉性能和養殖效益等均具有重要的實踐意義。【前人研究進展】由于與生產性能關系密切，豬脊椎數性狀在生產實踐和科學研究領域均引起了廣泛關注，科學家一直在尋找影響豬脊椎數的QTL、主效基因和遺傳標記。2000年WADA等［7］首先利用318個遺傳標記（主要為微衛星）對梅山豬×哥廷根豬資源家系進行全基因組掃描，發現在1號和2號染色體上存在影響豬脊椎數的QTL。2003年SATO等［8］利用180個微衛星標記和梅山豬×杜洛克豬家系，發現7號染色體上也存在影響豬脊椎數的QTL。2011年MIKAWA等［9］將7號染色體上影響豬脊椎數的QTL進行了精細定位，認為精細QTL內唯一的編碼蛋白基因VRTN（Vertebrae Development Homolog，是人類C14orf115同源基因）是候選基因，且Q/Q型個體的脊椎數顯著高于wt/wt型。隨后多個課題組利用Illumina PorcineSNP60 Beadchip在不同的資源家系和群體中均發現VRTN是影響豬脊椎數的主效基因，如REN等［10］和FAN等［11］在白色杜洛克豬×二花臉豬家系，FAN等［11］在二花臉豬×通城豬家系、蘇太豬群體和杜長大三元雜交豬群體，DUIJVESTEIJN等［12］在大白豬群體。歐陽子璇［13］在白色杜洛克豬×二花臉豬家系中發現VRTN基因ins291和NV027 C＞A等2個位點符合因果突變的條件，其中ins291位點為291 bp的大片段插入突變（PRE1元件），為因果突變的可能性更大。FAN等［11］進一步證實ins291突變可能就是影響豬脊椎數的致因突變。【本研究切入點】近年來，在國內豬新品種（品系）培育過程中脊椎數的選育正逐漸引起關注［13］。蘇淮豬是2011年國家審定的新品種，是以新淮豬為母本，與大白豬雜交培育而成的。但目前關于蘇淮豬脊椎數的研究還未見報道。【擬解決的關鍵問題】擬以蘇淮豬為研究對象，以VRTN為候選基因，克隆蘇淮豬VRTN基因編碼區全序列，了解其序列特征和組織表達特征，分析蘇淮豬VRTN基因ins291位點的多態性，以期為揭示蘇淮豬脊椎數性狀形成機制和蘇淮豬選育提高提供理論依據。

1　材料與方法

1.1試驗時間、地點

本試驗于2014年12月至2015年10月在南京農業大學動物遺傳育種實驗室進行。

1.2試驗動物

在淮陰種豬場隨機選取3頭成年蘇淮豬，屠宰后立即采集心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、肌肉和卵巢等組織，置于液氮中凍藏，用于提取組織總RNA。隨機選取健康無病、體況良好的成年蘇淮豬繁殖母豬106頭，采集耳組織樣，置于裝有75%酒精的離心管中，用冰盒帶回實驗室，用于提取基因組DNA。

1.3DNA和RNA提取

采用常規的酚/氯仿法提取蘇淮豬耳基因組DNA。采用TRlzol Reagent（Invitrogen公司）提取蘇淮豬各組織總RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒（Takara公司）進行反轉錄，具體方法詳見說明書。反轉錄產物置于-20℃冰箱中保存。

1.4RT-PCR反應與克隆測序

根據豬VRTN基因序列（NM_001195113.1），利用Premier 5.0軟件設計2對引物（P1和P2），擴增蘇淮豬VRTN基因編碼區序列，引物序列見表1。RT-PCR反應程序：98℃預變性30s；98℃ 5 s、退火30 s、72℃ 1.5 min 35個循環；最后72℃延伸7 min。PCR 產物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用Gel Purification Kit凝膠回收試劑盒（Omega公司）進行PCR產物純化。純化產物克隆入pMD19-T vector（TaKaRa公司），并轉化到DH5α感受態細胞中；采用質粒提取試劑盒（Axygen公司）提取質粒，送由蘇州金唯智公司進行測序。

表1　PCR引物及反應條件Table 1　Primers and conditions of PCR

1.5序列分析

采用DNAMAN、BioEdit 7.0等生物信息學軟件對蘇淮豬VRTN基因編碼區序列進行拼接、氨基酸序列預測和蛋白性質分析。用Clustal W（http://www.ebi. ac.uk）進行核苷酸和蛋白質序列比對分析。利用UCSC基因組瀏覽器（http://genome.ucsc. edu/cgi-bin/hgBlat）與NCBI基因組數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ mapview/）進行豬VRTN基因的染色體定位和基因組結構分析。利用SMART軟件（http://smart.emblheidelberg.de）預測蛋白質功能域，CPHmodels軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels）預測蛋白質三級結構。哺乳動物VRTN基因序列均從GenBank數據庫下載，包括人（NM_018228.2）、倭黑猩猩（XM_003824163）、小鼠（NM_001168588.1）、大鼠（XM_003750199.3）、綿羊（XM_012111602.1）、牛（NM_001206630.1）和雞（XM_421265.4）。

1.6蘇淮豬VRTN基因組織表達譜分析

以GAPDH基因為內參，根據豬VRTN基因（NM_001195113.1）和GAPDH基因mRNA序列（NM_001206359.1）設計引物P3、P4（表1），以蘇淮豬各組織cDNA為模板進行RT-PCR擴增。PCR產物進行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果并拍照記錄。

1.7蘇淮豬VRTN基因ins291位點的多態性分析

根據文獻［11］中報道的影響豬脊椎數性狀的VRTN基因的g.20311_20312 ins291位點，設計引物P5（表1），以蘇淮豬基因組DNA為模板進行PCR擴增。擴增產物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，根據條帶大小對蘇淮豬不同個體VRTN基因ins291位點進行分型。多態信息含量和雜合度等的計算方法見文獻［14］。

2　結果

2.1蘇淮豬VRTN基因PCR擴增

以蘇淮豬肌肉組織cDNA為模板，利用引物P1與P2進行PCR擴增，PCR擴增產物經過瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到特異性良好且與目的片段大小一致的擴增片段（圖1）。測序后發現擴增片段長度分別為1 328和898 bp，與引物設計時預期長度一致。

2.2蘇淮豬VRTN基因編碼區序列分析

圖1　蘇淮豬VRTN基因PCR擴增產物電泳圖譜Fig. 1　Agarose gel photograph of VRTN gene in Suhuai pig

圖2　蘇淮豬VRTN基因核苷酸序列與預測的氨基酸序列Fig. 2　Nucleotide and amino acid sequence of VRTN gene in Suhuai pig

通過克隆測序和序列拼接獲得了蘇淮豬VRTN基因完整的編碼區序列，序列長度為2 097 bp（圖2）。采用BioEdit 7.0軟件對蘇淮豬VRTN基因編碼區核苷酸序列的堿基組成進行分析，結果發現CG含量（64.27%）明顯高于AT含量（35.73%）。BLAST比對發現蘇淮豬VRTN基因編碼區核苷酸序列與引物源序列（NM_001195113.1）的一致性為99.95%。蘇淮豬VRTN基因編碼區核苷酸序列與其它哺乳動物如人、倭黑猩猩、小鼠、大鼠、牛和羊的一致性分別為84.98%、85.12%、74.53%、73.68%、85.84%和86.45%，而與雞的一致性只有54.42%。哺乳動物相近物種間VRTN基因編碼區核苷酸序列的一致性更高，如人和倭黑猩猩（99.38%）、牛和羊（96.48%）。電子染色體定位發現VRTN基因定位在豬7號染色體上，介于AbcD4基因（XM_013989158.1）與SYNDIG1L基因（XM_013989161.1）之間。基因組結構分析發現豬VRTN基因由2個外顯子和1個內含子構成。

2.3蘇淮豬VRTN蛋白氨基酸序列分析

圖3　蘇淮豬 VRTN基因氨基酸序列與其他哺乳動物的同源性比較Fig. 3　Identical alignments of VRTN amino acid sequence in Suhuai pig with other mammals

蘇淮豬VRTN基因編碼蛋白含有698個氨基酸殘基（圖3）。氨基酸組分分析顯示蘇淮豬VRTN蛋白氨基酸序列存在全部20種氨基酸，其中Leu（亮氨酸）含量最高，達到10.44%，而Asp天冬氨酸含量最低，只有1.43%。氨基酸殘基中酸性氨基酸（Asn、Asp、Gln、Glu）有98個，堿性氨基酸（Arg、His、Lys）有89個；正電荷殘基（Asp、Glu）有52個，負電荷殘基（Arg、Lys）有75個。同源性分析發現蘇淮豬VRTN蛋白氨基酸序列與人、倭黑猩猩、小鼠、大鼠、牛和羊等的一致性分別為85.55%、84.80%、70.07%、70.33%、86.20%和86.06%，但與雞的一致性只有51.17%。同樣地，哺乳動物相近物種間VRTN蛋白氨基酸序列一致性更高，如人和倭黑猩猩（99.00%）、牛和羊（96.71%）。

圖4　蘇淮豬VRTN蛋白三級結構預測Fig. 4　Space structure prediction analysis of VRTN protein in Suhuai pig

2.4蘇淮豬VRTN基因編碼蛋白特征分析

蘇淮豬VRTN蛋白的分子量為77.8467kD，理論等電點pI為 9.37，體外半衰期為30 h，不穩定系數63.41，疏水性均值（GRAVY）為-0.274。ProtScale和BioEdit軟件分析發現在蘇淮豬VRTN蛋白270—320、400—450、550—600氨基酸之間有3個較強的親水性區域，說明蘇淮豬VRTN蛋白具有較強的親水性。NCBI與SMART在線軟件對VRTN蛋白功能結構域進行分析，結果并未在蘇淮豬VRTN蛋白上發現跨膜結構，但發現蘇淮豬VRTN蛋白氨基酸序列存在2個低復雜區域（LCR）（5Glu—20Glu；247Glu—275Ser）和2個內部重復序列（RPT）（291Val—436Arg；530Ser—687Ala），另外檢測到一個HTH結構域（276Gln—306Glu）（圖3）。利用CPHmodels在線工具進行蘇淮豬VRTN蛋白質三級結構預測分析，結果見圖4。從圖4可以看出VRTN蛋白包含6個α螺旋、5個β折疊以及若干無規則卷曲結構。

圖5　蘇淮豬VRTN基因組織表達譜Fig. 5　Normal expression profile of VRTN gene in Suhuai pig

2.5蘇淮豬中VRTN基因組織表達譜分析

以蘇淮豬各個組織cDNA為模板，利用引物P3與P4進行RT-PCR分析，PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖5。可以看出，在蘇淮豬心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、卵巢和肌肉等組織中均檢測到VRTN基因的表達，說明VRTN基因是一個廣泛表達的基因。

2.6蘇淮豬VRTN基因ins291位點多態性分析

圖6　蘇淮豬VRTN基因ins291位點基因分型Fig. 6　The genotype patterns of the VRTN ins 291 mutation in Suhuai pig individuals

在蘇淮豬群體中檢測到VRTN基因ins291位點的3種基因型（圖6），其中僅有93bp條帶的為野生純合型（wt/wt），僅有384 bp條帶的為突變純合型（Q/Q），含有384和93 bp條帶的為雜合型（wt/Q）。蘇淮豬VRTN基因ins291位點的基因型頻率、基因頻率分析結果見表2。在蘇淮豬群體中wt/wt型為優勢基因型，基因型頻率為0.717；wt為優勢等位基因，基因頻率是0.816。另外，遺傳多態性分析發現蘇淮豬VRTN基因ins291位點的多態信息含量為0.331，為中度多態位點，雜合度為0.40，變異程度相對較低。

表2　蘇淮豬和其它豬種VRTN基因ins291位點的基因型頻率和基因頻率Table 2　Polymorphism of VRTN ins291 in Suhuai pig and other pig breeds

3　討論

研究表明在豬基因組上存在著大量的QTL，而在這些QTL內一些候選基因的多態性與豬性狀之間存在著潛在的聯系，例如IGF2基因內含子3上g.3072G＞A位點多態性與豬肌肉生長高度關聯［15］，MC4R基因上 p.D298N（c.892G＞A）位點錯義突變導致豬采食量和日增重都顯著減少［16］，VRTN基因ins291突變是影響豬脊椎數的致因突變［11］，PPARD基因G32E 位點多態性與豬耳朵面積顯著關聯［17］，PHKG1基因g.8283C＞A突變引起豬肌糖原含量升高和肉質下降［18］，等等。VRTN基因位于豬7號染色體上，介于控制脂肪分解和乳頭數性狀的數量性狀基因座之間［9，12］。豬VRTN基因全長9 570 bp，有2個外顯子，其中一個是編碼蛋白［19］。本文通過克隆測序獲得了蘇淮豬VRTN基因編碼區序列，發現蘇淮豬核甘酸（氨基酸）序列與其它哺乳動物比較的一致性均高于73%（70%），明顯低于豬某些基因和哺乳動物其它物種的同源性，如Smad4基因（高于86%和98%）［20］、ECE基因（高于87%和96%）［21］、Rb1基因（高于89%和91%）［22］和MSRB3基因（高于84%和88%）［23］，而與豬NR5A2基因［24］相近，說明哺乳動物VRTN基因在進化過程中相對保守，這與前人研究發現VRTN基因位于突變位點較為常見的區域是一致的［9，12］。蘇淮豬VRTN蛋白特征預測發現VRTN蛋白不具備跨膜功能，包含2個LCR和2個RPT區域，以及1個HTH結構域。研究發現HTH結構域包含螺旋-反轉-螺旋基礎結構，為一個序列特異性結構單元，常見于轉錄調節因子蛋白，用以識別靶基因的轉錄調控序列［25］，提示VRTN蛋白可能具有調控轉錄的功能，但目前尚未見到相關研究報道。

VRTN基因是影響豬脊椎數性狀的主效基因，于2011年首先在大白豬群體中被鑒定［9］。VRTN基因多態性被認為是影響豬脊椎數變異的主要因素，MIKAWA等［9］在豬VRTN基因中檢測到9個突變位點，其中單倍型Q比單倍型wt的脊椎數多1.02根，且這些突變影響VRTN基因在胚胎發育早期的轉錄，其中單倍型Q型高于單倍型wt。進一步分析發現，NV123位點中Q等位基因是插入了一個291bp的PRE1元件（一種豬SINE元件）形成的，而SINE元件可以作為增強子元件調控相應基因的表達［9，26］。歐陽子璇［13］利用白色杜洛克豬×二花臉豬家系研究認為NV123ins291位點可能是影響豬脊椎數性狀的因果突變位點（QTN），隨后FAN等［11］進一步證實了這個觀點。本研究以ins291位點為對象，分析了蘇淮豬群體VRTN基因ins291位點的多態性，結果在蘇淮豬群體中發現了高脊椎數等位基因的存在，Q等位基因的頻率為0.18，明顯低于另一個等位基因wt的頻率（0.82）。研究發現在西方豬商業化豬種中VRTN基因ins291位點Q等位基因頻率均較高，例如杜洛克豬、長白豬、大白豬和皮特蘭豬中Q等位基因頻率分別高達0.54、0.71、0.66和0.50（表2），這與西方豬種脊椎數較多和體長較長是一致的［1，11］。國內地方豬種中一般檢測不到Q等位基因或其頻率較低，如梅山豬、金華豬等Q等位基因頻率均為0［11］。中外豬種脊椎數和VRTN基因ins291位點Q等位基因頻率的差異，是因為西方豬種在近、現代選育過程中注重對豬體長的選育，高強度地選育了具有較多脊椎數的品種，從而人為的提高了西方豬種Q等位基因頻率［27］。在蘇淮豬群體中檢測到VRTN基因ins291位點Q等位基因，可能與蘇淮豬血統有關，即在蘇淮豬的培育過程中引入了西方豬種大白豬的血統［28］。

4　結論

本研究分離了蘇淮豬脊椎數主效基因VRTN基因編碼區全序列，了解了其基因特征和蛋白性質。RT-PCR發現VRTN基因在蘇淮豬各種組織中廣泛表達。在蘇淮豬群體中鑒定出VRTN 基因ins291位點高脊椎數等位基因Q的存在，為蘇淮豬胴體長和產肉性狀的進一步選育提高提供了理論基礎和分子標記。

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（責任編輯林鑒非）

Sequence Cloning， Tissue Expression Profile and Polymorphism of VRTN Gene in Suhuai Pig

WU Yi-chen1， DU Xing1， LI Ping-hua1，2， WU Yan3， WANG Jun-shun3， LIU Hong-lin1， LI Qi-fa1
（1College of Animal Science and Technology， Nanjing Agriculture University， Nanjing 210095；2Huaian Academy of Nanjing Agricultural University， Huaian 223005， Jiangsu；3Huaiyin Pig Breeding Farm， Huaian 223322， Jiangsu）

【Objective】The aim of this study is to obtain the coding region sequence of Suhuai VRTN gene， identify its characteristics and expression patterns， analyze the polymorphism of VRTN ins291 in Suhuai pig population. 【Method】The codingsequence of Suhuai pig VRTN gene was isolated by cloning and sequencing. The BioEdit 7.0 software was used to analyze the molecular characteristics and physicochemical properties of Suhuai pig VRTN. Nucleotide and amino acid sequences alignment was performed using Clustal W. Genomic organization and chromosomal locations were investigated by comparing the cDNA and corresponding genomic sequence （UCSC server and NCBI database）. Motif analysis was performed using the online programs SMART， and protein tertiary structure was predicted by CPHmodels server. Tissue samples of heart， liver， spleen， lung， kidney，hypothalamus， ovary and skeleton muscle were obtained from adult female Suhuai pigs （n=3）. Total RNA was extracted using a Trizol kit， and the expression patterns of VRTN gene of Suhuai pig were analyzed by RT-PCR. The ear samples were obtained from adult female Suhuai pigs （n=106）， and genomic DNA was extracted by a conventional phenol-chloroform extraction method. PCR-Gel electrophoresis was performed to analyze the polymorphism of VRTN ins291. 【Result】The full length of the coding sequences of Suhuai pig VRTN gene is 2097 bp， which shared similarities of 84.98%， 74.53%， 85.84% and 86.45% to human， mouse，cattle and sheep， respectively， but only 54.42% to chicken. Genomic structure analysis showed that pig VRTN gene includes 2 exons and 1 intron， and is located on chromosome 7. The Suhuai pig VRTN gene encodes 698 amino acid residues， which shared similarities of 85.55%， 70.07%， 86.20% and 86.06% to human， mouse， cattle and sheep， respectively， but only 51.17% to chicken，indicated that VRTN is conserved in the evolution process of mammalian. Protein structure analysis found that VRTN protein of Suhuai pig contains several typical domains including HTH domain， and comprised 6 α-helices， 5 β-sheets and many random coils. Real-time PCR analysis revealed that the VRTN gene is expressed in heart， liver， spleen， lung， kidney， hypothalamus， ovary and skeleton muscle of Suhuai pig， suggesting that VRTN is widely expressed in various tissues of pig. Genotyping ins291 of VRTN gene in 106 Suhuai pigswas done， and three genotypes were detected. In Suhuai pigs， the frequencies of wt/wt， wt/Q and Q/Q genotypes were 0.717， 0.198 and 0.085. The frequencies of high vertebrate number of Q allele was 0.184. The polymorphic information content of VRTN ins291 in Suhuai pigs was 0.331. The heterozygosity of VRTN ins291 in Suhuai pigs was 0.40.【Conclusion】 The coding region of VRTN gene was isolated， and its expression showed no tissue-specificity. The presence of high number of vertebrate Q allele in Suhuai pig population was confirmed.

Suhuai pig； VRTN gene； cloning； tissue expression profile； polymorphism

2015-12-26；接受日期：2016-07-08

國家科技支撐計劃（2015BAD03B01）、江蘇省農業科技自主創新資金（SCX（12）2097）、南京農業大學SRT計劃（1515A08）

聯系方式：吳一塵，E-mail：wuyichen@njau.edu.cn。杜星，E-mail：2014205003@njau.edu.cn。吳一塵和杜星為同等貢獻作者。通信作者李齊發，E-mail：liqifa@njau.edu.cn