木薯莖桿基質比例對3 種食用菌海藻糖含量的影響

王琴飛，蔡　坤，林立銘，羊賢月，張振文*

（中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，國家薯類加工技術專業分中心，海南 儋州 571737）

木薯莖桿基質比例對3 種食用菌海藻糖含量的影響

王琴飛，蔡坤，林立銘，羊賢月，張振文*

（中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，國家薯類加工技術專業分中心，海南 儋州 571737）

以木薯莖桿栽培的食用菌為試材，對海藻糖的提取方法和高效液相色譜-蒸發光散射（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）檢測方法進行優化，分析不同比例木薯莖稈栽培3 種食用菌（黑木耳、平菇、榆黃蘑）海藻糖含量。結果表明，食用菌中的海藻糖在80 ℃水浴60 min條件下可有效提取，最高含量達到190.5 mg/g；利用優化后色譜條件分析標準品和樣品中海藻糖，其分離效果均良好。并分析黑木耳、平菇和榆黃蘑中海藻糖含量，發現當栽培基質的木薯莖稈比例為31.2%時，3 種食用菌海藻糖含量較高，分別為61.5、250.3 mg/g和15.0 mg/g。結果表明，HPLC-ELSD可分析3 種食用菌中海藻糖含量，方法準確度高、重復性好、樣品穩定性較好；3 種食用菌海藻糖含量與培養基質中木薯莖稈比例有關，合適的木薯莖稈比例可提高食用菌中海藻糖含量。

木薯莖稈；食用菌；海藻糖；高效液相色譜-蒸發光散射

木薯是三大薯類作物（馬鈴薯、番薯、木薯）之一，具有生物產量高，抗逆性強、耐貧瘠等優點，是目前淀粉和生物能源生產的重要原料［1］。目前，人們主要是利用木薯地下塊根，而地上部分的木薯莖桿一直被人們認為是采收后產生的廢棄物。研究者通過木薯莖桿直接粉碎還田可提高土壤肥力和提高鮮薯的產量，但利用率存在一定的局限性；也有研究人員將木薯桿中纖維素水解后進一步用于酒精、有機酸和抗生素的生產，但生產成本較高，很難得到廣泛的應用［2］。木薯莖桿質地疏松，經檢測含粗蛋白5.1%、粗纖維23.3%、碳水化合物45.5%，適合用于栽培食用菌［3］。因此，研究者應用木薯莖桿代替傳統原料棉籽殼，成功的栽培出杏鮑菇［3］、秀珍菇［4］和金福菇［5］等，延長了木薯行業的產業鏈，但研究僅對栽培配方的進行了比較，并未對食用菌中的功能性成分進行分析。

食用菌富含蛋白質，多種維生素，礦物質和膳食纖維，被認為是一種低熱量食物，近年來研究發現，大部分食用菌中都含有海藻糖，并且雙糖海藻糖是菇類風味成分的組成之一［6］，在工業上常用于食物、生物材料和疫苗的低溫保鮮等，與生物抗逆耐受力具有直接關系［7-10］，在植物中可作為一種抗逆代謝產物存在并發揮作用［11-12］。檢測海藻糖的方法很多，有紙層析［13］、薄層層析［14］、氣相色譜法［15-16］、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［17］、蒽酮-硫酸比色法［18］和酶分析法［19］等，各種方法都存在一定的缺陷。其中紙層析、薄層層析、蒽酮-硫酸法分析靈敏度較低，操作繁瑣，雜質干擾較大，準確度和重復性較差以至于不能準確定量。氣相色譜法需要衍生化后進行分析，操作繁瑣。酶分析法成本較高，操作復雜。HPLC法是海藻糖和單糖等定性定量分析的常用手段［20］，但由于示差折光檢測器的靈敏度較低［21］，在食用菌中應用較少，研究者常利用高效陰離子色譜-脈沖安培檢測法檢測食用菌中海藻糖和單糖的含量，能得到較好的結果［6，22］。蒸發光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELSD）作為一種新型的通用型檢測器在HPLC上的應用，使HPLCELSD快速測定食用菌中海藻糖及單糖含量成為可能。本研究以木薯莖稈栽培的食用菌為實驗材料，通過不同提取方法的比較，期望獲得食用菌中海藻糖的最佳提取條件，并在前人的研究基礎上，建立3 種食用菌中海藻糖含量的HPLC-ELSD方法，對不同比例木薯莖稈栽培的3 種食用菌中海藻糖進行檢測評價，為木薯莖桿的綜合利用提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

木薯莖稈 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所國家薯類加工技術研發分中心；平菇、榆黃蘑和黑木耳菌株，菌種來自于吉林農業大學。

海藻糖標準樣品（純度≥98%）、乙腈（色譜純）美國Sigma公司；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）由Elix3+Synergy超純水系統制備。

1.2儀器與設備

1260型LC系統（配備四元泵、自動進樣器、蒸發光檢測器和柱溫箱） 美國Agilent公司；Elix3+Synergy超純水系統 美國Millipore公司；KQ-400KDE超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司；HVE-50滅菌鍋日本Hirayama公司；HWS-26水浴鍋 上海一恒儀器設備有限公司。

1.3方法

1.3.1食用菌的培養

木薯莖稈收獲后，經曬干、粉碎備用，使用前1 d重新翻曬一次。木薯莖桿與木屑按表1配方混勻，水的用量根據基料的濕度而定，基質與水的比例為1∶1.2或1∶1.5（g/g），攪勻后再根據表1配方比例加入麥皮、石灰、石膏后，再按基質與水1∶0.5比例加水攪勻，使基料含水量為（58±2）%（手輕捏培養料有水滲出，但不外滴為準），裝袋，滅菌。將滅菌后的培養袋和接種工具放入超凈工作臺分別接種。接種后根據牛長滿［23］的方法進行發菌、培養和采收。采收后先自然晾干，再用烘箱70 ℃烘干至恒質量，利用植物樣品粉碎機粉碎，并過100 目鋼篩，于4～8 ℃保存備用。食用菌栽培基質配方見表1。

表1　食用菌栽培基質配方Table1　Substrate formulations for cultivating edible fungi%

1.3.2海藻糖的提取與檢測

提取條件：分別稱取3 種食用菌樣品粉末0.100 g于50 mL離心管，加25 mL去離子水，混勻，在恒溫水浴鍋中加熱提取60 min（溫度80 ℃）。提取后放入4 ℃冰箱，待冷卻后12 000×g離心20 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液用于HPLC分析。每個樣品設3 個重復。

色譜條件：COSMOSIL Sugar-D色譜柱（4.6mm× 250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相為乙腈-水（70∶30，V/V）溶液，流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；漂移管溫度85 ℃；霧化溫度70 ℃；氣流速率1.6 L/min；分析時間10 min；以外標法計算試樣中海藻糖的含量。

1.3.3標準溶液的配制

分別精確稱取0.100 g海藻糖，用體積分數50%乙腈溶液溶解并定容到100.0 mL，配制成10.0 mg/L標準儲備液，置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.4數據處理

采用Microsoft Excel 2013進行數據分析和制圖，采用SPSS 22.0統計軟件進行顯著性分析。

2　結果與分析

2.1海藻糖檢測方法的優化

參照文獻［24］方法，根據流動相的種類和比例，首先設定漂移管溫度為80 ℃，氮氣流速為2.0 L/min。保持氣速不變，用100 mg/L的標準品混合溶液進樣，在70～95 ℃范圍內改變漂移管溫度，觀察信號基線水平和噪音，信噪比呈先降低后升高的趨勢，基線都較平穩，當漂移管溫度為85 ℃時，流動相基本揮發，信噪比最低。固定漂移管溫度為85 ℃，觀察1.4～2.0 L/min不同氮氣流速時海藻糖的信號強度，1.6 L/min為在較小噪音水平上，產生最大檢測響應值的最低氣速。故選定漂移管溫度85 ℃，氮氣流速1.6 L/min。以優化的檢測條件，對標準品和樣品中的海藻糖進行分析，如圖1所示，標準品種中海藻糖的保留時間為6.976 min，樣品中保留時間為7.976 min，保留時間一致。標準樣品和樣品中峰形較好，沒有拖尾現象。

圖1　標準樣品（A）和樣品（B）海藻糖HPLC圖Fig.1　HPLC-ELSD chromatograms of trehalose standard （A） and real sample （B）

2.2海藻糖提取條件的優化

通過不同時間80 ℃水浴和超聲處理（超聲溫度40～60 ℃，超聲頻率3 200 kHz）提取比較發現，在相同的時間內（1 h），80 ℃水浴提取效率更高，海藻糖含量達到了190.5 mg/g，比超聲提取提高了53.2 mg/g。從圖2a可以看出，在水浴提取的過程中，海藻糖含量在不斷增加，以水浴60 min和120 min時提取效果最佳，含量分別達到了190.5 mg/g和193.8 mg/g，在此期間海藻糖含量變化不顯著；雖然30 min時海藻糖含量與60 min最高含量差異不顯著，但與120 min相比卻達到了顯著水平，兩者相差5.5 mg/g，結果表明，水浴60～120 min時是海藻糖提取的最佳時間段；由圖2b可知，隨著超聲處理時間的延長海藻糖含量增加，實驗中還發現，超聲提取溫度會隨著時間的延長而升高，溫度從30 ℃升高到50 ℃，溫度很難控制，由此可知，海藻糖的提取可能與溫度有關。因此，選擇水浴60 min提取，可以較好地控制提取溫度和有效提取海藻糖。

圖2　80 ℃水浴（a）和超聲處理（b）對樣品中海藻糖含量的影響Fig.2　Effects of hot water bath extraction at 80 ℃ （a） and ultrasonic extraction （b） on trehalose contents in samples

2.3HPLC-ELSD檢測方法的驗證

2.3.1線性關系、檢出限和定量限考察

用體積分數50%乙腈溶液稀釋海藻糖的標準儲備液，配制成5～200 mg/L的5 個梯度標準溶液，在1.3.2節色譜條件下，依次進樣10 μL，根據ELSD測得的峰面積（Y）與相應的標準溶液質量濃度（X，mg/L）進行線性回歸，發現線性很差。參照文獻［25］方法，以海藻糖質量濃度的對數（lgX）與ELSD測得的峰面積的對數（lgY）進行線性回歸分析，得到回歸方程為lgY=1.330 4lgX-0.010，兩者間存在著良好的線性關系，海藻糖的線性相關性系數（R2）達到了0.999 7。將最小濃質量度的標準溶液再逐級稀釋，依次進樣10 μL，計算3 倍信噪比和10 倍信噪比對應的標準溶液質量濃度，以確定檢出限和定量限，海藻糖檢出限為0.06 mg/L，定量限為0.15 mg/L。

2.3.2儀器精密度、樣品穩定性結果

以100 mg/L海藻糖標準品連續進樣6 次，每次進樣體積為10 μL，按照上述色譜條件進行分離檢測，計算峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），考察儀器的精密度，海藻糖的峰面積分別為422.7、394.3、392.6、387.5、422.7、404.0，RSD為3.8%，證明儀器精密度較好；取任意一樣品溶液，每隔1 h進樣1 次，按照色譜條件測定峰面積，計算6 h內樣品中海藻糖的含量，其海藻糖含量分別為218.2、216.1、215.6、208.6、208.7、208.9 mg/g，RSD為2.1%，表明樣品在6 h內穩定性較好。

2.3.3回收率實驗結果

取1.3.1節獲得的食用菌樣品12 份，每個樣品0.100 g，取9 個樣品加入25 mL水后，分別加入3 個質量濃度梯度的海藻糖標準溶液；另外3 個樣品不加入海藻糖標準樣品作為對照。所有樣品按照1.3.2節過程提取樣品中的海藻糖，進行回收率實驗，每梯度設置3 個重復。樣品中海藻糖的平均回收率為97.4%，RSD為0.7%。結果見表2，樣品中海藻糖加標回收率較好，方法準確度較高，可用于實際樣品的測定。

表2　方法的回收率結果Table2　Recovery of the method

2.4木薯莖稈培養的食用菌中海藻糖含量測定

利用實驗中建立的海藻糖的提取和檢測方法，對1.3.1節中不同木薯莖稈作為基質培養的3 種食用菌中海藻糖的含量進行分析。由表3可知，3 種食用菌中都含有海藻糖，其中以平菇中海藻糖含量最高，含量達到了250.3 mg/g，榆黃蘑中含量最低，含量為16.6 mg/g；通過顯著性分析可知，木薯莖稈比例為31.2%時，栽培的黑木耳、平菇和榆黃蘑的海藻糖含量最佳，分別為61.5、250.3 mg/g和15.0 mg/g，黑木耳和榆黃蘑與其他比例木薯莖稈栽培的含量達到顯著差異；榆黃蘑在木薯莖稈比例分別為15.6%、31.2%、62.4%和78.0%時，海藻糖含量差異不顯著，但與未使用木薯莖稈栽培基質相比，有顯著差異。由此可知，栽培基質可影響食用菌中海藻糖含量，選擇合適的木薯莖稈比例，可以提高食用菌中海藻糖的含量。

表3　不同比例木薯莖稈栽培對3 種食用菌中海藻糖含量的影響Table3　Effect of cultivation with different ratios of cassava stalk on trehalose contents in three edible fungi

3　討論與結論

HPLC法檢測樣品中單糖或多糖，通常用糖分析柱、氨基鍵合柱或C18柱作固定相，以乙腈和水的混合溶劑或純水為流動相來分析，氨基柱在分析的過程中需要在水中加入0.1% NH4OH，而C18柱在水相中穩定性較差，因此，實驗采用糖分析柱，并且，糖分析色譜柱在海藻糖的測定已得到廣泛的應用［26-27］。在利用HPLC-ELSD進行糖分析時，全部柱流出物都進入ELSD的漂移管，讓流動相在其中蒸發，如果采用純水做流動相，ELSD就必須采用較高的漂移管溫度和較大的霧化器載氣流速才能有利于蒸發，這使得ELSD檢測的峰面積減小，降低了靈敏度。故本實驗采用沸點較低的乙腈為流動相。

文獻［22］報道，常溫很難讓海藻糖從細胞壁上解離，海藻糖的提取溫度一般都在60～80 ℃，在提取方法優化中發現，水浴和超聲都可以提高海藻糖的含量，但是超聲提取溫度會隨著時間的延長而升高，溫度很難控制，提取60 min可使溫度從30 ℃提高到50 ℃，海藻糖提取含量也未達到最高。在劉海燕等［22］的研究結果表明，溫度可影響海藻糖的提取率，為了提取效果達到一致性，實驗選擇80 ℃水浴提取3 種食用菌中海藻糖。在進行海藻糖定量分析中發現，根據ELSD測得的峰面積與相應的標準溶液質量濃度進行線性回歸，發現線性很差，而海藻糖質量濃度的自然對數與ELSD測得的峰面積的自然對數進行線性回歸分析，兩者間才能得到良好的線性關系，結果與文獻［25］報道一致。

通過分析不同比例木薯莖稈栽培的3 種食用菌中海藻糖，黑木耳、平菇和榆黃蘑中的海藻糖含量豐富，以海藻糖的最高值相比，黑木耳占干樣的百分比達到了6.2%，比文獻［6］報道的有明顯提高。海藻糖含量呈現平菇＞黑木耳＞榆黃蘑的趨勢；并且海藻糖含量的高低與食用菌的種類及培養基質比例有直接關系。結果表明，木薯莖稈比例為31.2%時，平菇、榆黃蘑和黑木耳中海藻糖含量較高，但從文獻［28］報道發現，木薯莖稈在栽培杏鮑菇金福菇［5］和秀珍菇［4］時，栽培的最佳配方中木薯莖稈基質的比例分別為80%、83%和45%，證明不同的食用菌使用的比例不同。因此，在提高食用菌中海藻糖含量的同時，還應保證食用菌的出菇率，分析食用菌中氨基酸、維生素和其他的營養指標，才能綜合評價木薯莖稈栽培3 種食用菌的最佳比例。

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Effect of Cassava Stalk Substrate Ratio on Trehalose Content in Three Cultivated Edible Fungi

WANG Qinfei， CAI Kun， LIN Liming， YANG Xianyue， ZHANG Zhenwen*
（National R&D Centre for Patato Processing， Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou 571737， China）

In this study， an optimized method using high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD） was developed for detecting trehalose extracted from three edible fungi including Auricularia auricula-judae， Pleurotus ostreatus， and Pleurotus citrinopileatus Sing.， which were cultivated on mixed substrates containing assava （Manihot esculenta） stalk. The relationship between trehalose content and cassava stalk proportion was explored. The results indicated that the trehalose in edible fungi could be completely extracted in 80 ℃ water bath in 60 minutes， and the maximum yield of trehalose could reach 190.5 mg/g. Under the optimized chromatographic conditions，good separation of trehalose and maximum contents of trehalose were obtained from edible fungi cultivated on a substrate with 31.2% cassava stalk， which were 61.5， 250.3 and 15.0 mg/g for Auricularia auricula-judae， Pleurotus ostreatus，and Pleurotus citrinopileatus Sing.， respectively. This study has demonstrated that the trehalose content of edible fungi can be accurately and conveniently determined by HPLC-ELSD. In addition， the trehalose contents of A. auricula-judae，P. ostreatus and P. citrinopileatus can be significantly improved by cultivating them on a substrate with a proper ratio of cassava stalk.

cassava stalk； edible fungi； trehalose； high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD）

10.7506/spkx1002-6630-201618017

S533

A

1002-6630（2016）18-0102-05

王琴飛， 蔡坤， 林立銘， 等. 木薯莖桿基質比例對3 種食用菌海藻糖含量的影響［J］. 食品科學， 2016， 37（18）: 102-106. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618017. http://www.spkx.net.cn

WANG Qinfei， CAI Kun， LIN Liming， et al. Effect of cassava stalk substrate ratio on trehalose content in three cultivated edible fungi［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 102-106. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618017. http://www.spkx.net.cn

2015-12-20

國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-12）

王琴飛（1982—），女，助理研究員，碩士，主要從事木薯功能物質分離與鑒定研究。E-mail：wangqf508@163.com

張振文（1975—），男，副研究員，博士，主要從事木薯采后處理與加工研究。E-mail：scuta96@163.com