腌臘肉制品中13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE的HPLC-MS/MS檢測(cè)

宋　慧，耿志明，任　雙，王道營，張牧焓，孫　沖，徐為民，3，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210095）

腌臘肉制品中13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE的HPLC-MS/MS檢測(cè)

宋慧1，2，耿志明2，任雙1，2，王道營2，張牧焓2，孫沖2，徐為民1，2，3，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210095）

采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)腌臘肉制品中13-羥基-9，11-十八碳二烯酸（13-hydroxy-9，11-octadecadienoic acid，13-HODE）、9，10-二羥基-12-十八碳烯酸（9，10-dihydroxy-12-octadecenoic acid，9，10-DHODE）、9，10-環(huán)氧-12-十八碳烯酸（9，10-epoxyoctadec-12-enoic acid，9，10-EPODE）及9，10，13-三羥基-11-十八碳烯酸（9，10，13-trihydroxy-11-octadecenoic acid，9，10，13-THODE）進(jìn)行檢測(cè)。腌臘肉制品中13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE用甲醇提取，經(jīng)固相萃取柱去凈化濃縮，然后以0.1%甲酸與乙腈為流動(dòng)相，在XBridge色譜柱上進(jìn)行梯度分離，采用電噴霧源負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE分別在質(zhì)量濃度為0.05～2.0、0.01～0.5、0.05～1.0、0.01～0.5 μg/mL的范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系（R2＞0.999）；檢出限分別為0.120、0.008、0.200、0.016 μg/g；不同添加水平的平均回收率分別為95.1%、85.2%、86.8%、86.2%。對(duì)26 種腌臘肉制品含量分析表明，所有樣本都含有13-HODE、9，10-DHODE、9，10，13-THODE，含量分別在1.4～100.7、0.1～3.9、0.4～10.2 μg/g范圍內(nèi)，21 種樣本中含有9，10-EPODE，含量范圍為0.8～6.9 μg/g。結(jié)果表明，腌臘肉制品中存在目標(biāo)分析物的異構(gòu)體，羥基脂肪酸實(shí)際含量可能大大高于檢測(cè)的量。

亞油酸；腌臘肉制品；13-HODE；9，10-DHODE；9，10-EPODE；9，10，13-THODE；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

亞油酸（linoleic acid，LA，C18∶2）是人類飲食中必需的脂肪酸。作為細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的基本成分，LA在許多生理過程中起到了重要的作用，例如介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控基因表達(dá)［1］。LA也是類花生酸的前體，例如前列腺素與白三烯［2］。與花生四烯酸類似，LA在脂肪氧合酶、細(xì)胞色素P450［3-5］、金屬離子［6］、游離自由基［7］的存在下，極易受到氧化。在酶促或者非酶促的條件下，LA主要氧化生成十八碳烯酸的氫過氧化物（hydroperoxyoctadecadienoic acids，HPODEs）［8］，HPODEs不穩(wěn)定可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為單羥基十八碳烯酸（hydroxyoctadecadienoic acids，HODEs）［9］。HODE有兩種異構(gòu)體，9-HODE和13-羥基-9，11-十八碳二烯酸（13-hydroxy-9，11-octadecadienoic acid，13-HODE）。LA在非酶促作用下產(chǎn)生等物質(zhì)的量13-HODE與9-HODE的混合物，而在15-脂肪氧合酶作用下只產(chǎn)生13-HODE［10］。除了HODEs，LA還可氧化生成二羥基十八碳烯酸（dihydroxyoctadecenoic acids，DHODEs）與三羥基十八碳烯酸（trihydroxyoctadecenoic acids，THODEs）。在細(xì)胞色素P450作用下，LA可產(chǎn)生其環(huán)氧化物環(huán)氧化十八碳烯酸（epoxyoctadecenoic acids，EPODE），EPODE存在9，10-環(huán)氧-12-十八碳烯酸（9，10-epoxyoctadec-12-enoic acid，9，10-EPODE）和12，13-EPODE兩種異構(gòu)體。EPODEs在可溶性環(huán)氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）的存在下，被水解為DHODEs，分別為9，10-二羥基-12-十八碳烯酸（9，10-dihydroxy-12-octadecenoic acid，9，10-DHODE）和12，13-DHODE［11］。由于EPODEs可在白細(xì)胞中形成［12］，9，10-EPODE，12，13-EPODE也被稱為白細(xì)胞毒素及異白細(xì)胞毒素，相應(yīng)的9，10-DHODE和12，13-DHODE被稱為白細(xì)胞毒素二醇及異白細(xì)胞毒素二醇。THODE也有很多異構(gòu)體，例如9，10，11-THODE、9，10，13-三羥基-11-十八碳烯酸（9，10，13-trihydroxy-11-octadecenoic acid，9，10，13-THODE）、9，12，13-THODE和12，13，16-THODE等，脂肪氧合酶、細(xì)胞色素P450、羥化酶與水解酶都與其形成有關(guān)［13］，形成機(jī)制較為復(fù)雜。研究表明，羥基十八碳烯酸具有多重病理生理學(xué)作用。例如，HODEs與動(dòng)脈粥樣硬化的形成有關(guān)［10］。酒精與HODEs共存的條件下，可加劇Caco-2細(xì)胞腸道屏障的損壞［14］。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，EPODEs與DHODEs可導(dǎo)致肺水腫［15］、抑制線粒體呼吸［16］，造成多器官功能衰竭（例如狗與大鼠的心臟停搏）［17-18］。關(guān)于THODEs生物重要性的研究很少，但是相關(guān)研究表明啤酒中存在的THODEs對(duì)啤酒品質(zhì)有一定的影響［19-21］。

目前，有關(guān)羥基十八碳烯酸的研究主要集中于其體內(nèi)代謝產(chǎn)生途徑、內(nèi)源性羥基十八碳烯酸的病理生理學(xué)意義、體液（血液、尿液等）中含量的分析方法等。例如Penny等［22］采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法對(duì)血液中9，10-DHODE與9，10-EPODE進(jìn)行了檢測(cè)，Newman等［23］采用同種方法對(duì)尿液中的9，10-DHODE與9，10-EPODE進(jìn)行了檢測(cè)，檢出限低達(dá)0.1、0.3 ng/mL。Wu等［24］采用氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)吸附在硅膠上的脂肪酸單分子層，包括EPODE，進(jìn)行了分析。然而有關(guān)外源性（如膳食）羥基十八碳烯酸的生物學(xué)作用、膳食中羥基十八碳烯酸的檢測(cè)方法以及含量分布等研究報(bào)道很少。

腌臘肉制品是原料肉經(jīng)過預(yù)處理、腌制、醬制、晾曬（或烘烤）等工藝加工而成的肉類制品，是我國傳統(tǒng)的肉制品之一，深受廣大消費(fèi)者喜愛。腌臘肉制品主要包括臘肉類、咸肉類、風(fēng)干肉類、火腿、香腸等，普遍加工周期較長(zhǎng)，期間的脂質(zhì)氧化對(duì)于腌臘肉制品的特征風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)以腌臘肉制品中LA的氧化產(chǎn)物——羥基脂肪酸為研究對(duì)象，建立13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE和9，10，13-THODE的HPLCMS/MS分析方法，并研究不同腌臘肉制品中13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE和9，10，13-THODE的含量分布情況，為進(jìn)一步開展腌臘肉制品的羥基十八碳烯酸的相關(guān)研究提供一定的參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

腌臘肉制品 市購。

13-HODE 美國Cayman Chemicals公司；9，10-DHODE、9，10-EPODE及9，10，13-THODE 瑞典Larodan公司；乙腈及甲醇 德國Merk公司；水由純水儀制備美國Millipore公司；Sep-Pak C18固相萃取柱（500 mg/3 mL）美國Waters公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

1290-6460QQQ HPLC-MS/MS儀（配有電噴霧離子源） 美國安捷倫公司；多頭抽真空裝置 美國Alltech公司；Biofuge stratos高速離心機(jī) 德國Heraeus公司；T25高速勻漿機(jī) 德國IKA公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取適量體積質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、0.1、0.1 mg/mL的13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋至質(zhì)量濃度分別為5 μg/mL，取適量體積質(zhì)量濃度為5 μg/mL的13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE混合制備系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使得13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE的質(zhì)量濃度范圍分別為0.05～2.0、0.01～0.5、0.05～1.0、0.01～0.5 μg/mL，將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液儲(chǔ)存于-40 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2樣品處理

將腌臘肉制品切碎裝入密封袋中，儲(chǔ)存于-18 ℃?zhèn)溆谩７Q取2 g的肉樣于100 mL離心管中，加入16 mL甲醇后5 000 r/min均質(zhì)2 min，隨后3 200×g離心10 min，將2.5 mL上清液過C18固相萃取柱（C18固相萃取柱用3 mL甲醇、3 mL水進(jìn)行活化與平衡），棄去最初的0.5 mL洗脫液，收集的剩余洗脫液于-40 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3儀器工作條件

HPLC條件：色譜柱：XBridge C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸，B為乙腈；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；梯度洗脫程序：0 min、50% B；10 min、90% B；20 min、90% B；25 min、50% B；30 min、50% B；進(jìn)樣量：10 μL。

MS條件：離子源：電噴霧源負(fù)離子模式；離子化條件：氣溫與流速分別為300 ℃、8 L/min；鞘流氣溫度與流速分別為280 ℃、11 L/min；霧化氣壓45 psi；毛細(xì)管電壓3.5 kV；定量模式：多反應(yīng)監(jiān)控模式；離子轉(zhuǎn)變：13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE分別為m/z 295.5→m/z 277.3、m/z 313.4→m/z 201.3、m/z 295.3→m/z 277.3、m/z 329.4→m/z 171.3（表1）；所有數(shù)據(jù)通過安捷倫MassHunter工作站中的軟件進(jìn)行分析，包括優(yōu)化軟件、數(shù)據(jù)獲取軟件以及定性分析軟件。

表1　優(yōu)化的轉(zhuǎn)變離子及碰撞條件Table1　Optimized transition ions and collision energy

1.3.4方法驗(yàn)證

1.3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

將13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE配制成質(zhì)量濃度分別為0.05～2.0、0.01～0.5、0.05～1.0、0.01～0.5 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定3 次。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，以對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照3 倍信噪比（RSN=3）和10 倍信噪比（RSN=10）計(jì)算方法的檢出限和定量限。

1.3.4.2精密度實(shí)驗(yàn)

選擇不同的腌臘肉制品，按照1.3.2節(jié)的步驟進(jìn)行處理，每種樣本進(jìn)行6 個(gè)重復(fù)處理，在1 d內(nèi)進(jìn)行HPLC-MS/ MS分析，將其中3 個(gè)重復(fù)連續(xù)3 d每天測(cè)定1 次，以測(cè)得的結(jié)果分別計(jì)算日內(nèi)和日間的精密度（以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示）。

1.3.4.3回收率實(shí)驗(yàn)

選擇與添加水平相近的腌臘肉制品，根據(jù)添加水平向樣本中添加13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE的標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3.2節(jié)的步驟進(jìn)行處理，每個(gè)添加水平做3 個(gè)重復(fù)處理，測(cè)定分析物的含量，計(jì)算回收率。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS statistics 17.0進(jìn)行單因素方差分析與相關(guān)性分析，均值采用鄧肯多重范圍檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2　結(jié)果與分析

2.1樣品處理

色譜分析常用的樣品提取方法包括液液萃取、超臨界流體萃取、超聲波輔助萃取以及微波萃取等［25］。13-HODE、9，10-DHODE、9，10，13-THODE為羥基類脂肪酸，極性較大，可用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，例如乙酸乙酯、甲醇、乙腈等，隨后利用固相萃取柱進(jìn)行凈化濃縮［22］或者直接進(jìn)行色譜分析［23］。通常采用液液提取方法對(duì)內(nèi)源性（如血液、尿液）的13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE進(jìn)行提取［22-23］。對(duì)于飲食中的羥基脂肪酸，本實(shí)驗(yàn)采取超聲波輔助、機(jī)械振蕩以及均質(zhì)勻漿等方式，觀察了乙酸乙酯、乙腈、甲醇以及40%～90%的甲醇的提取效果，隨后利用固相萃取柱對(duì)分析物進(jìn)行凈化濃縮。結(jié)果表明，采用乙酸乙酯提取的回收率最低，約為50%，40%～90%的甲醇提取回收率約為60%～80%，乙腈與甲醇的提取效果相似，回收率均大于80%～95%。由于乙腈價(jià)格較高且毒性較大，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選取甲醇為溶劑進(jìn)行均質(zhì)提取，并與提取后直接進(jìn)行色譜分析進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固相萃取柱起到了很好的濃縮效果，去除大量疏水性的化合物，降低了干擾。本實(shí)驗(yàn)確定的樣品處理方法可以滿足HPLC-MS/ MS法同時(shí)分析腌臘肉制品中13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE含量的要求。

2.2HPLC-MS/MS分析結(jié)果

圖1　混標(biāo)與樣本總離子流圖Fig.1　Total ion chromatograms for mixed standard solution and sample

13-HODE、9，10-DHODE、9，10，13-THODE為羥基類十八碳烯酸，9，10-EPODE為環(huán)氧十八碳烯酸，它們所帶羥基基團(tuán)數(shù)量不同，故在中性或者酸性條件下的響應(yīng)不相同。本實(shí)驗(yàn)研究了中性以及酸性條件下4 種分析物的離子化情況。結(jié)果表明，9，10-EPODE在中性條件下不能離子化，酸性條件下13-HODE、9，10-DHODE、9，10，13-THODE、9，10-EPODE均可離子化，且信噪比高于中性條件，確定流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈，并進(jìn)一步優(yōu)化了梯度洗脫條件。由圖1可見，目標(biāo)分析物與雜質(zhì)峰實(shí)現(xiàn)了基線分離。

通過保留時(shí)間以及MS/MS對(duì)13-HODE、9，10-DHODE、9，10，13-THODE、9，10-EPODE進(jìn)行鑒定。4 種分析物標(biāo)準(zhǔn)品的全掃模式顯示，13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE母離子分別為m/z 295.5、m/z 313.4、m/z 295.3、m/z 329.4（圖2A、2C、2E、2G）。MS/MS 結(jié)果顯示，13-HODE產(chǎn)生了兩個(gè)特征離子峰m/z 277.3（丟失一分子H2O）、m/z 195.5（丟失HO—CH=CH（CH2）3CH3）；9，10-DHODE產(chǎn)生的特征離子峰分別為m/z 295.2（丟失一分子H2O）、m/z 277.4（丟失兩分子H2O）、m/z 201.3（丟失CH3（CH2）4CH=CHCH2—）、m/z 171.2（丟失CH3（CH2）4CH=CHCH2CHOH—）；9，10-EPODE產(chǎn)生的特征離子峰為m/z 277.3（丟失一分子H2O）、m/z 171.2（丟失CH3（CH2）4CH=CHCH2CH—）；9，10，13-THODE產(chǎn)生的子離子為m/z 171.3（HCO—（CH2）7—COO）、m/z 139.4（CH3（CH2）4C（O—）=CH—CH=CH2）。4 種分析物的MS/MS與其他研究是一致的［22-23，26-28］。

在實(shí)際樣本分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)4 種目標(biāo)分析物有異構(gòu)體同時(shí)存在（圖1B）。通過樣本中各個(gè)峰的MS/ MS驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，圖1B中峰1的母離子為m/z 329.4，這與9，10，13-THODE的母離子一致，產(chǎn)生的子離子峰為m/z 229.3、m/z 211.3、m/z 171.3、m/z 139.3（圖2H）；峰3的母離子為m/z 313.3，這與9，10-DHODE的母離子一致，產(chǎn)生的子離子有m/z 295.4、m/z 195.4、m/z 183.2、m/z 129.3（圖2D）；峰6的母離子為m/z 295.4，與13-HODE的母離子一致，產(chǎn)生的子離子峰分別是m/z 277.4、m/z 171.3（圖2B）；峰7的母離子為m/z 295.2，這與9，10-EPODE的母離子一致，產(chǎn)生的碎片離子為m/z 277.4、m/z 195.1、m/z 181.2（圖2F）。通過與相關(guān)文獻(xiàn)［23，26-28］比較發(fā)現(xiàn)，母離子為m/z 329.4的峰1應(yīng)為9，10，13-THODE的異構(gòu)體，可能為9，10，11-THODE或者9，12，13-THODE；母離子為m/z 313.3的峰3為9，10-DHODE的異構(gòu)體12，13-DHODE；母離子為m/z 295.4的峰6是13-HODE的異構(gòu)體9-HODE；母離子為m/z 295.2的峰7為9，10-EPODE的異構(gòu)體12，13-EPODE。

圖2　羥基類十八碳烯酸極其異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2　MS/MS spectra for hydroxy（s） octadecenoic acids and the isomers

2.3方法驗(yàn)證

2.3.1線性范圍及檢出限

將適量13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE和9，10，13-THODE的標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，配制4 種目標(biāo)分析物的質(zhì)量濃度分別為0.05～2.0、0.01～0.5、0.05～1.0 μg/mL和0.01～0.5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，以對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照3倍信噪比（RSN=3）和10倍信噪比（RSN=10）計(jì)算方法的檢出限和定量限，檢出限分別為0.120、0.008、0.200、0.016 μg/g，定量限分別為0.40、0.02、0.64、0.05 μg/g（表2）。4 種分析物的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，由此可見在相應(yīng)線性范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系。

表2　方法的線性、檢出限以及定量限Table2　Linearity， limits of detection， and limits of quantification of the proposed method

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

方法的精密度通過兩種典型的腌臘肉制品的日內(nèi)與日間實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，分別是含有分析物含量相對(duì)較多的農(nóng)家臘腸以及含量相對(duì)較低的板鴨，結(jié)果見表3。13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、和9，10，13-THODE的精密度（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）范圍分別為2.3%～5.7%、4.2%～9.0%、3.8%～6.8%和2.0%～8.6%，表明本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)方法具有較好的精密度。

表3　精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table3　Precision of the method for determination of the analytes （n= 3）

2.3.3準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照低、中、高含量選擇雙匯熏煮火腿、雨潤牛肉火腿以及火腿進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，添加與樣本中目標(biāo)分析物含量相近的標(biāo)準(zhǔn)品，分析添加前后的4 種目標(biāo)分析物的含量，并計(jì)算添加回收率，結(jié)果見表4。由表4可知，13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE的回收率范圍分別為90.8%～97.5%、82.0%～88.0%、84.0%～89.0%、82.0%～89.0%，不同添加水平的平均回收率分別為95.1%、85.2%、86.8%、86.2%。表明本實(shí)驗(yàn)所建立的檢測(cè)方法可較準(zhǔn)確的定量腌臘肉制品中的分析物。

表4　不同添加水平回收率測(cè)定結(jié)果（n=3）Table4　Recoveries of the analytes at different spiked?levels （n=3）

2.3.4實(shí)際樣本分析

13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE具有重要的生理與病理作用，但在腌臘肉制品中的含量分布卻鮮為人知。為了了解傳統(tǒng)腌臘肉制品中4 種分析物的含量，本實(shí)驗(yàn)選取了超市中26 種腌臘肉制品，包括9 種生制腌臘肉制品（例如蘇式香腸、農(nóng)家臘腸），17 種即食制腌臘肉制品（例如雨潤烤腸、荷爾美切片火腿），分析4 種目標(biāo)分析物的含量分布情況（表5）。

表5　生制腌臘肉制品與即食腌臘肉制品中13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE及9，10，13-THODE的含量（x±s，n=3）Table5　Contents of 13-HODE， 9，10-DHODE， 9，10-EPODE and 9，10，13-THODE in raw cured meat products and instant foods from cured meat （x ± s， n= 3）

由表5可知，所有樣本均檢測(cè)出13-HODE、9，10-DHODE和9，10，13-THODE，21 個(gè)樣本檢測(cè)出9，10-EPODE。在生制腌臘肉制品中，13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE和9，10，13-THODE的含量范圍分別為1.40～100.77、0.13～1.82、0.77～6.9 μg/g和0.82～10.12 μg/g；即食腌臘肉制品中4 種目標(biāo)分析物的含量范圍分別為2.87～77.56、0.11～3.93、0.77～6.20 μg/g和0.26～6.57 μg/g。

統(tǒng)計(jì)分析顯示，13-HODE的含量顯著高于9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE（P＜0.05），9，10，13-THODE的含量顯著高于9，10-DHODE、9，10-EPODE（P＜0.05），在檢測(cè)出9，10-EPODE的樣本中，其含量顯著高于9，10-DHODE（P＜0.05）。但在生制腌臘肉制品和即食腌臘制品中，4 種分析物含量并不存在顯著差異（P＞0.05）。統(tǒng)計(jì)分析還顯示，13-HODE、9，10-DHODE和9，10，13-THODE三者顯著相關(guān)（P＜0.01），9，10-DHODE與9，10-EPODE顯著相關(guān)（P＜0.01）。由于不飽和脂肪酸（LA）在酶促或者非酶促條件下氧化［8］，先生成氫過氧化物（HPODE），然后轉(zhuǎn)化為羥基化合物（HODE），再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他氧化產(chǎn)物［29］，這可能是13-HODE含量顯著高于其他氧化產(chǎn)物并且具有顯著相關(guān)性的原因。同樣地，9，10-EPODE在可溶性環(huán)氧化物水解酶的作用下生成9，10-DHODE，腌臘肉制品中加工過程中酶活性的逐漸下降應(yīng)該是導(dǎo)致9，10-EPODE大于9，10-DHODE的主要原因；而某些樣本中未檢出9，10-EPODE但卻有微量9，10-DHODE存在，表明可能存在9，10-DHODE的非酶促形成途徑。生制腌臘肉制品與即食腌臘肉制品中的含量不存在顯著差異，說明上述4 種LA的氧化產(chǎn)物有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，一般食品加工溫度對(duì)它們含量的影響很小。新鮮肉（豬肉、魚肉、牛肉、雞肉等）中4 種目標(biāo)分析物的含量極其低（數(shù)據(jù)未列出），表明腌臘肉制品中羥基脂肪酸主要來源于加工過程。腌臘肉制品的加工過程中羥基脂肪酸的形成規(guī)律、以及影響因素等值得進(jìn)一步深入研究。

13-HODE與9-HODE的峰面積相似，由此可推知腌臘肉制品中二者的含量相似，說明在腌臘肉制品中，非酶促氧化生成HODEs占據(jù)主導(dǎo)地位。在實(shí)際樣本分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有的樣本均存在3 個(gè)以上的目標(biāo)分析物的異構(gòu)體，由于缺少標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)未能對(duì)其進(jìn)行定量分析，但可以推測(cè)，樣本中羥基十八碳烯酸的含量應(yīng)比本實(shí)驗(yàn)結(jié)果高得多。需關(guān)注的是，腌臘肉制品中9，10-DHODE與9，10-EPODE的含量總和在2～8 μg/g間，由于異構(gòu)體的存在使得腌臘肉制品中DHODEs與EPODEs的實(shí)際含量會(huì)更高，由于人體組織中可溶性環(huán)氧化物水解酶的廣泛分布［30］，使得隨食物攝入人體的EPODEs經(jīng)消化后生成的DHODEs要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腌臘肉制品中檢測(cè)出的DHODEs。許多研究表明，HODEs與多種心血管疾病的形成有關(guān)，例如導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化；DHODEs可促進(jìn)有絲分裂以及胸部MCF-7癌細(xì)胞的增值，并可擾亂老鼠的內(nèi)分泌、發(fā)情周期與性行為，所用劑量?jī)H是植物雌激素的1/200［31-32］。因此，腌臘肉制品中廣泛存在的HODEs、DHODEs、EPODEs的形成機(jī)制、加工方式影響及其潛在健康風(fēng)險(xiǎn)有待進(jìn)一步研究。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過樣本處理?xiàng)l件以及色譜條件的優(yōu)化，建立了腌臘肉制品中13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE和9，10，13-THODE的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法。腌臘肉制品中13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE和9，10，13-THODE用甲醇提取，經(jīng)固相萃取柱凈化濃縮，然后在XBridge色譜柱上進(jìn)行梯度分離，流動(dòng)相為0.1%甲酸與乙腈，采用電噴霧源負(fù)離子模式以及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明，13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE和9，10，13-THODE分別在質(zhì)量濃度為0.05～2.0、0.01～0.5、0.05～1.0、0.01～0.5 μg/mL的范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系（R2＞0.999），檢出限分別為0.120、0.008、0.200、0.016 μg/g，不同添加水平的平均回收率分別為95.1%、85.2%、86.8%、86.2%。對(duì)26 種腌臘肉制品含量分析表明，所有樣本都含有13-HODE、9，10-DHODE、9，10，13-THODE，含量分別在1.4～100.7、0.1～3.9、0.4～10.2 μg/g范圍內(nèi)，21 種樣本中含有9，10-EPODE，含量范圍為0.8～6.9 μg/g。4 種分析物異構(gòu)體的存在，提高了腌臘肉制品中來源于LA的羥基脂肪酸的實(shí)際含量。腌臘肉制品中羥基脂肪酸的相關(guān)研究值得關(guān)注。

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Simultaneous Determination of 13-HODE， 9，10-DHODE， 9，10-EPODE and 9，10，13-THOD in Cured Meat Products by HPLC-MS/MS

SONG Hui1，2， GENG Zhiming2， REN Shuang1，2， WANG Daoying2， ZHANG Muhan2， SUN Chong2， XU Weimin1，2，3，*
（1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control， Ministry of Education， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China； 2. Institute of Agricultural Products Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China；3. Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing， Nanjing 210095， China）

13-Hydroxy-9，11-octadecadienoic acid （13-HODE）， 9，10-dihydroxy-12-octadecenoic acid （9，10-DHODE），9，10-epoxyoctadec-12-enoic acid （9，10-EPODE） and 9，10，13-trihydroxy-11-octadecenoic acid （9，10，13-THODE） in cured meat products were detected with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. The analytes， extracted with methanol and cleaned by solid phase extraction， were separated on an XBridge C18column with a mobile phase consisting of 0.1% formic acid in water and acetonitrile， followed by ionization and quantification with an electrospray ionization source in negative ion mode and multiple reaction monitoring mode （MRM）. The results indicated that the calibration curves for 13-HODE， 9，10-DHODE， 9，10-EPODE and 9，10，13-THODE exhibited good linearity（R2＞ 0.999） in the ranges of 0.05-2.0， 0.01-0.5， 0.05-1.0 and 0.01-0.5 μg/mL， respectively. The limits of detection （LODs）for the four analytes were 0.120， 0.008， 0.200， and 0.016 μg/g， and the recoveries were 95.1%， 85.2%， 86.8% and 86.2%，respectively. The method was successfully employed to detect the analytes in 26 cured meat products and the resultsshowed that all the samples contained 13-HODE， 9，10-DHODE and 9，10，13-THODE ranging from 1.4-100.7， 0.1-3.9 and 0.4-10.2 μg/g， respectively， and out of these samples， 21 contained 9，10-EPODE ranging from 0.8-6.9 μg/g. Since some isomers of the analytes were detected in samples as well， the real content of fatty acids with hydroxyl group （s） from oxidation of linoleic acid （LA） might be much higher.

linoneic acid； cured meat products； 13-HODE； 9，10-DHODE； 9，10-EPODE； 9，10，13-THODE； high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）

10.7506/spkx1002-6630-201618022

TS201.6

A

1002-6630（2016）18-0133-08

宋慧， 耿志明， 任雙， 等. 腌臘肉制品中13-HODE、9，10-DHODE、9，10-EPODE、9，10，13-THODE的HPLC-MS/MS檢測(cè)［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（18）: 133-140. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618022. http://www.spkx.net.cn

SONG Hui， GENG Zhiming， REN Shuang， et al. Simultaneous determination of 13-HODE， 9，10-DHODE， 9，10-EPODE and 9，10，13-THOD in cured meat products by HPLC-MS/MS［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 133-140. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618022. http://www.spkx.net.cn

2015-11-19

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401560）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（13）3081）

宋慧（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿馄芳庸づc質(zhì)量控制。E-mail：1562275871@qq.com

徐為民（1969—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槿馄芳庸づc質(zhì)量控制。E-mail：weiminxu2002@aliyun.com