HSPC238對肝癌細胞中RB基因表達的影響*

袁春雷,譚家余，鐘裕恒,黃　湘△,陳敬林

(南方醫科大學附屬中山博愛醫院:1.檢驗科；2.中心ICU；3.產前診斷中心，廣東中山 528400)

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·論著·

HSPC238對肝癌細胞中RB基因表達的影響*

袁春雷1,譚家余2，鐘裕恒3,黃湘3△,陳敬林3

(南方醫科大學附屬中山博愛醫院:1.檢驗科；2.中心ICU；3.產前診斷中心，廣東中山 528400)

目的觀察HSPC238對肝癌細胞中RB mRNA和pRb蛋白水平的影響。方法將PcDNA3.1-HSPC238質粒和PLL3.7-HSPC238干擾載體分別轉染HepG2細胞，用實時熒光定量PCR的方法檢測RB mRNA的表達量;采用Western blotting法檢測pRb蛋白的表達。結果和對照組相比，轉染高表達HSPC238載體時，HepG2細胞中RB的mRNA水平和pRb表達量也增加；相反地，和對照組相比，轉染低表達HSPC238載體時，HepG2細胞中RB的mRNA水平和pRb蛋白的表達量也減少。以上結果差異均有統計學意義(P<0.05)。 結論在HepG2細胞中HSPC238對RB基因的表達存在正向調控作用。

HSPC238；RB基因；肝癌細胞；HepG2

HSPC238是由LOC51255基因編碼的，含有153個氨基酸的C3HC4型鋅指蛋白。該蛋白于2000年登錄Swiss-Prot數據庫。Brophy在2008年發現，該蛋白具有E3泛素連接酶活性[1]。在此基礎上，本課題組于2011年通過體內外試驗研究發現，HSPC238能夠抑制肝癌細胞的增殖[2]。但迄今為止，對HSPC238的功能認識仍然很少。為了進一步了解HSPC238在肝癌發病機制中的作用，本課題組設計了實時熒光定量PCR試驗和免疫印跡試驗，探討外源性高表達或低表達HSPC238對RB mRNA和RB基因編碼的蛋白pRb的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞和載體HepG2細胞購自南京凱基生物科技發展有限公司。PcDNA3.1-HSPC238重組質粒、PcDNA3.1空質粒、PLL3.7-HSPC238干擾載體和PLL3.7陰性干擾載體均由本實驗室保存。

1.1.2試劑HSPC238、pRB抗體和二抗均購自武漢三鷹生物技術有限公司。引物、組織RNA提取試劑盒均購自美國英杰生命技術有限公司。反轉錄及熒光定量PCR試劑購自GeneCopoeia公司。HSPC238引物序列：上游5′-GTT GGT CCT GTG CGG TCA CT-3′，下游5′-GAA AGG CGA ACG TCT CAA CCT-3′；RB引物序列：上游5′-AAA AAG GTT CAA CTA CGC GTG TAA-3′，下游5′-GAG AGG TAG ATT TCA ATG GCT TCT G-3′；內參序列GAPDH(251 bp)：上游5′-CCT GCA CCA CCA ACT GCT TAG-3′；下游5′-CAG TCT TCT GGG TGG CAG TGA-3′。HSPC238的干擾序列為5′-TGC TAT GAG CTG CCC ACT GAT TCA AGA GAT CAG TGG GCA GCT CAT AGC TTT TTT C-3′。引物均委托廣州英俊生物公司合成。PCR擴增儀為ABI PRISM 7000 sequence detection system。

1.2方法

1.2.1HepG2細胞培養和質粒轉染將HepG2細胞接種于6孔細胞培養板，放在37 ℃、5%CO2培養箱進行培養24 h。等細胞的匯合度達到70%～80%時，按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書將PcDNA3.1-HSPC238質粒、PcDNA3.1空質粒、PLL3.7-HSPC238干擾載體和PLL3.7陰性對照載體分別轉染至HepG2細胞。各組在相同條件下培養48 h,然后進行后續試驗。

1.2.2RT-qPCR檢測HSPC238 mRNA表達(1)按試劑盒說明書，將HSPC238高表達組(HepG2/HSPC238)、高表達對照組(HepG2/empty)、低表達組(HepG2/KD)和低表達對照組(HepG2/NC)各組細胞分別提取RNA。將提取所得的RNA在紫外分光光度計上檢測其A260/A280比值和RNA濃度。當A260/A280比值在1.8～2.0的時候，表明純度和濃度符合檢測標準。再用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量。(2)進行反轉錄反應，獲得的cDNA -20 ℃保存。(3)參照qPCR反應體系進行qPCR反應，以GAPDH作為內參與HSPC238同時進行PCR，每例樣本設置3個重復管。(4)將PCR產物作溶解曲線分析，確定產物特異性。

1.2.3免疫印跡試驗(Western blotting)樣品處理后上樣，每例樣本設3個復孔，GAPDH作為內參，然后電泳，轉膜，加一抗(1∶500)反應1.5 h,最后用辣根過氧化物酶標記的相應二抗孵育后發光顯色。

1.3統計學處理以2-△△Ct法表示相對定量結果：以GAPDH作為內參，根據公式△Ct=[Ct(HSPC238)]-[Ct(GAPDH)]，△△Ct=[△Ct(試驗組)]-[△Ct(對照組)]，2-△△Ct表示試驗組HSPC238相對于對照組原始拷貝數的倍數差異，采用SPSS19.0統計軟件包進行t檢驗分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1HepG2/HSPC238組的HSPC238 mRNA表達水平是HepG2/empty組的(5.07±1.580)倍；HepG2/KD組的HSPC238 mRNA表達水平是HepG2/NC的(0.02±0.007)倍,差異均有統計學意義(P<0.05)，如圖1a。HepG2/HSPC238組的RB mRNA表達水平是HepG2/empty (4.41±0.360)倍，差異有統計學意義(P<0.05)；HepG2/KD組的RB mRNA表達水平是HepG2/NC的(0.71±0.110)倍,差異有統計學意義(P<0.05)，如圖1b。

圖1　　HSPC238、RB的mRNA相對表達量

2.2HepG2/HSPC238組的pRb表達水平高于HepG2/empty組；HepG2/KD組的pRb表達水平低于HepG2/NC組，如圖2。

圖2　免疫印跡試驗HSPC238和pRb蛋白檢測的表達水平

3　討　　論

HSPC238編碼的蛋白長度為153個氨基酸，包含1個RING指結構域，屬于C3HC4型鋅指蛋白，它具有E3泛素蛋白連接酶活性。鋅指蛋白是一類重要的轉錄調控因子，鋅指蛋白可以通過RING指結構介導蛋白與蛋白之間的相互作用，參與腫瘤的形成、信號轉導、病毒復制等多種生物學過程(如RNF5、RNF125、mel-18等)[3-5]。

前期研究發現，HSPC238可以通過影響ERK/MAPK通路抑制肝癌細胞的生長，上調HSPC238使磷酸化的ERK1/2水平降低，反之使磷酸化ERK1/2水平增加，但HSPC238的改變不影響ERK1/2的總水平[2]。肝癌的發生發展機制中，ERK/MAPK信號通路的異常是至關重要的。pRb/E2F-1是ERK/MAPK通路的下游調控通路，是G1/S調控點的中心。前期通過流式細胞儀檢測細胞周期的方法顯示，過表達HSPC238可延緩Bel7402細胞株從G1期進入S期，表明 HSPC238可能通過影響細胞周期來抑制肝癌細胞Bel7402的生長[6]。現在通過本研究發現，在肝癌細胞HepG2中，過表達HSPC238可以同時使RB mRNA和pRb蛋白水平上升，低表達HSPC238可以使之下降，表明HSPC238可以通過調節RB mRNA和pRb的水平影響HepG2細胞G1/S進程。結合之前的研究結果，說明HSPC238可以從胞漿到細胞核影響ERK/MAPK到pRb的通路，從而調控G1/S進程。

P53也是細胞周期的重要調控點，研究發現，高表達RPS27a可以顯著抑制通過MDM2介導的P53蛋白的泛素化降解，使得P53蛋白的分解顯著減少，然后引起細胞周期阻滯[7]。在前期研究中發現，在肝癌細胞中HSPC238可以與RPS27a結合，同時可以正向調節RPS27a的表達，因此推測，在肝癌中HSPC238很可能通過結合并調節RPS27a，進而阻礙MDM2泛素化降解p53[8-9]。如此而言，HSPC238很可能是pRb通路和p53通路的1個新連接點，像MDM2、p21、E2F-1、E2F7這些連接點一樣，在p53和pRb相互作用的復雜網絡中起協調作用[10-13]。

由于本研究內容有限，HSPC238能否影響p53的表達水平，具體通過什么方式調節RB mRNA和pRb蛋白水平,還不得而知,是通過直接影響RB基因的啟動子或增強子起作用，還是通過MDM2、p21、E2F-1、E2F7這些連接點間接調節pRb，還需要大量研究證實，這也為后續研究提供了線索和方向。

[1]Brophy TM,Raab M,Daxecker H,et al.RN181,a novel ubiquitin E3 ligase that interacts with the KVGFFKR motif of platelet integrin alpha(Ⅱb)beta3[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,369(4):1088-1093.

[2]Wang S,Huang X,Li Y,et al.RN181 suppresses hepatocellular carcinoma growth by inhibition of the ERK/MAPK pathway[J].Hepatology,2011,53(6):1932-1942.

[3]Jeon YJ,Khelifa S,Ratnikov B,et al.Regulation of glutamine carrier proteins by RNF5 determines breast cancer response to ER Stress-Inducing chemotherapies[J].Cancer Cell,2015,27(3):354-369.

[4]YangLZ,ZhouB,LiXR,etal.RNF125

is a Ubiquitin-Protein ligase that promotes p53 degradation[J].Cellular Physiology and Biochemistry,2015,35(1):237-245.

[5]Lee JY,Kong G.MEL-18,a tumor suppressor for aggressive breast cancer[J].Oncotarget,2015,6(18):15710-15711.

[6]黃湘，譚家余，王穗海，等.過表達HSPC238對Bel7402細胞周期的影響[J].中國免疫學雜志，2011，27(2)：120-125．

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[9]譚家余，黃湘，陳敬林，等.HSPC238對HMOX1、RPS27a、MT2A、UBB調節的初步研究[J]．中國免疫學雜志，2016，32(4)：509-512．

[10]Yin YX,Solomon G,Deng CX,et al.Differential regulation of p21 by p53 and Rb in cellular response to oxidative stress[J].Mol Carcinog,1999,24(1):15-24.

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The effects of HSPC238 on the expression of RB in hepatoma carcinoma cells*

YUANChunlei1,TANJiayu2,ZHONGYuheng3,HUANGXiang3△,CHENJinglin3

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,ZhongshanBoaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Zhongshan,528400,China;2.CentralIntensiveCareUnit,ZhongshanBoaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Zhongshan,528400,China;3.PrenatalDiagnosisCenter,ZhongshanBoaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Zhongshan,528400,China)

ObjectiveTo investigate the effect of up-regulation and down-regulation of HSPC238 on the RB gene mRNA and pRb protein.MethodsPcDNA3.1-HSPC238 vector and PLL3.7-HSPC238 vector was transiently transfected into HepG2 cells respectively.The level of RB mRNA was detected by real-time PCR and pRb was detected by Western blotting.ResultsThe level of RB mRNA and pRb in up-regulation group both increased compared with control grops respectively.Conversely,the level of RB mRNA and pRb in up-regulation group both decreased compared with control grops respectively.Above results were all statistically significant(P<0.05).ConclusionHSPC238 could have a positive effect on the expression of the RB gene.

HSPC238；RB gene；hepatoma carcinoma；HepG2

國家自然科學基金資助項目(81101534)；廣東省自然科學基金資助項目(S2012010010824)。

袁春雷，男，副主任技師，主要從事臨床檢驗方面的研究。△

,E-mail:340382761@qq.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.001

A

1673-4130(2016)18-2505-03

2016-04-21

2016-06-28)