葡萄糖激酶基因4個標簽單核苷酸多態性位點與2型糖尿病的相關性研究*

孫各琴,張秀明,羅楚君,李晶晶,韓　慧,陳　瓊

(中山大學附屬中山醫院醫學檢驗中心，廣東中山 528403)

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·論著·

葡萄糖激酶基因4個標簽單核苷酸多態性位點與2型糖尿病的相關性研究*

孫各琴,張秀明,羅楚君,李晶晶,韓慧,陳瓊

(中山大學附屬中山醫院醫學檢驗中心，廣東中山 528403)

目的探討葡萄糖激酶(GCK)基因4個標簽單核苷酸多態性(tagSNPs)位點rs12702070、rs2268569、rs2268573、rs1476891與2型糖尿病(T2D)的關系。方法選取中山大學附屬中山醫院住院的中國南方漢族T2D患者499例(T2D組)，同時選擇漢族健康人499例作為對照組，對GCK基因的4個tagSNPs位點進行基因分型并檢測樣本代表性。比較T2D組和對照組基因型和等位基因頻率的差異，并在3種遺傳模型下對各SNP位點進行相關性分析。構建GCK基因4個tagSNPs位點的單體型，分析是否存在連鎖不平衡(LD)及不同的GCK單體型與T2D易感性的關系。結果rs2268573、rs2268569、rs1476891的基因型和等位基因頻率在T2D組和對照組之間差異均無統計學意義。rs12702070的基因型和等位基因分布在D2M組和對照組之間差異有統計學意義，且在顯性遺傳模式下以及在加性遺傳模式下其基因型分布在兩組之間差異有統計學意義。GCK基因4個位點中rs2268569、rs12702070和rs1476891有1個LD域，其中共存四種主要單體型，均與個體患T2D的風險無相關性。結論在漢族人群中，GCK基因區域的rs12702070位點與糖尿病遺傳易感性密切相關，而rs2268573、rs2268569、rs1476891位點與糖尿病遺傳易感性無明確相關性。rs2268569、rs12702070、rs1476891 LD域四種主要單體型均與個體患T2D的風險無相關性。

2型糖尿病；基因；葡萄糖激酶；多態性，單核苷酸

糖尿病是一組由胰島素分泌不足或新陳代謝紊亂所導致的高血糖病。據估計，2013年在中國就有9 800萬糖尿病患者，居世界首位[1]。遺傳因素在糖尿病的發生和發展中起重要作用。全基因組關聯研究(GWAS)和候選基因方法已被廣泛用于解釋糖尿病的遺傳基礎，并發現了多個與糖尿病相關的基因[2-3]。但是，糖尿病相關的基因數目和特性、潛在的遺傳模型以及與環境因素的相互作用還不清楚[4]。葡萄糖激酶(GCK)是糖酵解的關鍵酶，也是通過β細胞維持葡萄糖自身穩定的傳感器[5]。GCK基因位于7號染色體上(7p15.3～p15.1)，由12個外顯子組成，編碼由465個氨基酸組成的蛋白質[6]。通過對GCK基因的標簽單核苷酸多態性(tagSNPs)網上系統分析和文獻查閱，與糖尿病相關的GCK基因4個tagSNPs位點rs12702070、rs2268569、rs2268573、rs1476891引起了筆者的關注。因此，本研究對GCK基因上的這4個位點與中國漢族人2型糖尿病(T2D)易感性的關系進行探討。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013年8月至2014年12月在本院診治的T2D患者499例(T2D組)，均符合1999年世界衛生組織糖尿病診斷標準，其中男257例，女242例，年齡28～93歲，平均58.6歲[7]。另取同期體檢健康者499例作為對照組，其中男290例，女209例，年齡27～86歲，平均55.7歲。本研究已通過醫院倫理委員會審核(項目名稱：糖尿病HbA1c相關的遺傳易感基因研究)，患者均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑DU800核酸檢測儀、5415D高速離心機(德國Eppendof公司)，DYY-6B型穩壓穩流電泳儀(北京六一儀器廠)，UVP 凝膠成像系統(美國UVP 公司)，血液基因組提取試劑盒(Gentra Puregene Blood Kit，美國Qiagen公司)。

1.3標本采集入選者知情同意后簽字，分別抽取靜脈血5 mL，EDTA抗凝，室溫放置15 min，2 000 r /min(400 g)離心10 min，吸取上層血漿，有核細胞層經紅細胞裂解液處理后，置-70 ℃低溫冰箱保存備用。

1.4基因組DNA提取采用Gentra Puregene Blood Kit基因組提取試劑盒，提取樣本外周血白細胞基因組DNA，DNA樣本經1%瓊脂糖凝膠電泳對其進行完整度檢查，核酸檢測儀測定濃度，并將樣本DNA稀釋到工作濃度(5～10 ng/L)。

1.5基因檢測SNP位點的檢測使用改良多重高溫連接酶檢測反應技術(iMLDR)，所需PCR擴增引物和多重單堿基延伸反應延伸引物(表1)均由上海天昊生物科技有限公司設計，上海生工生物科技有限公司合成，按要求稀釋到指定濃度。由于待測的SNP附近有其他高頻的SNP，設計連接引物時因為必須緊挨目的位點，所以必定要覆蓋到這些附近的SNP。因此，在設計連接引物時兩種堿基都合成，這樣才不會由于只設計其中一種，而另一種多態的染色體因為和引物存在錯配而效率低，甚至不出現堿基峰，從而導致基因型判讀錯誤。分型試驗委托上海天昊生物科技有限公司進行。反應體系(10 μL)包含：1×GCI buffer，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStar Taq polymerase，1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物。PCR循環程序：95 ℃ 2 min；11個循環(94 ℃ 20 s，65 ℃和0.5 ℃/cycle 40 s，72 ℃ 90 s)；24個循環(94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s)；4 ℃ 60 min；在PCR產物中加入試劑盒中的ExoⅠ/SAP酶1 μL，37 ℃溫浴1 h，然后75 ℃滅活15 min；取10×連接緩沖液2 μL、高溫連接酶0.2 μL、連接引物混合液1 μL與純化后多重PCR產物3 μL、ddH2O 3.8 μL，混勻。連接程序：38個循環(94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min)；4 ℃ 60 min；取0.5 μL稀釋后的連接產物，與0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD 9 μL HiDi混勻，95 ℃變性5 min后上ABI 3130 XL測序儀；收集的原始數據用GeneMapper 4.1(美國應用生物系統公司)分析并輸出結果。

1.6相關定義如果雙親的性狀同時在F1個體上表現出來，這種顯性表現稱為共顯性，或叫并顯性。顯性就是表現出來的特征，隱性是沒有表現出來但是自身攜帶。比如rs2235321(G>A)，G為野生型、A為突變型。共顯性模型假設等位基因G和A均顯性表達，致病基因型為GA、AA型；顯性模型假定突變型A為顯性致病基因，致病基因型為GA、AA型；隱性模型假定突變型A為隱性致病基因，致病基因型為AA型；超顯性模型假定純合子不發病而雜合子發病，致病基因型為GA型。

1.7統計學處理采用病例對照研究。運用Hardy-Weinberg平衡規律檢測樣本代表性；采用SPSS17.0統計軟件處理基因型和等位基因頻率結果，計數資料各百分率比較用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義；運用Haploview軟件進行GCK的4個位點tagSNPs單體型的構建；http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm在線分析LD，分析是否存在LD及不同的GCK單體型與T2D風險的關系。

表1　　擴增SNPs的引物序列

2　結　　果

2.1候選SNPs基因型與等位基因頻率采用iMLDR多重SNP分型試劑盒對998例樣本的4個SNP 進行分型。經統計發現，所有SNP位點均符合Hardy-Weinberg檢驗平衡定律，提示所選人群具有較好代表性。通過多變量回歸分析，rs2268573、rs2268569、rs1476891的基因型(χ2值分別為3.361、0.582、0.918，P>0.05)和等位基因頻率(χ2值分別為0.222、0.590、0.851，P>0.05)在T2D組和對照組之間差異均無統計學意義(見表2)。rs12702070的基因型(χ2值為7.990，P<0.05)和等位基因分布(χ2值為5.979，P<0.05)在T2D組和對照組之間差異有統計學意義(表2)，提示此位點SNP多態性與T2D相關。在顯性遺傳模式下(OR=1.54，95%CI=1.17～2.04，P<0.05)以及在加性遺傳模式下(OR=1.26，95%CI=1.04～1.52，P<0.05)rs12702070的基因型分布在D2M組和對照組之間差異有統計學意義(表3)，提示此位點在顯性和加性遺傳模式下與T2D的易感性相關。

表2　　SNPs位點基因型及等位基因分布在2組的分析

續表2　　SNPs位點基因型及等位基因分布在2組的分析

表3　　不同遺傳背景下各SNP位點分析

表4　　rs12702070C/T、rs1476891G/A和rs2268569T/G位點配對單體型頻率比較

注：-表示無數據。

2.2GCK單體型的構建及與T2D風險的關系運用Haploview軟件進行單體型構建。GCK基因4個位點的3個位點組成LD域，即為rs2268569、rs12702070和rs1476891。GCK的rs2268569、rs12702070和rs1476891 3個位點共存在TAG、TGG、TAT、CGG四種主要單體型(表4)，均與個體患T2D的風險無相關性(χ2=2.718，P>0.05)。

3　討　　論

近年來，探討遺傳因素在糖尿病發生和發展中的作用倍受關注。已有研究表明，鈣蛋白酶10(Calpain-10)基因、KIR6.2基因、HNF-4α基因、TCF7L2基因等與糖尿病的發生和發展相關[8]。本研究通過對GCK基因的tagSNP網上系統分析和文獻查閱，選取GCK基因4個tagSNP位點rs12702070、rs2268569、rs2268573、rs1476891，探討其與中國漢族人T2D風險的關系。本研究在挑選位點時，基于以下兩點：(1)在疾病相關基因中，基因編碼區、5′非編碼區(5′ UTR)、3′非編碼區(3′UTR)、5′附近的基因(5′ near gene)、3′附近的基因(3′near gene)的SNP位點，最小等位基因頻率(MAF)一般大于5%，進入美國國家生物技術信息中心(NCBI)的SNP 數據庫網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，輸入目的基因，找出MAF頻率大于0.05的多態性位點，這些位點在基因的編碼區、5′ UTR、3′UTR、5′ near gene、3′near gene。同時，注意選擇人種，因為不同的人種各SNP的頻率是不同的。(2)1個基因上有很多個SNP 位點，并且基因上位點間往往是有關聯的，可以用1個位點或多個位點的組合代表另外的位點或單體型，所以，可以挑選有代表性的位點來代表基因上其他的位點或人群中存在的常見單體型。在選取tagSNP時主要考慮序列范圍(一般常用基因前5k和后2k)、SNP入選頻率標準(MAF≥0.05)和r2標準(r2≥0.8)。

在dbSNP數據庫中查詢得到：rs12702070位點的MAF值C在歐洲和中國南方漢族人群分別占0.08和0.076。有文獻報道，南斯拉夫高加索白單基因糖尿病患者出現rs12702070位點突變，而對照組未見該位點突變[9]。本研究結果顯示，GCK位點rs12702070與T2D有關，在對背景、年齡和性別做出調整后，仍與T2D相關。在顯性遺傳模式和加性遺傳模式下，rs12702070 tagSNPs位點的基因型分布在D2M組和對照組之間差異有統計學意義(見表3)，提示此位點在顯性和加性遺傳模式下與T2D的易感性密切相關，可能增加個體患T2D的風險，支持上述文獻的研究結論。此外，有文獻還報道，印第安人群rs2268573突變與T2D有相關性，而rs2268569突變在西班牙人、歐洲裔美國人、非裔美國人、中國人群與空腹血糖的水平有關，rs1476891則與空腹血糖的水平無關[10-12]。本研究發現，GCK位點rs2268569、rs2268573、rs1476891等位基因及基因型分布頻率與健康人群相比較差異無統計學意義(表2)，與上述研究不完全一致，提示這些基因與糖尿病及糖代謝的關系尚需深入研究。單體型研究結果顯示，rs12702070、rs1476891和rs2268569形成了LD域，表達顯著關聯(P<0.05)，表明在這3個SNP位點中有基因-基因相互作用。

總之，本研究初步驗證了在漢族人群中，GCK基因區域的rs12702070位點與糖尿病遺傳易感性密切相關，而rs2268573、rs2268569、rs1476891位點與糖尿病遺傳易感性無明確相關性。rs12702070、rs1476891和rs2268569的LD域有基因-基因相互作用。但這些突變基因的具體作用機制仍不明確，值得深入研究，可在今后結合更多臨床資料及數據進一步對比分析。

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The relationship between glucokinase gene 4 tag single nucleotide polymorphism sites and type 2 diabetes mellitus*

SUNGeqin,ZHANGXiuming,LUOChujun,LIJingjing,HANHui,CHENQiong

(DepartmentofExaminationMedicalcenter,ZhongshanAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan,Guangdong528403,China)

ObjectiveTo investigate the relationships between Glucokinase(GCK) gene 4 tag single-nucleotide polymorphisms,tagSNPs)sites which named rs12702070,rs2268569,rs2268573 and rs1476891 polymorphisms and type 2 diabetes in Chinese Southern Han Population．MethodsThis study was designed as a case-control.499 type 2 diabetes patients and 499 healthy controls were chosen.4 GCK tagSNPs sites were analyzed by improved multiple ligase detection reaction(iMLDR),and genotype and allele frequency between T2D group and healthy controls could be determined by chi-square test,logistic regression analysis,and tagSNPs were further analyzed under three genetic modes(dominant,recessive and additive).What′s more,Haploview software was used to construct the haplotype of 4 GCK tagSNPs and the linkage disequilibrium(LD) and relationship between various GCK haplotype and T2D susceptibility could be analyzed.ResultsGenotype distribution of rs2268573,rs2268569 and rs1476891 and allele frequency in T2D group were no significant differences with health controls.Significant differences in genotype distribution of rs12702070 and allele frequency were observed between T2D group and health controls.Under dominant model and additive model,genotype distribution of rs12702070 in T2D was significantly different from health controls.One LD domain was observed in 3 tagSNPs among those 4 sites of GCK gene.There are 4 main haplotypes(TAG,TGG,TAT,CGG)in rs2268569,rs12702070 and rs1476891,but all these haplotypes have no relevance to the individual risk of T2D(P>0.05).ConclusionThe results indicated that the GCK gene tagSNPs site rs12702070 imparts susceptibility to T2D in Han Chinese,but not rs2268573,rs2268569 and rs1476891.Four main haplotypes in rs2268569,rs12702070 and rs1476891 have no relevance to T2D.

type 2 diabetes；gene；glucokinase；polymorphism,single nucleotide

廣東省科技計劃基金資助項目(2013B02180012)。

孫各琴，女，副主任技師，主要從事分子生物學方面的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.002

A

1673-4130(2016)18-2507-04

2016-03-12

2016-05-20)