2型糖尿病患者自體血細胞葡萄糖細胞膜轉運研究*

黃中偉，葛才保

(江蘇省南京市溧水區人民醫院檢驗科　211200)

?

·論著·

2型糖尿病患者自體血細胞葡萄糖細胞膜轉運研究*

黃中偉，葛才保

(江蘇省南京市溧水區人民醫院檢驗科211200)

目的對2型糖尿病(T2DM)患者自體血細胞葡萄糖細胞膜轉運進行研究。方法T2DM組(40例)、T2DM前期組(前期組，34例)、對照組(40例)抗凝全血分別加入同體積生理鹽水和ATP，37 ℃水浴3 h，觀察葡萄糖水平變化，計算葡萄糖下降值和下降比例。結果組內比較，加ATP管葡萄糖下降值高于鹽水管(P<0.01)。組間比較，鹽水管葡萄糖下降比例，T2DM組、前期組、對照組依次增加，T2DM組低于對照組(P<0.01)，T2DM組低于前期組(P<0.05)。ATP管葡萄糖下降比例，T2DM組低于對照組(P<0.05)。T2DM患者加ATP后葡萄糖下降值由鹽水管的(2.81±0.52)mmol/L增加到(4.73±0.69)mmol/L。結論T2DM患者存在葡萄糖細胞膜轉運障礙，與病程進展相關，ATP能夠改善葡萄糖的細胞膜轉運。

2型糖尿病；ATP；細胞膜轉運；葡萄糖

細胞外三磷酸腺苷(eATP)作為細胞外信號分子調控細胞并參與細胞膜的物質轉運，eATP不足影響細胞內能量代謝[1]。2型糖尿病(T2DM)糖代謝紊亂，其組織細胞的葡萄糖攝取利用能力下降，形成細胞外高糖、細胞內低糖、能量代謝障礙。骨骼肌細胞、脂肪細胞、血細胞等組織細胞依賴eATP進行葡萄糖細胞膜轉運，eATP不足成為T2DM的關鍵因素[2]。本文通過將T2DM患者組(下稱T2DM組)、糖尿病前期組(下稱前期組)、對照組全血樣本放置37 ℃水浴3 h，觀察葡萄糖水平變化，并外加ATP分析eATP對T2DM患者自體血細胞葡萄糖細胞膜轉運的影響。

1　資料與方法

1.1一般資料T2DM組，40例初診T2DM患者，其中，男27例，女13例，平均年齡(59.3±12.0)歲。前期組34例，其中男22例，女12例，平均年齡(57.9±11.8)歲；6.1 mmol/L≤空腹血糖(FBG)<7.0 mmol/L，7.8 mmol/L≤餐后2 h血糖<11.1 mmol/L。對照組為健康體檢者，共40例，其中男25例，女15例，平均年齡(53.3±10.6)歲；無心血管、高血壓史及近期用藥史。空腹采集靜脈血5～6 mL，3 mL以枸櫞酸鈉抗凝，剩余分離血清作常規生化檢測。

1.2儀器與試劑HITACHI 7600全自動生化分析儀，Abbott i2000化學發光分析儀；總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和葡萄糖(GLU)，Di Lab試劑；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，日本協和試劑；游離脂肪酸(FFA)，北京華宇億康生物試劑；胰島素(INSULIN)，Abbott試劑。三磷酸腺苷(ATP)注射液(20 mg/2 mL)，徐州萊恩藥業有限公司生產，批號：1301211。

1.3方法3組人員抗凝血離心測定血漿GLU后，輕輕混勻，各吸1 mL抗凝全血于A管和B管。A管加0.2 mL生理鹽水(NS)，B管加0.2 mL ATP (eATP)，37 ℃水浴3 h，其間每30 min輕輕混勻1次，避免溶血。3 h后低速離心，檢測各管血漿GLU水平，比較各組間加NS后血漿葡萄糖(NS-GLU)和加ATP后血漿葡萄糖(eATP-GLU)下降的絕對值及下降比例。

2　結　　果

2.13組患者血清檢測一般資料，見表1。TC:T2DM組高于對照組(P<0.05)；TG:T2DM組高于對照組(P<0.01)，T2DM組高于前期組(P<0.05)，前期組高于對照組(P<0.05)；HDL-C:T2DM組低于對照組(P<0.01)，前期組低于對照組(P<0.05)；LDL-C:T2DM組高于對照組(P<0.05)；FFA:T2DM組高于對照組(P<0.01)，T2DM組高于前期組(P<0.01)，前期組高于對照組(P<0.01)。

2.2全血樣本加生理鹽水和ATP，37 ℃ 3 h，測定鹽水管葡萄糖(NS-GLU)和ATP管葡萄糖(eATP-GLU)，計算下降值和下降比例，見表2。組內比較，eATP管顯著低于鹽水對照管(P<0.01)。組間比較，鹽水管葡萄糖下降值，T2DM組高于對照組(P<0.01)，T2DM組高于前期組(P<0.05)，前期組高于對照組(P<0.05)；葡萄糖下降比例，T2DM組、前期組、對照組依次增加，T2DM組低于對照組(P<0.01)，T2DM組低于前期組(P<0.05)。ATP管葡萄糖下降值，T2DM組顯著高于對照組和前期組(P<0.01)，前期組高于對照組(P<0.05)；葡萄糖下降比例，T2DM組低于對照組(P<0.05)。

表1　　3組一般資料比較

注：與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與T2DM前期組比較,△P<0.05,△△P<0.01。

表2　　各組間鹽水管和ATP管37 ℃ 3 h后葡萄糖下降值和下降比例±s)

注：同組間加ATP管和鹽水對照管比較,#P<0.01;組間比較,T2DM組與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01;T2DM組與前期組比較,△P<0.05,△△P<0.01。

3　討　　論

本文以枸櫞酸鈉抗凝全血樣本，在短時間內完成試驗，保證了試驗過程中全血細胞的活體能量代謝，通過37 ℃水浴孵育3 h，測定葡萄糖水平的變化，觀察葡萄糖細胞膜轉運帶來的細胞外葡萄糖改變。本文ATP以外加方法加入試驗體系中，表現為eATP的作用。通過加同體積生理鹽水和ATP的試驗管比較，分析eATP對葡萄糖細胞膜轉運的影響。本文一般資料顯示，T2DM組、前期組、對照組符合T2DM診斷篩選標準，TC、TG、HDL-C、LDL-C、FFA等組間差異也符合T2DM脂代謝紊亂規律。

本文觀察到全血樣本經37 ℃ 3 h孵育后的葡萄糖水平變化，T2DM組、前期組、對照組加ATP管都顯著低于同樣條件下的生理鹽水管(P<0.01)，充分說明外加ATP促進了細胞外葡萄糖向細胞內的轉運，即eATP促進了葡萄糖的細胞膜轉運。加鹽水管，對照組、前期組、T2DM組葡萄糖下降比例依次下降，表明T2DM疾病進展中葡萄糖的細胞膜轉運速率不斷下降，T2DM患者存在葡萄糖細胞膜轉運障礙。有學者測定健康者、糖耐量異常者、糖尿病患者37 ℃水浴1～3 h的血糖下降速率，結果平均每小時分別為0.080、0.051、0.038，也使T2DM患者葡萄糖下降速率明顯減低。全血樣本加ATP后進一步增加了T2DM患者的葡萄糖下降值，由鹽水管的(2.81±0.52)mmol/L增加到(4.73±0.69)mmol/L，前期組也是同樣效應；葡萄糖下降比例T2DM組與對照組的差異由P<0.01縮小到P<0.05，T2DM和前期組的差異由P<0.05縮小到無差異，外加ATP改善了T2DM組和前期組的葡萄糖細胞膜轉運。數據表明，T2DM患者存在葡萄糖的細胞膜轉運障礙，并與疾病進展相關，eATP對葡萄糖的細胞膜轉運具有促進作用，能夠部分緩解T2DM患者的葡萄糖細胞膜轉運障礙，eATP通過細胞膜轉運與T2DM的相關性值得深入研究。

病因學研究表明，腸道菌群影響機體能量代謝，與T2DM的發生密切相關[3]。通過eATP測定、腸道菌群定量分析、細胞膜轉運研究建立的細胞膜轉運障礙發病機制研究表明，食品防腐劑等因素使腸道菌群數量下降，導致血漿eATP下降，葡萄糖細胞膜轉運障礙，形成細胞外高糖、細胞內低糖；葡萄糖細胞膜轉運障礙，使胰島素效應下降，表現為胰島素抵抗；葡萄糖細胞膜轉運障礙，使細胞內能量供給不足，特別是餐后2 h血漿eATP最低點，形成細胞即時分泌功能障礙，導致胰島素等多激素、多細胞因子分泌缺陷[4-5]。本文結果進一步論證了細胞膜轉運障礙發病機制。

胃腸道調節血糖因素、改善β細胞功能是T2DM基礎研究中的難點[6]。有研究發現，T2DM患者中性粒細胞和正常血漿孵浴后的吞噬功能得到改善[7-8]。Marchetti等[9]研究表明，β細胞的糖代謝異常導致ATP生成不足和胰島素分泌缺陷。Bajpeyi等[10]研究也發現，線粒體能量代謝障礙是細胞功能障礙的主要原因。這些研究表明，β細胞等機體細胞功能障礙的原因在細胞外，細胞外因素使細胞內能量代謝障礙進一步導致細胞分泌功能缺陷，eATP不足和細胞膜轉運障礙都是需要研究的重點，本文eATP促進了T2DM患者的葡萄糖細胞膜轉運，能否改善細胞內能量代謝和細胞功能值得探討。

有研究顯示，eATP不足與胰島素分泌缺陷相關。Na+-葡萄糖轉運體、K-Na、ATPase等膜蛋白能感受細胞膜電位的變化，并與ATP消耗相關[11]。胰島素分泌研究表明，儲存池囊泡胰島素的分泌需要消耗ATP[12]。Rosenthal[13]進一步研究證實，囊泡運輸伴隨著eATP的下降。通過全內反射顯微術和一種ATP敏感熒光記錄儀進行了人和小鼠β細胞細胞膜離子通道的ATP動力學試驗，當葡萄糖水平升高到11～20 mmol/L時，相鄰β細胞的ATP出現波動，ATP PM濃度級波動與Ca2+內流形成負反饋，ATP水平下降促進Ca2+內流，導致胰島素的分泌；該試驗ATP能夠被測定，結合ATP水平下降和Ca2+內流的特點，表明eATP促進了胰島素分泌。IL-1、IL-6等炎性因子水平異常與T2DM患者的細胞功能相關[14]。Bustamante等[15]研究顯示，通過eATP促進了骨骼肌細胞的IL-6表達，eATP能否改善β細胞的胰島素分泌缺陷，值得研究。

熱休克蛋白72(eHSP72)是重要逆境蛋白，有研究顯示，eHSP72與胰島素抵抗指數、體質量指數呈正相關，在ROS形成、β細胞功能障礙發生中具有一定作用[16]。說明T2DM發生機制中存在逆境因素，細胞膜K、Na-ATPase活性下降、葡萄糖轉運蛋白的異常表達等可能與此相關。有研究發現，eATP不足形成逆境損害，并進一步形成逆境適應，導致受損環節的適應性過度表達[17]。所以，通過eATP促進葡萄糖細胞膜轉運，改善細胞內能量代謝逆境，進一步改善細胞功能，可能是實現β細胞胰島素分泌缺陷逆轉的途徑之一。本文結果也顯示，eATP體外降血糖試驗獲得成功，對T2DM患者的治療具有一定指導意義。因此，通過糞菌移植(FMT)、活菌制劑改善T2DM患者腸道菌群狀況，通過eATP等改善胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷，通過苯甲酸鈉等食品防腐劑建立食源性、腸道菌群抑制、細胞膜轉運障礙的T2DM模型以及減少食品防腐劑使用抑制T2DM流行等都將是筆者的工作方向，期望T2DM的最終克服。

[1]Alvarez CL,Schachter J,De Sá Pinheiro AA,et al.Regulation of extracellular ATP in human erythrocytes infected with plasmodium falciparum[J].PLoS One,2014,9(5):e96216.

[2]葛才保，陳六生，張力，等．細胞外ATP促葡萄糖細胞膜轉運的回顧性研究[J]．國際檢驗醫學雜志，2012，33(S1)：39-43．

[3]張永頂，李興武．體外血糖降低速率與糖耐量異常關系探討[J]．實用全科醫學，2006，4(6)：678-679．

[4]Caricilli AM,Saad MJ.Gut microbiota composition and its effects on obesity and insulin resistance[J].Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2014,17(4):312-318.

[5]葛才保．以細胞膜轉運理論分析2型糖尿病發病機理[J]．實用糖尿病雜志，2011，7(4)：11-13．

[6]張立平，葛才保，張力，等．定量分析腸道細菌總數及其與2型糖尿病的關系[J]．國際檢驗醫學雜志，2013，34(16)：2091-2092．

[7]甘立霞．2型糖尿病基礎研究中的難題與突破[J]．第三軍醫大學學報，2014，36(15)：1543-1547．

[8]Shurtz-Swirski R,Sela S,Herskovits AT,et al.Involvement of peripheral polymorphonuclear leukocytes in oxidative stress and inflammation in type 2 diabetic patients[J].Diabetes Care,2001,24(1):104-110.

[9]Marchetti P,Lupi R,Del G,et al.The bete-cell in human type 2 diabetes[J].Adv Exp Med Bio,2010,654:501-514.

[10]Bajpeyi S,Pasarica M,Moro C,et al.Skeletal muscle mitochondrial capacity and insulin resistance in type 2 diabetes[J].J Clin Endocrinol Metab,2011,96(4):1160-1168.

[11]陳興娟，張熙東，張璇，等．細胞膜電位對非離子通道膜蛋白功能的調節[J]．中南大學學報(醫學版)，2013，38(2)：216-220．

[12]馬曉松．β細胞的電活動和細胞內胰島素囊泡與第二信使的對話[J]．中華內分泌代謝雜志，2011，27(9)：794-795．

[13]Rosenthal.The progressive ankylosis gene product ANK regulates extracellular ATP levels in primary articular chondrocytes[Z],2013:R154.

[14]邰秋園，陳六生，葛才保，等．2型糖尿病患者單核/巨噬細胞功能研究[J]．國際檢驗醫學雜志，2012，33(18)：2196-2197．

[15]Bustamante M,Fernández-Verdejo R,Jaimovich E,et al.Electrical stimulation induces IL-6 in skeletal muscle through extracellular ATP by activating Ca(2+) signals and an IL-6 autocrine loop[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2014,306(8):E869-882.

[16]Krause M,Keane K,Rodrigues-Krause J,et al.Elevated levels of extracellular heat-shock protein 72 (eHSP72) are positively correlated with insulin resistance in vivo and cause pancreatic β-cell dysfunction and death in vitro[J].Clin Sci(Lond),2014,126(10):739-752.

[17]Lim MH,Wu J,Yao J,et al.Apyrase suppression raises extracellular ATP levels and induces gene expression and cell wall changes characteristic of stress responses[J].Plant Physiol,2014,164(4):2054-2067.

Glucose membrane transport studies of blood cells in type 2 diabetes*

HUANGZhongwei,GECaibao

(LishuiDistrictPeople′sHospital,Jiangsu,Nanjing211200,China)

ObjectiveTo explore the transport capacity of glucose membrane with blood cells in type 2 diabetes.MethodsThe anticoagulated blood of T2DM(40 cases),Pre-diabetes(34 cases),control group(40 cases) were added to the same volume of saline and ATP,37 ℃ 3 h.The changes of glucose was observed,he level and Rate of glucose decreased were calculated.ResultsThe drop-out value in the groups of ATP was higher than which of salt water(P<0.05).In salt groups,the drop ratio in the T2DM,Pre-diabetes,control groups were increaseed in turn.the value of glucose in T2DM was lower than which in control group and in Pre-diabetes(P<0.05).In the ATP groups,the drop-out value in T2DM was lower than which in control group(P<0.05).To T2DM patients,the drop-out value was (2.81±0.52)mmol/L in salt grops,which was (4.73±0.69)mmol/L,respectively.ConclusionThe glucose membrane transporters for T2DM were obstacles,the obstacles associated with progression of T2DM,ATP can improve membrane transporter of glucose.

type 2 diabetes；ATP；membrane transport；glucose

江蘇大學醫學臨床科技發展基金資助項目(JLY20140084)。

黃中偉，男，副主任技師，主要從事臨床生化及流式細胞術檢測分析。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.006

A

1673-4130(2016)18-2520-03

2016-04-04

2016-06-11)