1,25-(OH)2VitD3對人胰腺癌細胞侵襲遷移能力及MMP-2、9、14表達的影響

楊晟，劉聲財，陳文華，胡騰騰，林軍

(武漢大學中南醫院，武漢430071)

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1,25-(OH)2VitD3對人胰腺癌細胞侵襲遷移能力及MMP-2、9、14表達的影響

楊晟，劉聲財，陳文華，胡騰騰，林軍

(武漢大學中南醫院，武漢430071)

目的觀察1，25-二羥基維生素D3[1,25-(OH)2VitD3]對人胰腺癌PANC-1細胞侵襲遷移能力的影響，以及基質金屬蛋白酶(MMP)-2、9、14的表達變化。方法 將不同濃度(0、25、50、75、100 μmol/L)的1,25-(OH)2VitD3作用于PANC-1細胞，干預24 h時分別用Transwell細胞侵襲、遷移實驗觀察細胞的侵襲和遷移能力，干預48 h時用Western blot法檢測細胞MMP-2、9、14蛋白。結果 0、25、50、75、100 μmol/L的1,25-(OH)2VitD3干預PANC-1細胞24 h時，侵襲細胞數分別為(46.20±0.84)、(30.80±2.28)、(18.80±1.64)、(13.20±2.39)、(5.20±1.30)個/HP，遷移細胞數分別為(66.03±1.25)、(55.82±1.65)、(41.43±1.51)、(19.86±1.45)、(10.23±1.95)個/HP；隨著1,25-(OH)2VitD3濃度增加侵襲及遷移細胞數逐漸減少，差異有統計學意義(P均<0.05)。1,25-(OH)2VitD3干預PANC-1細胞48 h后，隨著1,25-(OH)2VitD3濃度增加PANC-1細胞MMP-2、9、14蛋白相對表達量逐漸減少，差異有統計學意義(P均<0.05)。結論 1,25-(OH)2VitD3可通過下調MMP-2、9、14蛋白的表達，從而抑制胰腺癌PANC-1細胞的侵襲與遷移。

胰腺癌；細胞侵襲；細胞遷移；1，25-二羥基維生素D3；基質金屬蛋白酶

胰腺癌是高度致死性惡性腫瘤之一[1],腫瘤轉移是導致患者死亡及預后差的原因之一[2]。以吉西他濱為基礎的化療方案是進展期胰腺癌的標準方案，但療效并不盡如人意[3]。1，25-二羥基維生素D3[1,25-(OH)2VitD3]是一種脂溶性類固醇激素，有研究表明其可通過下調上皮細胞間質轉化過程(EMT)和基質金屬蛋白酶家族(MMPs)表達抑制腫瘤細胞的侵襲轉移，從而發揮抗腫瘤作用[4～6]，但其抑制胰腺癌浸潤轉移的作用及其相關機制不甚明了。2015年11月～2016年5月，我們觀察了1,25-(OH)2VitD3對胰腺癌PANC-1細胞侵襲、遷移能力的影響，以及MMP-2、9、14蛋白表達變化，進一步明確其阻止胰腺癌發生轉移的機制。

1　材料與方法

1.1材料PANC-1細胞購自中國科學院上海細胞庫；1,25-(OH)2VitD3購自美國Sigma公司，純度為99.9%，用無水乙醇溶解稀釋成100 mmol/L儲存液，0.22 μm微孔濾膜過濾消毒，分裝，4 ℃保存備用；RPMI 1640培養基、0.25%胰蛋白酶購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司；Transwell小室(24孔，8 μm孔徑)為Corning公司產品、Matrigel基質膠為BD Biosciences公司生產；MMP-2、9、14兔抗人單克隆抗體、HRP標記的二抗、內參β-actin購自美國Abcam公司；其他常規生物化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2PANC-1細胞培養與處理PANC-1細胞用含10%胎牛血清、青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養液在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中常規培養，隔天換液1次，3～4 d傳代1次。取對數生長期細胞，用1,25-(OH)2VitD3進行干預，用RPMI 1640培養基稀釋使其終濃度分別為0、25、50、75、100 μmol/L。

1.3PANC-1細胞侵襲能力觀察采用Transwell細胞侵襲實驗。將Transwell小室放入24孔板內，在小室底部膜的上室面均勻鋪上50 μL稀釋的Matrigel基質膠，室溫風干。將不同濃度1,25-(OH)2VitD3干預24 h的PANC-1細胞用胰蛋白酶消化，調整細胞密度為1×105/mL。各取細胞懸液200 mL接種于小室的上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基。常規培養24 h后取出Transwell小室，用棉簽小心地擦掉上室面的Matrigel膠和細胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%結晶紫染液染色15 min，PBS洗3遍；顯微鏡下隨機選取5個高倍視野并計數，取均值。實驗重復3次。

1.4PANC-1細胞遷移能力觀察采用Transwell細胞遷移實驗，步驟與侵襲實驗基本相同，只是Transwell小室底部膜的上室面未被Matrigel膠包被。

1.5PANC-1細胞MMP-2、9、14蛋白檢測采用Western blot法。收集不同濃度1,25-(OH)2VitD3干預48 h的PANC-1細胞，用預冷的PBS漂洗2次后立即加入細胞裂解液，冰上裂解30 min；4 ℃離心5 min，提取細胞總蛋白用紫外分光光度法測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，行SDS-PAGE分離后，電轉膜至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉；加特異性一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min；加相應二抗室溫孵育2 h，TBST洗去多余二抗；化學發光劑顯色，應用BandScan凝膠圖像分析軟件分析結果。以目的蛋白條帶與內參蛋白β-actin條帶灰度比值表示目的蛋白相對表達量。

2　結果

2.11,25-(OH)2VitD3對PANC-1細胞侵襲遷移能力的影響隨著1,25(OH)2D3濃度增加，侵襲及遷移細胞數逐漸減少(P均<0.05)。見表1。

表1　　　　不同濃度1,25-(OH)2VitD3對PANC-1細胞侵襲、遷移能力的影響(個

2.21,25-(OH)2VitD3對PANC-1細胞MMP-2、9、14蛋白表達的影響隨著1,25-(OH)2VitD3濃度的增加,PANC-1細胞MMP-2、9、14蛋白相對表達量逐漸減少(P均<0.05)。見表2。

表2　　　　不同濃度1,25-(OH)2VitD3對PANC-1細胞MMP-2、9、14蛋白表達的影響

3　討論

惡性腫瘤發生侵襲轉移的基本步驟包括：原發腫瘤的增殖；腫瘤細胞侵犯毗鄰基底膜和細胞外基質(ECM),ECM的降解；腫瘤細胞的趨化和游出，進入循環系統中存活并最終侵入血管、淋巴系統形成遠處轉移灶，以及新生血管的形成促使轉移瘤快速生長等[7，8]。由此可知，腫瘤細胞發生侵襲轉移的基礎關鍵有兩個：一是細胞通過對基底膜和ECM的降解，從而突破細胞間屏障進入循環系統或侵入靶器官；另一個就是形成遠處轉移灶后促進新生血管形成，從而加速轉移瘤的生長。本研究結果表明，隨著1,25-(OH)2VitD3濃度的增加，其抑制胰腺癌PANC-1細胞的遷移侵襲能力增強，提示1,25-(OH)2VitD3可能是針對這兩個關鍵步驟從而在體外發揮抑制腫瘤侵襲轉移的作用。

基底膜完整性破壞和ECM降解是腫瘤發生侵襲轉移的先決條件，也是決定其惡性程度的一個重要因素[9]。有研究表明，腫瘤細胞必須先降解細胞外微環境的ECM和基底膜，然后通過細胞外的結合位點與ECM結合，進而溶解ECM并最終向外擴散、侵襲轉移至鄰近組織或遠處靶器官。多種酶類可降解ECM中的大分子蛋白，其中MMPs在惡性腫瘤的浸潤轉移中發揮著重要作用[10]。MMPs是一組依賴鋅離子、高度保守、具有多種生化性質的蛋白水解酶，目前已發現的MMPs成員達20多種，根據結構特征和作用底物的不同可分為5個亞類，MMP-2、9、14是這一家族中的重要成員。其中，MMP-2、9能特異性地降解基底膜的Ⅵ型膠原和明膠，破壞了基底膜的連續性和完整性，從而促進腫瘤的發展、侵襲及轉移。吳俊本等[11]應用免疫組化染色法檢測了30例胰腺癌及配對癌旁組織中MMP-2、9的表達，結果表明MMP-2、9在胰腺癌組織中呈高表達，且與腫瘤的惡性程度相關。Ren等[12]將納入的28個研究進行Meta分析，結果表明MMPs尤其MMP-2、9在乳腺癌中充當獨立的預后預測因子,其高表達者預后差。應用人工合成的基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)，如BB94可有效地抑制腫瘤的生長和轉移。本研究應用1,25-(OH)2VitD3干預以后，MMP-2、9表達呈現出下調的趨勢，并伴隨著腫瘤細胞遷移侵襲能力的減弱。因此，我們推測MMP-2、9過表達引起的腫瘤細胞侵襲轉移能力增強是導致腫瘤惡性進展的重要原因。

MMP-14是第一個發現的膜型MMPs，因此也被稱為膜型的基質金屬蛋白酶-1(MT1-MMP)。有研究發現，MMP-14在胰腺癌組織中的表達亦顯著高于正常胰腺組織，但MMP-14的表達與患者的臨床病理特征無關[13]。MMP-14可通過對Ⅰ型膠原和ECM的破壞使腫瘤浸潤性生長，還能激活MMP-2、9的活性[14]，而后者在胰腺癌的侵襲轉移中發揮著重要作用[15]。本研究結果顯示，1,25-(OH)2VitD3干預以后，胰腺癌PANC-1細胞MMP-2、9、14蛋白表達均減低，并伴隨著腫瘤細胞遷移侵襲能力的減弱。由此可見，1,25-(OH)2VitD3可通過影響MMPs的表達在胰腺癌的侵襲轉移中發揮拮抗作用，MMPs有可能成為胰腺癌靶向治療的一個新位點。

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Effect of 1,25(OH)2D3on migratory, invasive ability and expression of MMP-2, 9 and 14 of human pancreatic cancer cell line PANC-1

YANGSheng,LIUShengcai,CHENWenhua,HUTengteng,LINJun

(ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China)

ObjectiveTo investigate the effect of 1, 25-dihydroxyvitamin D3[1,25(OH)2D3] on invasive and migratory abilities of human pancreatic cancer cell line PANC-1 and the changes in the expression of matrix metalloproteinases (MMP)-2, 9 and 14. MethodsThe routinely cultured human pancreatic cancer cell line PANC-1 in vitro was treated with different concentrations of 1, 25(OH)2D3(0, 25, 50, 75 and 100 μmol/L). After 24 hours, the abilities of migration and invasion in vitro in each group were detected by Transwell migration and invasion assays. After 48 hours, the protein expression of MMP-2, 9 and 14 in each group was measured by Western blotting. ResultsAfter intervention for 24 h with different concentrations of 1,25(OH)2D3(0, 25, 50, 75 and 100 μmol/L), every field′s invasive cells in each group were (46.20±0.84), (30.80±2.28), (18.80±1.64), (13.20±2.39) and (5.20±1.30)/HP; and the migratory cells in each group were (66.03±1.25), (55.82±1.65), (41.43±1.51), (19.86±1.45) and (10.23±1.95)/HP, respectively. The migratory and invasive cells were decreased with the increase of concentration, and the difference was statistically significant (allP<0.05). After intervention for 48 h with different concentrations of 1,25(OH)2D3, MMP-2, 9 and 14 protein expression showed a declining trend with the increase of concentration, and the difference was statistically significant (allP<0.05). Conclusion 1, 25(OH)2D3can inhibit the invasion and migration of PANC-1 cells through down-regulating the expression of MMP-2, 9 and 14.

pancreatic carcinoma; cell invasion; cell migration; 1, 25-dihydroxyvitamin D3; matrix metalloproteinase

湖北省自然科學基金面上項目(2014CFB747)。

楊晟(1990-),男,碩士研究生，主要研究方向為消化系統腫瘤的防治。E-mail： 383104669@qq.com

簡介：林軍(1964-),男,博士,主任醫師,主要研究方向為消化系統腫瘤的防治。E-mail: linjun64@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.006

R735.9

A

1002-266X(2016)34-0017-03

2016-06-06)