腦死亡狀態豬血清炎性介質水平與肝臟早期損傷的關系

趙靜雯，唐纓，牛寧寧，于慧敏，劉洋

(天津市第一中心醫院，天津300192)

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·基礎研究·

腦死亡狀態豬血清炎性介質水平與肝臟早期損傷的關系

趙靜雯，唐纓，牛寧寧，于慧敏，劉洋

(天津市第一中心醫院，天津300192)

目的探討巴馬小型豬在腦死亡狀態下血清炎性介質水平與肝臟早期損傷的關系。方法 采用顱內漸進加壓法建立豬腦死亡模型6只，分別于腦死亡前及腦死亡后0、3、6、9 h取血，ELISA法檢測血清炎性介質IL-1β、IL-6、TNF-α；同時穿刺取肝組織，電鏡下行肝組織損傷評分。結果豬血清IL-6水平自腦死亡0 h開始升高，9 h與腦死亡前比較差異顯著(P<0.01)；而血清IL-1β和TNF-α水平在腦死亡前后及腦死亡后各時點均無統計學差異(P均>0.05)。隨腦死亡時間延長，電鏡下豬肝組織逐漸出現不可逆性損傷，腦死亡后9 h較腦死亡前及腦死亡后0 h肝組織損傷評分升高(P=0.007、0.035)。腦死亡豬血清IL-6水平與電鏡肝組織損傷評分呈正相關(r=0.702，P=0.000)。結論豬血清炎性介質IL-6水平隨著腦死亡時間延長逐漸升高，與腦死亡狀態下肝臟的早期損傷可能有關。

肝臟移植；腦死亡；供體；炎性介質；肝臟損傷；動物實驗

腦死亡供體已成為肝臟移植的主要供體來源[1]，但由于腦死亡狀態復雜的血流動力學改變、內分泌系統紊亂和代謝功能障礙等因素，嚴重影響供體肝臟的質量[2]。有研究表明，腦死亡缺血缺氧狀態可導致劇烈的氧化應激反應。活化后的細胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α等多種炎性介質，參與機體的免疫應答[3]。2015年9月～2016年3月，我們檢測了豬腦死亡不同時點的血清IL-1β、Il-6及TNF-α，探討腦死亡過程中炎性介質變化與肝組織超微結構改變的關系。

1　材料與方法

1.1腦死亡模型的建立取巴馬小型豬6只，雌雄不限，8～12月齡，體質量(32±0.5)kg，由天津薊縣實驗動物基地提供。術前禁食24 h、禁水12 h，肌內注射氯胺酮10 mg/kg、安定0.4 mg/kg、阿托品0.03 mg/kg行基礎麻醉，取仰臥位固定。靜脈注射氯胺酮1 mg/kg、氯化琥珀膽堿注射液1 mg/kg，吸入2.5%～3.0%七氟烷維持全身麻醉；氣管內插管維持呼吸，頸總動、靜脈插管記錄動脈血壓、心率和中心靜脈壓，置入氣囊導尿管。參照Pratschke等[4]和Alonso等[5]的顱內漸進加壓方法并改進，建立腦死亡模型。腦死亡判定參照相關標準[6，7]，首次判定全部符合，觀察12 h無變化，方可判定為腦死亡，確認腦死亡后維持24 h。

1.2血清IL-1β、IL-6、TNF-α檢測分別于腦死亡前及腦死亡0、3、6、9 h取上腔靜脈血5 mL，靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，取上清-80 ℃保存。ELISA法檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α，試劑盒購自美國USCN公司，按說明書操作。

1.3肝組織超微結構觀察取血同時進行肝臟穿刺，獲得組織大小≥0.5 mm3，固定于2.5%戊二醛溶液，電鏡下行肝損傷評分。根據線粒體腫脹輕重分別計0、1分，外膜破裂輕重分別計1、2分；內質網擴張輕重分別計0、1分；纖維化輕、中、重分別計0、1、2分。

1.4統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料比較，采用單因素方差分析及LSD檢驗；計數資料比較采用秩和檢驗；相關關系采用Spearman相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1腦死亡前后豬血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平變化見表1。

2.2腦死亡前后電鏡下豬肝組織損傷評分比較腦死亡后9 h與腦死亡前及腦死亡后0 h肝組

表1　　　　腦死亡前后不同時點豬血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

注：與腦死亡前比較，*P<0.05。

織損傷評分有統計學差異(P=0.007、0.035)。見表2。

表2　　　　腦死亡前后不同時點電鏡下豬肝組織損傷評分結果(只)

2.3腦死亡豬血清IL-6水平與電鏡下肝組織損傷評分的關系Spearman相關分析顯示，腦死亡豬血清IL-6水平與電鏡下肝組織損傷評分呈正相關(r=0.702，P=0.000)。

3　討論

IL-1β主要由活化的單核巨噬細胞產生，在發熱、免疫應答、炎癥反應、傷口愈合以及刺激造血中起重要作用[8]。IL-6可由單核巨噬細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、角質細胞及T細胞產生，是機體免疫-神經-內分泌網絡調節的主要分子，在免疫及炎癥損傷中起重要作用。TNF-α可由多種細胞分泌，肝臟中的Kuppfer細胞是其主要來源，可通過誘導氧自由基產生及活化中性粒細胞、單核巨噬細胞等介導炎癥損傷[9]。本研究結果顯示，豬血清IL-6水平逐漸升高，到腦死亡后9 h與腦死亡前有顯著性差異；血清IL-1β和TNF-α水平在腦死亡前后稍有波動，但無顯著性差異。研究顯示[10,11]，在腦死亡狀態下機體血液循環中IL-6水平顯著升高。其原因可能是IL-6對于腦死亡狀態下的交感神經異常及缺血缺氧應激反應較IL-1β和TNF-α更敏感，有待進一步驗證。

電鏡下觀察腦死亡豬肝組織超微結構改變包括線粒體腫脹、外膜破裂，內質網擴張，細胞外基質膠原蛋白增多[12]。其中，線粒體腫脹是可以恢復的，但是，如果線粒體腫脹到一定程度導致外膜破裂，為不可逆改變；在腦死亡狀態時肝臟細胞間基質膠原蛋白可增加數倍，導致肝纖維化，該過程也為不可逆改變[13]。在本研究中，隨著腦死亡時間延長，實驗動物肝臟超微結構出現以上變化，在腦死亡后9 h最明顯。因此，我們初步認定在腦死亡后9 h豬肝臟細胞出現了不可逆的損傷。

綜上所述，在腦死亡早期過程中，豬血清IL-6水平隨時間延長不斷升高，并與肝組織超微結構改變具有良好的相關性，提示對腦死亡早期的肝臟炎癥損傷可能存在一定促進作用，但其機制有待進一步研究。

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天津市衛生行業重點攻關項目(13KG102)；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(15JCYBJC27000)。

唐纓(E-mail： doctortang2010@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.008

R446.11

A

1002-266X(2016)34-0023-02

2016-05-13)