AFAP-1L2在胰腺導管腺癌組織中的表達變化及意義

劉博，戚誠，趙曉東

(河北醫科大學第二醫院，石家莊 050000)

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AFAP-1L2在胰腺導管腺癌組織中的表達變化及意義

劉博，戚誠，趙曉東

(河北醫科大學第二醫院，石家莊 050000)

目的觀察胰腺導管腺癌(PDAC)組織中肌動蛋白絲相關蛋白1相似蛋白2(AFAP-1L2)的表達變化，并探討其臨床意義。方法 采用免疫組化SP法檢測73對配對的PDAC及癌旁正常胰腺組織石蠟標本中的AFAP-1L2蛋白，分析其與PDAC臨床病理特征的關系；采用qRT-PCR法檢測21對配對新鮮PDAC及癌旁正常胰腺組織中的AFAP-1L2 mRNA。結果 AFAP-1L2蛋白在PDAC及癌旁正常胰腺組織石蠟標本中的高表達率分別為67.1%及28.8%，P<0.01；AFAP-1L2蛋白高表達與腫瘤直徑、TNM分期、血管浸潤、淋巴轉移及術后肝轉移有關(P均<0.05)。新鮮PDAC組織及癌旁正常胰腺組織AFAP-1L2 mRNA相對表達量分別為1.429±0.317及0.672±0.298，P均<0.01。結論AFAP-1L2蛋白及基因在PDAC組織中高表達，在PDAC的發生發展中起重要作用。

胰腺導管腺癌；正常胰腺組織；肌動蛋白絲相關蛋白1相似蛋白2

胰腺癌的發病率呈現逐年上升及年輕化趨勢，在中國所有惡性腫瘤中發病率位居第8位[1]，是預后最差的惡性腫瘤之一，5年生存率在5%以下。由于惡性腫瘤的發生及發展是多步驟、多階段、多因素及多基因的過程，尋找靶蛋白并觀察其對腫瘤生物學行為的影響是目前研究的方向[2]。肌動蛋白絲相關蛋白1相似蛋白2(AFAP-1L2)是一種接頭蛋白,有研究顯示其在甲狀腺癌、胃癌、肺癌等惡性腫瘤中表達升高，與這些腫瘤的惡性行為具有一定的相關性[3]。本研究通過檢測胰腺導管腺癌(PDAC)組織中AFAP-1L2在蛋白及基因水平的表達變化，旨在觀察其與PDAC臨床病理特征的關系，并探討其在PDAC發生發展中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標本收集河北醫科大學第二醫院2010年1月～2013年1月手術切除的原發性PDAC標本73例及配對的癌旁正常胰腺組織標本73例，均具有完整臨床資料。其中，21例PDAC及配對癌旁正常胰腺組織標本，在手術切除標本后立即切取，置于液氮中進行冷凍保存，用于AFAP-1L2 mRNA檢測。73例患者中，男42例、女31例，年齡(57.9±16.4)歲,術后病理檢查均為PDAC。病理分級低分化17例、中分化39例、高分化17例，TNM分期Ⅰ期11例、Ⅱ期41例、Ⅲ期12例、Ⅳ期9例。

1.1.2主要試劑AFAP-1L2山羊抗人多克隆抗體(sc-138089)購自美國 Santa Cruz 公司，SP法免疫組織化學試劑盒購自上海碧云天生物公司，DAB顯色試劑盒購自大連寶生物公司；TRIzol、逆轉錄及擴增試劑盒購自日本Takara公司。

1.2檢測方法

1.2.1AFAP-1L2蛋白檢測方法采用免疫組化SP法。所有組織標本經4%甲醛固定,石蠟包埋后4 μm厚度連續切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后3%過氧化氫室溫下放置15 min。PBS清洗后檸檬酸緩沖液熱抗原修復2 min，室溫冷卻后PBS清洗。加一抗(1∶400)，4 ℃孵育過夜。室溫放置30 min后，PBS清洗后加入二抗，37 ℃孵育10 min。PBS清洗后加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，37 ℃下孵育10 min。順序進行DAB顯色、蘇木素復染、鹽酸乙醇分化、常規脫水、透明、封片。免疫組化結果由2名專業臨床病理醫師判定，以胞質黃色至棕褐色染色判斷為AFAP-1L2蛋白陽性細胞，根據陽性細胞在全部細胞中所占比例以及陽性細胞染色強度判定檢測結果。陽性細胞比例<1/3為1分，1/3～2/3為2分，﹥2/3為3分。無陽性細胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項得分相乘， ≤3判為低表達，>3判為高表達。

1.2.2AFAP-1L2 mRNA檢測方法采用實時定量PCR(qRT-PCR)法。液氮保存下的新鮮癌及癌旁正常組織稱取100 mg,液氮物理研磨，采用TRIzol試劑提取并純化總RNA。所有RNA樣本濃度稀釋至1 g/L，根據逆轉錄及擴增試劑盒說明書進行逆轉錄及擴增。RT-PCR反應體系(25.0 μL):Syber Green 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL， Primer F 1.0 μL，Primer R 1.0 μL，cDNA 2.0 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。AFAP-1L2和GAPDH引物均由大連寶生物有限公司設計并合成。AFAP-1L2上游引物5′-CCCGGAGAACCGCATCGGTCG-3′，下游引物5′-CAGGCCCAGGTGCAGCACG -3′，擴增產物146 bp；GAPDH上游引物5′-CCTGGCAACTTCCAACGCACCCGGC-3′,下游引物5′-CGGAACCTAGGTCAGTCCACTCGCC-3′，擴增產物421 bp。采用AFAP-1L2與GAPDH吸光度比值表示AFAP-1L2 mRNA相對表達量。

2　結果

2.1PDAC和癌旁正常胰腺組織中AFAP-1L2蛋白表達比較AFAP-1L2蛋白在PDAC及癌旁正常胰腺組織中高表達率分別為67.1%(49/73)及28.8%(21/73)，兩者AFAP-1L2高表達率比較有統計學差異(t=5.725,P<0.01)。

2.2AFAP-1L2蛋白表達與PDAC臨床病理特征的關系 AFAP-1L2蛋白表達與PDAC患者年齡、性別及腫瘤位置、病理分級、神經浸潤均無關(P均>0.05)。AFAP-1L2蛋白表達水平與PDAC患者腫瘤直徑、TNM分期、血管浸潤、淋巴轉移及術后肝轉移有關(P均<0.05)。見表1。

2.3PDAC和癌旁正常胰腺組織中的AFAP-1L2 mRNA表達比較 在21對PDAC和癌旁正常胰腺組織中AFAP-1L2 mRNA相對表達量分別為1.429±0.317及0.672±0.298，二者之間比較具有統計學差異(t=4.933，P<0.01)。

3　討論

由于胰腺癌發現較晚，因此以根治為目的的手術并不能顯著提高患者的3年及5年生存率[5]。對胰腺癌發生、發展過程中起到主導作用的基因靶點的研究一直是主要方向，目的在于提高早期診斷率，對預后進行評估，作為靶向治療的靶點，提高患者的生存率[6]。肌動蛋白絲相關蛋白(AFAP)是一類小型接頭蛋白家族,在克隆人類AFAP過程中AFAP-1L2被發現，其結構與AFAP相似，是一種新型的接頭蛋白，也被稱為XB130[7]。AFAP-1L2定位于細胞質內，在甲狀腺、脾臟及肺等正常人組織器官內有表達。有研究認為，AFAP-1L2在甲狀腺癌、食管癌及胃癌等惡性腫瘤中具有促進腫瘤生長及轉移等作用[8～10]。

表1　AFAP-1L2表達與PDAC臨床病理特征的關系

注：a為χ2檢驗；b 為Fisher′s概率檢驗。

本研究顯示，AFAP-1L2在PDAC腫瘤組織中表達水平明顯高于癌旁正常胰腺組織，表明其可能與胰腺癌的發生及發展相關。Zhang等[11]發現，AFAP-1L2在正常胰腺組織中無表達。本研究結果顯示，在癌旁胰腺組織中AFAP-1L2為低表達或無表達，說明在胰腺癌從正常組織到惡變階段中AFAP-1L2可能參與了整個過程，在胰腺癌轉移及浸潤等惡性行為發生之前，AFAP-1L2表達水平即已上調。AFAP-1L2蛋白表達與PDAC腫瘤直徑、TNM分期、血管浸潤、淋巴結轉移及術后肝轉移有關，表明AFAP-1L2高表達會導致胰腺癌惡性行為增強。AFAP-1L2參與信號傳導，對細胞黏附活性具有激活作用，從而促進惡性腫瘤細胞從原發灶脫落、移動、浸潤血管基底膜，黏附于遠隔組織形成轉移病灶[12]。Yamanaka等[13]研究發現，AFAP-1L2在甲狀腺細胞中激活PI3K信號通路，促進細胞的分化與增殖等功能；而PI3K在胰腺癌中作為促癌基因如被AFAP-1L2激活，可能促進胰腺癌細胞的增殖活性，導致其惡性行為增強。Shiozaki等[14]也認為，AFAP-1L2對甲狀腺腫瘤細胞增殖及生長具有促進作用，在胰腺癌中可能具有相同或相似的促進機制。本研究qRT-PCR檢測顯示，AFAP-1L2 mRNA在PDAC組織中表達高于癌旁正常胰腺組織，進一步在基因水平證明AFAP-1L2在PDAC中表達上調，這種上調作用在分子生物學水平即已發生。Snyder等[15]研究認為，AFAP1家族對腫瘤細胞的侵襲性具有重要的調節作用。AFAP-1L2在多條信號通路中發揮重要作用，除了前述的PI3K通路外，還有Src信號通路；在轉錄水平，AFAP-1L2通過調控SRE的表達激活Src通路，影響腫瘤細胞的惡性行為[16，17]。

綜上所述，AFAP-1L2在PDAC組織中表達上調，與胰腺癌的惡性行為具有相關性，可以用來預測胰腺癌的不良預后。我們將在進一步研究中檢測其對胰腺癌細胞功能的影響，并探討AFAP-1L2作為胰腺癌治療靶基因的可能性。

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河北省醫學科學研究重點課題計劃(20160540)。

趙曉東(E-mail： larrygh@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.017

R735.3

B

1002-266X(2016)34-0045-03

2016-03-27)