龍井43號(hào)多酚氧化酶同工酶酶學(xué)性質(zhì)研究

張書芹　許雷　陳盛虎　徐小云　黃瑩婕　姚燕妮　黃友誼

摘要：以龍井43號(hào)[Camellia sinensis （L.） O. Ktze. cv. Longjing 43]鮮葉為材料，經(jīng)分離純化獲得多酚氧化酶-同工酶（PPO II），對(duì)其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，PPO II最適反應(yīng)pH為6.0；抑制劑抗壞血酸、亞硫酸鈉和L-半胱氨酸對(duì)PPO II的抑制作用隨抑制劑濃度的增加而增強(qiáng)；Cu2+濃度在0.25×10-7 mol/L時(shí)，PPO II活性最高；PPO II的Km為13.05 mmol/L，vmax為0.019 OD460/min。

關(guān)鍵詞：龍井43號(hào)[Camellia sinensis （L.） O. Ktze. cv. Longjing 43]；多酚氧化酶；同工酶；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）06-1487-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.031

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO，EC 1.10.3.1）是茶樹生理學(xué)與茶葉產(chǎn)品加工工藝學(xué)中極為重要的生物酶之一，因此一直是人們的研究熱點(diǎn)[1-3]。當(dāng)前對(duì)茶樹PPO的研究已進(jìn)入分子水平[4-8]，國外已有對(duì)茶樹PPO同工酶進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究的報(bào)道[9-14]。然而，國內(nèi)對(duì)茶樹PPO性質(zhì)的研究一直停留在粗酶的水平[15，16]，除對(duì)同工酶譜變化有研究外[17-19]，還未見任何分離純化出同工酶及對(duì)同工酶性質(zhì)進(jìn)行研究的報(bào)道[20]。為此試驗(yàn)以適制綠茶的龍井43號(hào)茶樹[Camellia sinensis（L.） O. Ktze. cv. Longjing 43]為材料，分離純化出一個(gè)PPO同工酶，并對(duì)其部分酶性質(zhì)進(jìn)行了探討，以期推動(dòng)對(duì)茶樹PPO的研究與利用[1，21]。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹鮮葉采摘于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)專業(yè)教學(xué)基地中龍井43號(hào)茶樹，鮮葉規(guī)格為1芽2葉，采摘時(shí)間為春季，采下后迅速于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存，備用。試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 PPO同工酶分離 取龍井43號(hào)1芽2葉20 g，用0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液4 ℃浸提12 h，然后4 ℃、9 000 r/min離心30 min，取上清液，濾紙過濾后即為粗酶液。將粗酶液用30 %～80 %硫酸銨沉淀，9 000 r/min離心30 min，棄上清液；用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，3 500 r/min離心30 min，脫鹽3～4次；以上操作均在4 ℃條件下完成。將離子交換劑材料DEAE-Sepharose CL-6B用0.02 mol/L、pH 7.2磷酸鹽緩沖液（4倍體積）進(jìn)行預(yù)平衡，將樣品加入預(yù)平衡柱。加樣完成后，使之與柱材料結(jié)合20 min，然后分別用含0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mol/L 的NaCl 0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液作為洗脫液，每個(gè)濃度梯度洗脫液為3～4倍柱體積，流速60 mL/h。收集峰值洗脫液于超濾離心管中，4 ℃、3 500 r/min離心，脫鹽，濃縮至500 μL左右。各峰值洗脫液分別加入預(yù)平衡（用含有0.1 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行預(yù)平衡）Sephadex G-150凝膠柱中，用相同的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集各峰值處洗脫液于超濾離心管中，4 ℃、3 500 r/min離心，脫鹽、濃縮至約250 μL左右，4 ℃保存，備用。

1.2.2 抑制劑對(duì)PPO同工酶活性的影響 取10 μL酶液，以鄰苯二酚為底物，分別加入終濃度為0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300 mmol/L的抑制劑反應(yīng)混合液75 μL，按文獻(xiàn)[22]、[7]的酶活性測(cè)定方法，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，加入50 μL 6 mol/L的尿素終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀460 nm處測(cè)其殘留酶活性，結(jié)果以殘留酶活性與未加抑制劑的酶活性相比的百分?jǐn)?shù)表示。抑制劑分別為亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸。

1.2.3 pH對(duì)PPO同工酶活性的影響 配制pH分別為5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液，分別取上述緩沖液4 mL和鄰苯二酚1 mL配制反應(yīng)混合液，在10 μL酶液中加入75 μL的反應(yīng)混合液，于37 ℃條件下反應(yīng)30 min，然后加入50 μL 6 mol/L的尿素終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀460 nm處測(cè)其活性。

1.2.4 底物濃度對(duì)PPO同工酶活性的影響 以不同濃度的鄰苯二酚為底物，在10 μL酶液中加入75 μL終濃度分別為5、10、15、20、25、30 mmol/L的鄰苯二酚反應(yīng)混合液，按文獻(xiàn)[22]、[7]的酶活性測(cè)定方法，在其最適pH的緩沖液中，于37 ℃條件下反應(yīng)30 min，加入50 μL 6 mol/L的尿素終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀460 nm處測(cè)定PPO的活性。用雙倒數(shù)曲線來求取Km值和最大反應(yīng)速率vmax。

1.2.5 銅離子對(duì)PPO同工酶活性的影響 取10 μL酶液，加75 μL終濃度分別為 0、0.25×10-7、0.50×10-7、1.00×10-7、2.00×10-7、3.00×10-7 mol/L的Cu2+反應(yīng)混合液，按文獻(xiàn)[22]、[7]的酶活性測(cè)定方法，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，加入50 μL 6 mol/L的尿素終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀460 nm處測(cè)其活性。

1.3 蛋白電泳方法

1.3.1 非變性蛋白電泳方法 PPO同工酶采用非變性凝膠不連續(xù)垂直板電泳（Native-PAGE）法，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為7.5%，每孔上樣量為20 μL。預(yù)電壓為穩(wěn)壓50 V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至穩(wěn)壓110 V，冰浴條件下進(jìn)行電泳。結(jié)束電泳后，將凝膠置于染液（60 mL 1%鄰苯二酚，20 mL 0.6 g/L對(duì)苯二胺，20 mL pH 7.2的 0.05 mol/L磷酸緩沖液）中 ，室溫染色30 min后，蛋白膠用去離子水沖洗、浸泡至PPO同工酶帶清晰為止。

1.3.2 變性蛋白電泳方法 PPO蛋白純度采用變性凝膠不連續(xù)垂直板電泳（（SDS-PAGE）法，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%，每孔上樣量為20 μL。開始電壓為60 V，在溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)到120 V。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距分離膠底面1 cm左右時(shí)結(jié)束電泳，然后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色處理。

1.4 PPO同工酶活性測(cè)定方法

根據(jù)文獻(xiàn)[22]、[7]的酶活性測(cè)定方法，經(jīng)過改進(jìn)進(jìn)行PPO活性測(cè)定。具體步驟如下：用移液槍取10 μL PPO酶液加入酶標(biāo)板，再加入0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液50 μL和75 μL反應(yīng)混合液，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，即刻加入50 μL的6 mol/L尿素溶液終止反應(yīng)，然后利用酶標(biāo)儀在460 nm波長處測(cè)其吸光值，對(duì)照組選用煮沸5～10 min的PPO酶液來代替待測(cè)的樣品。反應(yīng)混合液配制方法按0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液∶0.1%脯氨酸∶1%鄰苯二酚=10∶2∶3的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。在試驗(yàn)測(cè)定條件下，將以鄰苯二酚為底物的反應(yīng)液吸光值每分鐘增加0.001定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.5 蛋白濃度測(cè)定

用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定PPO蛋白濃度，采用蛋白定量試劑盒測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003軟件處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹PPO同工酶純化

茶樹PPO經(jīng)過硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠層析進(jìn)行純化后，得到一個(gè)單一的同工酶，具體見表1。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，結(jié)果見圖1。從圖1-A可見，該同工酶為單一譜帶，可達(dá)到電泳的純度，PPO單鏈的分子量大小約為53 ku。經(jīng)Native-PAGE電泳，結(jié)果見圖1-B，圖1-B顯示有2條同工酶譜帶。依據(jù)該同工酶在離子交換柱層析中洗脫的順序，將其命名為PPO II。經(jīng)檢測(cè)，PPO II的比活力為2 325.39 U/mg，純化倍數(shù)約為1.36倍，活性得率為0.07%。

2.2 抑制劑對(duì)PPO II活性的影響

試驗(yàn)分析了亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸 3種抑制劑對(duì)龍井43號(hào)茶樹PPO II活性的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可見，抗壞血酸、亞硫酸鈉和L-半胱氨酸均對(duì)PPO II活性有抑制作用，并且隨著抑制劑濃度的增加而增強(qiáng)。3種抑制劑對(duì)PPO II抑制效果的變化類似；在終濃度0.1 mmol/L之前，3種抑制劑隨濃度的增加，對(duì)PPO II活性的抑制效果呈線性增強(qiáng)；至0.1 mmol/L濃度時(shí)，3種抑制劑抑制了PPO II 65%以上的酶活性；超過0.1 mmol/L濃度后，3種抑制劑抑制PPO II活性的降低程度趨于平緩。在3種抑制劑中，以抗壞血酸的抑制作用略強(qiáng)，其次為L-半胱氨酸，亞硫酸鈉最弱；當(dāng)抗壞血酸濃度為0.3 mmol/L時(shí)，PPOII殘留的酶活性僅為6.98%。

2.3 pH對(duì)PPO II活性的影響

試驗(yàn)分析了不同pH對(duì)龍井43號(hào)茶樹PPO II活性的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可知，PPO II呈現(xiàn)兩個(gè)活性峰，一個(gè)是在pH 6.0，一個(gè)是pH 7.6。但以pH 6.0的PPO II活性更高，約為pH 7.6處的2倍，由此可見PPO II的最適反應(yīng)pH為6.0。

2.4 底物濃度對(duì)PPO II活性的影響

試驗(yàn)還分析了不同鄰苯二酚濃度對(duì)PPO II活性的影響，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，隨著底物濃度的增加，在5～25 mmol/L范圍內(nèi)PPO II活性呈上升趨勢(shì)。但隨著底物濃度的進(jìn)一步增加，PPO II活性增加幅度逐漸趨于平緩，且在底物濃度為25 mmol/L時(shí)酶活性達(dá)到最大。根據(jù)Lineweaver-Burk方程，得出PPO II的Km為13.05 mmol/L，最大反應(yīng)速率vmax為0.019 OD460/min。

2.5 銅離子對(duì)PPO II活性的影響

試驗(yàn)分析了添加不同濃度的Cu2+對(duì)龍井43號(hào)茶樹PPO II活性的影響，結(jié)果見圖5。從圖5可知，Cu2+濃度對(duì)PPO II活性呈先促進(jìn)后抑制的作用。隨著Cu2+濃度的增加，PPO II活性升高；當(dāng)Cu2+濃度為0.25×10-7 mol/L時(shí)出現(xiàn)一個(gè)活性峰，隨后活性隨Cu2+濃度的增加而降低。當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到2×10-7 mol/L時(shí)，PPO II活性消失，說明同工酶在此Cu2+濃度時(shí)完全受到了抑制。

3 討論

3.1 PPO II的肽鏈組成形式

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物和微生物中的PPO同工酶絕大多數(shù)是同源二聚體，僅少數(shù)是單體或其他組成形式[22]。現(xiàn)在一般也認(rèn)為茶樹PPO同工酶也是同源二聚體，但也有報(bào)道在同一茶樹中的PPO同工酶存在單體、二聚體、三聚體等多種形式[10，11]；本試驗(yàn)中暫未對(duì)PPO II的肽鏈構(gòu)成進(jìn)行分析。然而在對(duì)經(jīng)過分子篩后的PPO II進(jìn)行Native-PAGE電泳染色時(shí)，顯示出有2條活性帶，似表明有2個(gè)同工酶。但是試驗(yàn)在離子交換后的PPO II分離液進(jìn)行非變性膠顯色時(shí)，僅有一條活性帶，變性膠顯示也僅一條帶。這表明茶樹PPO II在分離純化后的保存過程中，酶蛋白相互之間可能會(huì)產(chǎn)生一種聚合，但酶活性依然可以保留，這還有待于后續(xù)進(jìn)行PPO II全酶分子量的測(cè)定以及分子組成形式分析來驗(yàn)證。

3.2 PPO II的最適反應(yīng)pH

已有報(bào)道證明茶樹PPO混合酶的最適反應(yīng)pH為5.6[15，20]，但茶樹體內(nèi)也有單一PPO同工酶的最適反應(yīng)pH為5.6左右的報(bào)道[10]，更有人發(fā)現(xiàn)茶樹PPO混合酶的最適反應(yīng)pH不在5.6，而是在8.6左右[16，23]。本試驗(yàn)中龍井43號(hào)茶樹PPO II的最適反應(yīng)pH為6.0，除此之外在pH 7.6時(shí)會(huì)產(chǎn)生另一個(gè)活性峰值。而試驗(yàn)在以不同pH的緩沖液進(jìn)行龍井43茶樹PPO蛋白粗提過程中，發(fā)現(xiàn)在酸性和堿性條件下均會(huì)產(chǎn)生一個(gè)酶活性峰值，但以酸性條件下的峰值更高。令人感興趣的是在酸、堿兩種完全不同的條件下，茶樹PPO催化的機(jī)理是否完全一致、催化產(chǎn)物方面是否會(huì)有所不同還有待于后續(xù)試驗(yàn)來比較。

3.3 銅離子對(duì)PPO II的作用

銅離子是植物PPO催化活性中心的必需因子，已有研究證實(shí)銅離子是茶樹PPO的重要組成部分[11，22]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Cu2+濃度在0.25×10-7 mol/L時(shí)酶活性最高，證實(shí)Cu2+可以提高PPO II的活性。而在基因表達(dá)的茶樹PPO蛋白試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Cu2+濃度在1.0×10-7 mol/L時(shí)PPO活性最高[5]。這表明Cu2+應(yīng)該是茶樹PPO催化所需的因子。

由于試驗(yàn)僅對(duì)分離純化獲得的一個(gè)龍井43號(hào)茶樹PPO同工酶進(jìn)行了部分酶學(xué)性質(zhì)研究，局限性不言而喻，還有很多酶學(xué)性質(zhì)方面的問題有待于后續(xù)深入進(jìn)行研究來解決。

參考文獻(xiàn)：

[1] 葉 飛，高士偉，龔自明.砂梨多酚氧化酶處理對(duì)夏秋紅茶品質(zhì)的影響[J].食品科學(xué)，2013，34（23）：92-95.

[2] ALTUNKAYA A. Partial purification and characterization of polyphenoloxidase from turkish tea leaf （Camellia sinensis L）[J].International Journal of Food Properties，2014，17（7）： 1490-1497.

[3] 趙振軍，郭胡津，黎星輝.鮮茶汁貯藏過程中多酚氧化酶活性分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，41（1）：90-92，95.

[4] 黃建安，黃意歡，李家賢，等.茶樹多酚氧化酶基因的PCR-RFLP多態(tài)性分析[J].茶葉科學(xué)，2008，28（5）：370-378.

[5] LIU J W，HUANG Y Y，DING J，et al. Prokaryotic expression and purification of Camellia sinensis polyphenol oxidase[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2010，90（14）： 2490-2494.

[6] WU Y L，PAN L P，YU S L， et al. Cloning， microbial expression and structure-activity relationship of polyphenol oxidases from Camellia sinensis[J]. Journal of Biotechnology，2010，145（1）： 66-72.

[7] 劉敬衛(wèi)，黃友誼，丁 建，等.茶樹多酚氧化酶成熟蛋白的原核表達(dá)[J].茶葉科學(xué)，2010，30（2）：136-140.

[8] 王乃棟，張麗霞，向勤锃，等.茶樹多酚氧化酶基因的生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)[J].茶葉科學(xué)，2011，31（1）：33-39.

[9] TAKEO T，BAKER J E. Changes in mulitiple forms of polyphenol oxidase during maturation of tea leaves[J]. Phytochemistry， 1973，12（1）：21-24.

[10] BUZUN G A，DZHEMUKHADZE K M，MILESHKO L F. Some properties of tea polyphenol oxidase[J]. Biokhimiia （Moscow Russia），1970，35（5）：1002-1006.

[11] TAKEO T，URITANI I. Tea leaf polyphenol oxidase Part II. purification and properties of the solubilized polyphenol oxidase in tea leaves[J]. Agricultural and Biological Chemistry， 1966，30（2）：155-163.

[12] PRUIDZE G N，MCHEDLISHVILI N I，OMIADZE N T，et al. Multiple forms of phenol oxidase from Kolkhida tea leaves （Camelia sinensis L.） and Mycelia sterilia IBR 35219/2 and their role in tea production[J]. Food Research International， 2003，36（6）：587-595.

[13] RAJANNA L， RAMAKRISHNAN M. Isozyme studies on some selected Camellia clones[J].International Journal of Engineering Science and Technology，2010，2（12）：6918-6921.

[14] ？譈MIT ？譈 M，SELIN N，YABACI M，et al. Exraction，partial purification and characterisation of polyphenol oxidase from tea leaf （Camellia sinensis）[J].GIDA，2011，36（3）：137-144.

[15] 趙淑娟，王坤波，傅冬和，等.茶多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，34（1）：84-86.

[16] 孫慕芳，張 潔，郭桂義.白毫早鮮葉茶多酚氧化酶酶學(xué)特性[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：140-143.

[17] 劉仲華，施兆鵬.紅茶制造中多酚氧化酶同工酶譜與活性的變化[J].茶葉科學(xué)，1989（2）：141-150.

[18] 唐 茜.蜀永系列茶樹品種多酚氧化酶的等電聚焦研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997（2）：14-17.

[19] 黃福平，梁月榮，陳榮冰，等.做青強(qiáng)度對(duì)做青葉蛋白質(zhì)組成、多酚氧化酶和酯酶同工酶譜的影響[J].茶葉科學(xué)，2004，24（1）：70-74.

[20] 滕 杰，豐金玉，熊 碩，等.茶葉多酚氧化酶及其同工酶的研究進(jìn)展[J].茶葉通訊，2014，41（2）：10-13.

[21] 王坤波，劉仲華，趙淑娟，等.梨多酚氧化酶同工酶組成及其對(duì)茶黃素合成的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，33（4）：459-462.

[22] 黃意歡.茶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.

[22] 雷東鋒，馮 怡，蔣大宗.植物中多酚氧化酶的特征[J].自然科學(xué)進(jìn)展，2004，14（6）：606-613.

[23] 王麗霞，陸 蒸，林啟訓(xùn)，等.福云6號(hào)茶葉茶多酚氧化酶特性的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（1）：213-215.