子宮內膜異位癥動物模型研究進展

金濟云 夏親華

[摘要] 本文對子宮內膜異癥（EMs）動物模型的構建方法及優缺點綜合闡述，希望建立合適的動物模型，加深EMs病因學、治療學的研究，以深入了解EMs發病機制，開發治療新藥，探索中藥作用機制，實現多方面、多角度的中西醫結合治療，全面提高中西醫結合治療EMs的水平。

[關鍵詞] 子宮內膜異位癥；動物模型；免疫機制；研究進展

[中圖分類號] R711.71 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（b）-0028-04

Research progress of endometriosis animal models

JIN Jiyun1 XIA Qinhua2

1.The First School of Clinical Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China； 2.Department of Gynaecology， Jiangsu Provincial Hospital of TCM， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China

[Abstract] This paper makes a summarization for the construction method and advantages and disadvantages of endometriosis （EMs） animal models， try to establish more appropriate animal models for the study of etiology and treatment on Ems， so as to deeply know about the pathogenesis of Ems， exploit new drugs， explore mechanism of traditional Chinese medicine， realize combined treatment of traditional Chinese medicine and Western medicine from many aspects and angles， improve the level of combined treatment of traditional Chinese medicine and Western medicine for EMs comprehensively.

[Key words] Endometriosis； Animal models； Immune mechanism； Research progress

子宮內膜異位癥（EMs）是指有活性的子宮內膜在被覆內膜的宮腔和子宮以外的部位生長、浸潤，從而引發疼痛、結節、月經紊亂以及不孕等癥的疾病。EMs的病變范圍較廣，形態多樣，有較強的侵襲性和復發性，且有1%的惡變率[1]。但自1860年首次報道EMs以來，我們對其發病機制了解有限，且目前的治療策略不能徹底治愈EMs，臨床上復發及患者難以忍受的不良反應頻見。因此，建立動物模型對EMs的研究至關重要。本文希望通過對造模方法優缺點的探討，總結近年來EMs模型建立的經驗教訓，建立更為仿真的EMs動物模型。

1 動物模型的選擇

EMs動物模型的制作主要基于Sampson的“經血逆流種植學說”[2]，現造模方法有自發、種植、誘發三種主要模式。

1.1 自發性

見于人或靈長動物，其病理學特征及病機和人類最為相似，但發生率低，周期長，短期內無法獲得足夠的信息，且價格昂貴，限制了其在科研中的應用。

1.2 種植性（異體移植）

多見于重癥聯合免疫缺陷（SCID）小鼠或裸小鼠，有同種異體和異種異體之分，均有創傷小、易操作、成活率高等優點。但是實驗動物均為免疫缺陷動物，無法用于EMs免疫學機制及免疫治療方面的研究。

1.3 誘發性（自體移植）

造模對象較廣，如猴、兔、大鼠等。將其自體內膜通過手術種植到宮腔外，或閉鎖其宮頸，使經血逆流而誘發。此法避免了排斥反應，但自體手術移植損傷大且死亡率高。

總之，目前造模方法各有利弊，選擇條件以實驗的目的和可行性而異，權衡各種模型的利弊，充分發揮不同動物模型的長處。相較而言，異體移植有較明顯的優勢。人內膜組織異體移植，使其生理病理改變更接近人體，但是有倫理學問題存在。同種異體研究成果是否可以完全適用于人體有待商榷。此外，免疫功能的缺乏限制了EMs免疫機制的研究，如何重建裸鼠免疫功能值得探索。

2 造模取材對模型的影響

2.1 關于取膜的生理期

有學者認為內膜處于增生狀態更易種植，也有學者認為分泌期、分泌晚期甚至月經期能更好地模擬經血逆流種植學說，且成模率更高。而Nisolle等[3]發現所有移植物均有類似增殖期變化的形態學表現，認為不同的取膜時期對裸鼠模型的構建并沒有影響。許艷麗等[4]分別觀察了增殖期及分泌期內膜間質細胞培養的成功率，發現移植細胞成活率與月經周期沒有必然聯系。

2.2 關于取膜部位

根據“在位內膜決定論”以及許多學者在構建Ems裸鼠模型過程中的發現[5]，認為在位內膜比正常內膜更具有侵襲性，其生長率高于正常內膜。朱啟江[6]的試驗中各組織生長率：正常子宮內膜60%；腺肌癥在位內膜85.71%；卵巢巧囊內壁100%。Banu等[7]成功將混合的人異位內膜上皮和間質細胞接種于裸鼠腹腔形成異位病灶，發現其與EMs患者異位病灶在分子與細胞學方面相似，可以用來研究在位內膜本身固有的、潛在的侵襲能力。Van Langendonckt等[8]以近100%的成功率將人異位組織注入裸鼠腹腔，并可在體內存活10周之久。移植后組織保持了原有的特征和對激素的反應。據此可以推斷：異位內膜的生長率更高，而且能更準確地再現EMs的特點，反映其發展變化。

3 觀察方法

既往所使用的有創性觀察方法，除了耗損動物外，無法明確區分病灶及周圍組織，且無法對同一病灶實時監測。實驗及臨床研究要求我們研發出EMs模型的活體無創觀察方法。目前主要分為兩類：一、利用影像學方法對病灶進行檢測；二、利用分子生物學技術標記病灶并進行觀察。

3.1 影像學方法

MRI利用建立的圖像獲得病灶信息，有效地減小了動物的應激反應，并可直接進行數據分析。此法可相對較早地觀測到異位病灶，但無法區分不典型EMs病灶，如粘連。超聲檢查也常在EMs動物模型研究中應用。此外，微型正電子體層掃描、微型單光子發射計算體層掃描、活體影像系統等分子顯像設備亦在動物模型中嘗試應用[9]。此種均有敏感、實時、無創的特點，便于臨床推廣，但其費用高昂，臨床應用并不廣泛。

3.2 熒光染色法

光學成像技術一般采用熒光染料法和熒光素酶生物發光，Defrère等[10]的實驗結果證實了經體外熒光量化觀測方案的可行性，該法實現了對異位病灶的連續性觀察，使EMs動態活體研究成為可能。熒光模型的優勢明顯：①主觀影響小，對病灶敏感，定位精確，在對表面不典型病灶的觀察上得到更好的體現；②病灶重量和熒光強度呈正相關；③不影響移植的內膜生物特性，且某些熒光表達不因時間延長而衰減。

近年標記方法不斷得到改進，根據其熒光產生機制和來源的不同分為[11]：①熒光染料直接標識內膜。②基因轉染：利用病毒載體（如慢病毒）將熒光蛋白基因或熒光素酶基因轉入內膜細胞，從而發出熒光。③熒光轉基因動物在體內膜移植。相較而言，前兩類可避免物種差異導致的結果偏差。然而，隨著熒光模型的不斷深入研究，如何提高標記蛋白的表達，提升轉染穿透力，觀測表達時間及組織特異性須深入探索。此外，檢測系統（三維成像系統和定量測定）也有待進一步完善。

4 機制與應用

根據2015年EMs最新診治指南，其治療方法可分為手術治療、藥物治療、介人治療、中藥治療及輔助治療（如輔助生殖技術治療）等。EMs首選手術治療，但復發率高，即便是根治性手術，也存在復發風險。藥物治療便是攻克EMs的研究重點。目前EMs的發病機制尚不明確，各種藥物都有不同程度的不良反應，且仍有較高的復發率。因此，了解EMs發病機制，開發新藥勢在必行。

EMs發病機制相關的學說有子宮內膜種植學說、在位內膜學說、體腔上皮化生學說、干細胞學說、遺傳學說、免疫學說等[12]。最先提出的是“經血逆流種植學說”，但近來流調顯示：育齡婦女多有經血逆流的現象，但只有小部分發展為EMs。因此，EMs的發生沒有得到完美的解釋。1980年Weed等[13]提出EMs和機體免疫相關，至今已有更多證據表明免疫及炎癥因素發揮重要作用[14-15]，因此，免疫調節治療EMs日益得到關注。但目前免疫調節治療的臨床研究還十分缺乏。臨床研究證實了己酮可可堿緩解盆腔疼痛、提高妊娠率的重要作用；抗TNF-α治療、增強NK細胞活性藥物以及中藥的免疫調節治療的效果及安全性有待更多臨床研究證實，此類藥物的不良反應有待探討，妊娠安全性也有待評估。近年來，干細胞起源學說備受關注，學者們通過實驗證明了內膜中干細胞的存在，認為干細胞脫落、增殖、分化是內異癥發生的重要原因[16]，這也為EMs機制研究及藥物治療提供了新的思路。

郎景和“在位內膜決定論”中提出：EMs發病的兩大基石——遺傳和免疫[17]。子宮內膜細胞的“類腫瘤”的生物學行為使其逃避機體免疫系統的識別與攻擊并繼續生長，啟發思考：內異癥作為一種“良性癌”是否存在與腫瘤細胞一樣的免疫逃逸機制？

許多學者研究發現許多腫瘤發生發展的調節信號通路也參與了對EMs惡性生物學行為的調控[18]，Foxp3、Fas及FasL蛋白等與免疫逃逸相關的因子在婦科疾病中存在異常表達。研究表明，抑制Foxp3表達可有效提高機體腫瘤免疫能力。國內外學者發現，異位癥的內膜組織不論在位還是異位，均有對抗Fas途徑介導凋亡的潛能[19]，這為研究EMs的發病機制和治療方法提供了更廣闊的思路：異位組織局部浸潤Foxp3是否能改善患者癥狀及預后？是否可以通過切斷相關負性信號調節通路，阻斷異位內膜的免疫逃逸而達到治療作用？

5 新型特殊模型的建立

5.1 人免疫功能重建EMs動物模型

EMs發病機制復雜，免疫機制已成為研究熱點。自體移植在組織學特性和生物反應上與人類存在一定的差異，而傳統異體移植使用免疫缺陷小鼠，限制了EMs免疫學機制的研究。20世紀末Somigliana等[20]成功建立了有免疫力小鼠的內異癥模型，雖發病機制與人類相近，但3次手術創傷，小鼠易死，難以觀察，且病灶小，測量誤差大。王群華等[21]率先建立了具有人免疫功能的鼠EMs模型。采用早孕人蛻膜和其臍血單個核細胞聯合移植，移植后仍保持原有組織形態，性狀穩定。建立EMs人源化裸鼠模型的同時，給予人源化EMs裸鼠同源的自體外周血來源的人免疫細胞，建立含有人免疫系統的人源化裸鼠EMs模型，有重要的臨床參考意義。

5.2 復發型EMs模型

研究顯示：EMs保守性手術后1、2、5年的累計復發率分別在10%、20%、50%左右[22]。至今復發仍是臨床亟需解決但又非常棘手的問題，所以建立EMs復發動物模型，探討EMs復發的機制是必要的。黃潔明等[23]通過手術切除原有異位病灶，建立復發型EMs大鼠模型。發現手術只是破壞或縮小了病灶，對局部雌激素的合成沒有干擾，其微環境依舊存在，殘留的內膜細胞仍具再生長的潛能，這也許是EMs術后高復發率的根本原因之一。同時，楊艷環等[24]通過實驗驗證復發模型建立的可行性。

5.3 中醫病證結合動物模型

中醫藥在治療EMs上有獨到之處，臨床應用取得了一定的經驗，中醫治療能明顯改善癥狀，增加受孕機會，減少復發，并且調節全身免疫功能[25-26]，且通過部分實驗證實了其具有確切的療效[27]。但作用機制處于探索階段，研究僅停留在對某些因子的影響上，缺乏更深層次的研究，未揭示其確切的治療機制，且臨床上中醫證型會隨時間推移呈現復雜的證型演變，在證候的標準化、規范化方面以及方藥與病證的相關性方面，仍然缺乏深入的基礎研究作為理論支撐。我們必須引入病證結合的動物模型，研究其宏觀表征、微觀指標以及與方藥的對應關系，使證候的研究向標準化、客觀化方向發展。

5.4 體外三維模型

體外三維模型最初運用于腫瘤學的研究，相較于傳統的二維模型，三維模型引入了細胞外基質，構建了多方位細胞生長的微環境，能更好地觀察細胞的侵襲性。Matthews等[28]經實驗證實異位內膜細胞經體外培養，維持了基本形態，且其生化活性與在位內膜相似。Tsuno等[29]建立的體外EMs基質細胞培養模型，為研究內膜細胞與基質細胞間的相互作用機制提供了更好的平臺。Mehasseb等[30]通過體外三維模型的建立，發現子宮肌層細胞影響著基質細胞浸潤的深度，提示EMs的發病與子宮肌層也許相關。建立EMs體外細胞模型有利于維持內膜細胞的生物學特性，更好地模擬致病的微環境，觀察細胞生長，探討比較腺上皮細胞及間質細胞不同特性及相互作用。此外，EMs體外細胞模型為觀察藥物療效、研究藥理提供了有效手段。但體外模型對于EMs遠處轉移特性的觀察存在局限性，如何提高模型穩定性、延長細胞生存時間也值得進一步探索。

6 小結

本文希望通過對建模方法的探討，逐步完善動物模型，使之更加貼合實驗及臨床研究的需要。希望以動物模型為平臺，深入了解EMs發病的免疫機制，了解腫瘤免疫逃逸相關因子如Foxp3、Fas-FasL通路等的作用，開發免疫治療新藥，探尋中藥免疫作用機制，實現多方面、多角度的中西醫結合治療，以期為EMs患者提供規范化、標準化的診治方案，全面提高中西醫結合治療EMs的水平。

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（收稿日期：2015-11-12 本文編輯：張瑜杰）