溫度、凍存液體積和操作時間對小鼠卵子Cryotop玻璃化凍融復蘇率的影響

饒金鵬　邱　楓　劉　青　蔡益婷　金　敏　金　帆

1.浙江大學醫學院附屬第二醫院生殖醫學中心，浙江杭州310052；2.浙江大學醫學院附屬婦產科醫院生殖醫學中心，浙江杭州310006

溫度、凍存液體積和操作時間對小鼠卵子Cryotop玻璃化凍融復蘇率的影響

饒金鵬1邱楓1劉青1蔡益婷1金敏1金帆2

1.浙江大學醫學院附屬第二醫院生殖醫學中心，浙江杭州310052；2.浙江大學醫學院附屬婦產科醫院生殖醫學中心，浙江杭州310006

目的探討Cryotop法中冷凍操作環境溫度、加載覆蓋的保護液微滴體積以及投入液氮前暴露于高濃度冷凍保護劑（CPA）的時間對小鼠MⅡ期卵子玻璃化凍融效果的影響。方法對6周齡KM系小鼠促排卵、脫顆粒細胞以獲得形態良好的MⅡ期卵子，用Cryotop法對其進行玻璃化凍融，卵母細胞隨機分組后實驗方案如下：根據冷凍環境溫度的不同，設置37℃操作組和22℃操作組；根據薄膜上包被的保護液微滴體積的不同，設置<0.1 μL組、0.1～0.5 μL組和>0.5～1.0 μL組；根據與CPA的接觸時間的不同，將冷凍卵子分為30～40 s暴露組、>40～90 s暴露組和>90～180 s暴露組。隨后對各組卵母細胞的復蘇率進行統計比較。結果22℃操作組小鼠卵子的復蘇率為81.4%，顯著高于37℃操作組的50.7%，差異有高度統計學意義（P<0.01）。選擇22℃的操作環境，<0.1 μL組、0.1～0.5 μL組、>0.5～1.0 μL組復蘇率（85.7%、90.5%、83.2%）比較，差異無統計學意義（P>0.05）。>90～180 s CPA暴露組的卵子復蘇率為74.7%，低于30～40 s暴露組（83.3%）和>40～90 s暴露組（78.9%），差異無統計學意義（P> 0.05）。結論使用Cryotop法凍融卵母細胞時，不必刻意追求<0.1 μL的保護液加載體積。卵子在高濃度CPA中的暴露時間不宜過長，且控制在30～90 s內對其存活率無明顯影響。在常溫（22℃）環境下進行操作可改善復蘇結局。

玻璃化冷凍；小鼠；卵母細胞；溫度；體積；處理時間；復蘇率

［Abstract］Objective To evaluate the effects of the temperature，volume and treatment duration of loading CPA solution on the survival rate of oocytes vitrification.Methods Oocytes were obtained from the female KM mice aged six weeks after superovulation.Matured oocytes at MⅡstage were frozen with Cryotop vitrification method at the environmental temperature of 37℃or 22℃，microdrop volume of<0.1，0.1-0.5，>0.5-1.0 μL，and time of oocyte treated in CPA solution of 30-40，>40-90，>90-180 s.The survival rates of warmed oocytes in the different treatments were compared. Results The oocyte survival rate at 22℃of environmental temperature was 81.4%which was significantly higher than that at 37℃（50.7%）（P<0.01）.At the temperature of 22℃，the volume changes of loading microdrops of CPA solution did not influence the survival rate significantly（85.7%，90.5%and 83.2%in<0.1，0.1-0.5 and>0.5-1.0 μL，respectively（P>0.05）.The survival rate seemed to be decreased with the increased treatment duration of oocyte in CPA solution（74.7%in>90-180 s，78.9%in>40-90 s and 83.3%in 30-40 s），but the differences did not reach to statistical significance（P>0.05）.ConclusionItwouldnotbenecessarytominimizetheCPAsolutiondrop'svolumeto lessthan 0.1 μL. Treatment duration of oocyte in CPA should not be too long，and inside 30～90 s has no significant effect on its survival.Controlling environmental temperature under 22℃can improve the survival rate of oocyte vitrification.

［Key words］Vitrification freeze；Mouse；Oocyte；Temperature；Volume；Treatment duration；Survival rate

人類卵子冷凍為需接受放化療的腫瘤患者的生育能力保存，以及卵巢衰竭女性的卵源提供開辟了新的途徑［1］，并可避免胚胎操作凍存引起的倫理和法律糾紛，在人類輔助生殖領域具有廣闊的應用前景［2］。但卵母細胞體積大、細胞內水分含量高、含有紡錘體等特殊結構，故其對冷凍過程極為敏感，較胚胎冷凍更困難［3］，凍融復蘇成功率也曾因此長期低下。傳統的慢速冷凍可導致維持染色體結構的基因下調。mRNA保存率低［4-5］，而玻璃化冷凍技術對細胞內的水分擾動極?。?］，較之能更好地防止細胞內冰晶形成［7-9］，使卵子凍融復蘇得以顯著改善，已成為目前卵子凍存最主要的方法。目前常用的卵子玻璃化冷凍技術有彈射法、開放式拉伸麥管法（OPS）、封閉式拉伸麥管法（CPS）、石英毛細管法（QMC）、電鏡銅網法和Cryotop法等［10］。其中Cryotop法因熱傳導效果更優異，被許多中心所采用。本研究應用Cryotop法對小鼠MⅡ期卵母細胞進行玻璃化冷凍，通過比較不同環境溫度、不同微滴體積和暴露時間的復蘇率，分析其對凍融效果的影響，為Cryotop法冷凍人類卵母細胞技術的改善積累經驗。

1　對象與方法

1.1對象

1.1.1實驗動物6周齡雌性昆明系小白鼠（體重20～25 g），購自浙江中醫藥大學實驗動物中心（動物合格證號：SYXK（浙）2013-0184）。

1.1.2藥物與試劑尿促性腺激素（HMG）與絨毛膜促性腺激素（HCG）均購自麗珠制藥廠；透明質酸酶（hyaluronidas）及配子處理液G-GAMETE和G-IVF購自Vitrolife公司，二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、Dulbecco磷酸鹽緩沖液（DPBS）以及蔗糖均購自Sigma公司；人血清白蛋白（HSA）以及石蠟油購自Sage公司。

1.1.3耗材與設備四孔皿購自NUNC公司，60 mm培養皿及巴斯德管購自Falcon公司，裝載工具Cryotop購自KITAZATO公司。超凈工作臺為丹麥IVFtech，解剖顯微鏡為日本OLYMPUS，培養箱為美國THEMRO，液氮罐為美國MVE。

1.2實驗方法

1.2.1玻璃化冷凍解凍液的制備冷凍液分為濃度由低到高的4個梯度：預平衡液（95%DPBS+5%HSA）；冷凍液Ⅰ（85%DPBS+5%DMSO+5%EG+5%HSA）；冷凍液Ⅱ（75%DPBS+10%DMSO+10%EG+5% HSA）；冷凍液Ⅲ（25%DPBS+20%DMSO+20%EG+30%蔗糖+5%HSA）。解凍液則分為濃度由高到低的4個梯度：解凍液Ⅰ（65%DPBS+30%蔗糖+5%HSA）；解凍液Ⅱ（75%DPBS+20%蔗糖+5%HSA）；解凍液Ⅲ（85%DPBS+10%蔗糖+5%HSA）；解凍液Ⅳ（90% DPBS+5%蔗糖+5%HSA）。

1.2.2凍融前小鼠卵母細胞的準備雌鼠腹腔注射10 U的HMG，48 h后再注射10 U的HCG，15 h后將小鼠頸椎脫臼處死，用注射器于覆油的G-GAMETE配子處理液中刺破輸卵管膨大部，擠出成簇卵冠丘復合物（cumulus-oocyte complexes，COCs）。置于37℃培養箱4 h后，將COCs放入含透明質酸酶的四孔皿內1 min，再移入剩余3孔的G-GAMETE配子外理液中反復吹打至顆粒細胞剝離干凈，選取形態良好MⅡ期卵母細胞于G-IVF培養液37℃、6%CO2飽和濕度培養箱內培養1h待用。

1.2.3卵母細胞玻璃化冷凍復蘇冷凍：根據冷凍環境溫度的不同，分別設置37℃操作組和22℃操作組，即分別在生理溫度（37℃）和室溫（22℃）環境下，將卵母細胞依次放入事先熱平衡過的預平衡液（2 min），冷凍液Ⅰ（2 min），冷凍液Ⅱ（3 min）以及冷凍液Ⅲ，且根據卵母細胞與含高濃度非滲透保護劑蔗糖的冷凍液（冷凍液Ⅲ）接觸時間的不同，分別設置30～40s暴露組、>40～90 s暴露組、>90～180 s暴露組。將卵母細胞轉移至Cryotop聚乙烯薄膜片前端，控制包被卵子的保護液微滴體積，根據薄膜上微滴體積的不同，分別設置<0.1 μL組、0.1～0.5 μL組、>0.5～1.0 μL組。完成以上操作后迅速將載具投入-196℃液氮中，插入管套儲存。解凍：2 d后，將解凍液Ⅰ預先放到37℃培養箱預熱1 h，其余解凍液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均置于室溫下平衡40 min。解凍時，迅速從液氮中取出載桿，將前端載片浸入解凍液Ⅰ中，輕晃以使得卵子脫落，2 min內將卵子轉移到解凍液Ⅱ，再分別將卵母細胞放入解凍液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各3 min，最后轉移到G-IVF培養液，放于37℃、6% CO2飽和濕度培養箱后繼續培養。

1.3卵母細胞存活判斷

經解凍的卵母細胞放于培養箱內培養，次日早間觀察依然可見透明帶與細胞膜完整，卵周間隙清晰，大小正常，折光度好，且沒有明顯的胞漿溢出與皺縮，則判定其存活良好。

1.4統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1室溫（22℃）操作環境下與37℃環境下小鼠卵母細胞復蘇率比較

在其他實驗條件相同情況下（加載CPA微滴體積< 0.1 μL，卵母細胞與高濃度CPA的接觸時間<90 s），22℃操作組小鼠卵母細胞的復蘇率高于37℃操作組，差異有高度統計學意義（P<0.01）。見表1。

表1　不同操作環境溫度下小鼠卵母細胞復蘇率比較

2.2加載不同體積CPA微滴組間小鼠卵母細胞復蘇率比較

選擇22℃的操作環境，卵母細胞與高濃度CPA的接觸時間<90 s時，加載不同體積（<0.1 μL組、0.1～0.5 μL組、>0.5～1.0 μL組）的CPA微滴的小鼠卵母細胞復蘇率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2　加載不同體積CPA微滴組間小鼠卵母細胞復蘇率比較

2.3投入液氮前接觸不同時間高濃度CPA的小鼠卵母細胞復蘇率比較

在22℃的操作環境下，控制卵母細胞與高濃度CPA（冷凍液Ⅲ）的接觸時間，使其分別為30～40、>40～90、>90～180 s暴露組，凍融后發現，>90～180 s暴露組復蘇率低于30～40 s暴露組和>40～90 s暴露組，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3　投入液氮前接觸不同時間高濃度CPA（冷凍液Ⅲ）的小鼠卵母細胞復蘇率比較

3討論

玻璃化冷凍操作溫度的選擇尚存在爭論，鞏曉蕓等［11］通過凍融人卵裂期胚胎發現24-26℃的冷凍操作環境溫度得到的復蘇率為90%，要顯著高于37℃組（55%），差異有統計學意義（P<0.05）。鄒立波等［12］則發現在25℃操作環境下凍融小鼠囊胚后獲得的孵化率為50.9%（28/55），顯著高于37℃組的21.3%（13/ 61），差異有統計學意義（P<0.05）。但孫瑩璞等［13］在37℃條件下玻璃化凍融小鼠GⅤ期和MⅡ期卵母細胞都能得到較高的復蘇率分別為86.0%（129/150）和81.7%（121/145）。本研究分別在37℃和室溫（22℃）冷凍操作環境下對小鼠成熟期卵母細胞進行凍融，發現室溫（22℃）下操作較之37℃環境能獲得更高的復蘇率（P<0.01），與前兩位學者的實驗結果相一致。Rall等［14］認為降溫可以減低高濃度CPA對胚胎造成的化學毒性，故本實驗中37℃冷凍操作環境組復蘇率不高的原因可能是由于更多的高濃度滲透性冷凍保護劑DMSO和EG進入到卵母細胞內，對其產生化學毒性作用。而卵母細胞與分裂期胚胎比較，其表面積與體積比例明顯較小，細胞內含水量大，細胞膜滲透性低，且具有對溫度極為敏感的紡錘體等特殊結構，這都使得卵母細胞顯得更為脆弱，更易形成冰晶，玻璃化凍融難度更高［15］。因此，在冷凍過程中選擇合適的操作溫度（22℃）至關重要。

玻璃化是由液相直接轉變為一種玻璃狀的固體狀態的過程［15］，避免了晶體態的出現，從而有效防止了冰晶對細胞的物理損傷。實現玻璃化狀態的關鍵是提供足夠快的降溫速度，而降溫速度又與冷凍載體的類型和液體體積有關。目前常用的卵子玻璃化冷凍載體有拉伸麥管，石英毛細管，電鏡銅網和Cryotop聚乙烯薄片載桿，其能達到的降溫速度分別為5521［16］、10 000［17］、3000℃/min［18］和37 500℃/min［16］。本實驗選用以上4類載體中熱傳導降溫效率最高的Cryotop載具對小鼠卵母細胞進行玻璃化冷凍，并通過比較加載不同體積的CPA微滴，來探討液體體積這一因素對凍融效果的影響。結果發現，不同CPA液滴體積加載組間復蘇率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。Kuwaya ma［19］提出Cryotop法時認為加載在塑料薄膜帶（寬0.4 mm，長20 mm，厚0.1 mm）上的包含有卵母細胞的保護液小滴體積應<0.1 μL。但本實驗結果提示，當液滴體積<1 μL時，液滴體積的增大并沒有降低卵母細胞的復蘇率，說明1 μL的CPA包被體積未達到影響胚胎復蘇能力的閾值。而拉伸麥管法中，所用到的細麥管裝載的液體體積達到2 μL，且脈管壁直接隔斷了含配子的保護液與液氮的接觸，阻止了熱量的直接傳導，但即便如此，其仍能達到5521℃/min的降溫速率，并獲得較好的冷凍效果。因此，本研究認為在使用Cryotop法進行玻璃化冷凍時，液滴體積不必刻意追求<0.1 μL，當體積<1 μL時，其大小改變不對復蘇率造成影響。

玻璃化狀態的實現，需要比傳統慢速程序化冷凍所用濃度高得多的CPA的參與，但濃度的升高同時意味著CPA對卵子或胚胎毒性和滲透性損傷的增加［15］。因此，控制好配子與高濃度CPA的平衡接觸時間，使其既滿足玻璃化冷凍的需要，又盡可能減少CPA帶來的毒性作用非常重要。杜娟等［20］收集IVF周期未受精人成熟卵子，將其分組后控制卵子與高濃度CPA的接觸時間，發現10～20 s暴露組的復蘇率要顯著高于40～50 s暴露組（P<0.05）。但鞏曉蕓等［11］分別比較了2、4、8個細胞鼠胚以及人卵裂期胚胎和玻璃化液接觸不同時間下的復蘇率，發現各組胚胎復蘇率比較差異無統計學意義（P>0.05）。本研究在22℃的操作環境下，控制小鼠MⅡ期卵母細胞與高濃度CPA的接觸時間，發現30～40 s組和>40～90 s組的復蘇率十分接近，這說明90 s的接觸時間未達到影響卵子復蘇能力的閾值。但>90～180s組的復蘇率要低于>40～90 s組和30～40 s組，且許多卵子出現了過度脫水，體積皺縮，融解時細胞恢復緩慢甚至無法擴張到冷凍前體積的情況，這又提示過長的暴露時間的確會增加CPA對卵子的毒性和滲透性損傷，對卵子凍融不利。

綜上所述，在采用Cryotop法對卵母細胞進行玻璃化冷凍時，要多因素綜合考慮，選擇合適的冷凍操作環境溫度，加載恰當的高濃度CPA微滴體積以及控制適宜的卵子于CPA的暴露時間，以期達到最佳的玻璃化凍融效果。

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Effect of the temperature，volume and treatment duration of CPA microdrop on mouse oocytes vitrification

RAO Jinpeng1QIU Feng1LIU Qing1CAI Yiting1JIN Min1JIN Fan2
1.Reproductive Medicine Center，the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine，Zhejiang Province，Hangzhou310052，China；2.Reproductive Medicine Center，Women's Hospital，School of Medicine，Zhejiang University，Zhejiang Province，Hangzhou310006，China

R321

A

1673-7210（2016）09（c）-0008-04

2016-06-15本文編輯：任念）

國家自然科學基金資助項目（81571500）。

饒金鵬（1987-），男，碩士；研究方向：輔助生殖技術。

金帆（1958-），男，碩士，教授；研究方向：輔助生殖技術。