一種快速有效檢測SSR標記的非變性聚丙烯酰胺凝膠的銀染方法

郭培國， 劉文杰， 李海洋， 王直亮， 夏巖石， 李榮華

(廣州大學 生命科學學院, 廣東 廣州　510006)

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一種快速有效檢測SSR標記的非變性聚丙烯酰胺凝膠的銀染方法

郭培國， 劉文杰， 李海洋， 王直亮， 夏巖石， 李榮華

(廣州大學 生命科學學院, 廣東 廣州510006)

聚丙烯酰胺凝膠銀染法是一種具有高分辨率檢測SSR標記的有效方法，然而傳統的銀染方法存在操作步驟較多、所需時間較長及試劑種類與用量較多等不足.本研究利用菜心和煙草SSR標記為研究對象，建立一種能快速有效檢測其PCR擴增產物的非變性聚丙烯酰胺凝膠的銀染方法.該方法包括染色和顯影2個主要操作步驟，整個銀染流程耗時6～7 min，只需要AgNO3、NaOH和甲醛3種試劑，所檢測SSR標記的DNA條帶清晰、易辨.與其他銀染法相比，本研究建立的銀染法具有易于操作、耗時少、所需試劑種類和用量少及檢測效果好的優勢.

SSR標記； 檢測； 非變性聚丙烯酰胺凝膠； 銀染

DNA簡單序列重復(SSR)標記在植物基因組中覆蓋面廣、數量豐富，且具有特異性強、共顯性和操作簡單的優點[1]，已成為研究工作者常用的分子標記之一.該技術已廣泛應用于植物的遺傳多樣性分析、生物進化、遺傳圖譜的構建、QTL定位和分子標記輔助育種等研究和應用工作[2-3].

聚丙烯酰胺凝膠的銀染法是檢測SSR標記的常用方法之一，該方法具有較高的靈敏度和較高的分辨率，可鑒別出低至1 pg·mm-2的DNA量和區分1個堿基的差異[4-5].但傳統經典的銀染法操作流程含有固定、漂洗、銀染、漂洗、顯色和終止等步驟，在使用前需配制一些溶液等[5]，存在操作復雜、耗時和費力等不足；另外，其染色的一致性、銀染后凝膠的貯存時間等方面亦不是很理想[6-7].針對銀染操作繁瑣及染色效果的不足，先后有一些研究對銀染方法進行了改進，如修改了固定步驟中固定液的成分、減少了顯色和終止步驟要求10 ℃低溫的條件[8-9]；取消固定步驟、調整染色液和顯色液化學成分及比例等[6, 10-16].但這些改良的銀染方法在操作繁瑣程度或效率上仍存在不足，在化學試劑種類及用量上面還有減少的空間.

據此，本研究在前人建立的銀染方法基礎上，利用菜心(BrassicacampestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee)和煙草(NicotianatabacumL.)SSR標記作研究對象，探討變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的銀染檢測方法，建立一種僅需染色和顯色2個主要步驟、3種試劑的操作簡單、耗時少和分辨力高的快速有效檢測SSR標記的銀染方法，適用于大量SSR標記的基因分型工作.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料

供試的菜心材料為“四九-19號菜心”、“油綠501”、“3T6”和“柳葉50”，由廣州市農業科學院提供；煙草材料“紅花大金元”、“粵煙98”、“118-3”和“巖煙97”，由廣東省煙草南雄科學研究所提供；盆栽種植供試的菜心和煙草材料.

1.1.2SSR標記的引物和試劑

選取菜心和煙草SSR標記的引物組合各1對，用于檢測銀染的效果.這些SSR標記的引物由生物工程生工(上海)股份有限公司合成，其信息見表1.DNA分子大小標樣DL500購自于日本寶生物工程株式會社(Takara Bio Inc.)，其他試劑均購自于Sigma-Aldrich公司.

表1菜心和煙草SSR標記引物信息

Table 1The information of SSR primers of flowering Chinese cabbage and tobacco

植物材料SSR標記名稱正向引物序列5'-3'反向引物序列5'-3'菜心CX-3ACTCGAATTCCGGTGAGTTGCATTGCACCTGCTCATGTTT煙草TME0580TGGAAACGTTTGCTTAAGGGTAGTGCAACGTGGACATTTGAA

1.2方法

1.2.1DNA的提取

采收幼嫩的菜心和煙草材料的葉片，按李榮華等[17]改良的CTAB法提取菜心和煙草材料的基因組DNA；采用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質量，用NanoDrop2000超微量分光光度計(Thermo Scientific，USA)檢測DNA的濃度，并將之調整到10 ng·μL-1作為SSR擴增的DNA模板.

1.2.2PCR擴增及電泳分離

在10 μL的PCR反應總體積中，含10 ng·μL-1的DNA模板2.0 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，25 mmol·L-1MgCl20.8 μL，10 μmol·L-1正向引物0.25 μL，10 μmol·L-1反向引物0.25 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.25 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.15 μL，ddH2O 5.3 μL.PCR擴增循環反應程序：94 ℃預變性5 min，之后按94 ℃下變性45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min的PCR程序運行35個循環，最后再在72 ℃條件下延伸10 min；之后置于4 ℃條件下貯藏備用.

選取美國CBS公司MGV-216-33雙面三倍寬垂直電泳槽及電泳儀，電泳玻璃板大小為33 cm寬×16 cm高，采用6%(丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺之比為29∶1)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離SSR標記的PCR擴增產物.凝膠厚度為1.5 mm，每個載樣孔寬3 mm，上樣2 μL.電泳條件為電壓120 V，電泳時間120 min.

1.2.3銀染方法

電泳結束后，取下附有凝膠的玻璃板，按表2中列出的各個銀染方法的實驗條件和步驟進行操作，除有說明外，均在室溫下操作.銀染結束待凝膠晾干后，用BenQ M800掃描儀掃描，貯存掃描圖片.在電腦中觀察、讀取數據并分析.

表2　不同DNA銀染方法操作步驟

2　結果與分析

2.1不同銀染方法的檢測效果

圖1為除去顏色并調整至適宜亮度和對比度后不同銀染法檢測菜心和煙草SSR標記的銀染圖.從圖1可見，所有的銀染方法均能檢測到煙草和菜心SSR標記的主條帶，但BASSAM等[5]、QU等[10]和KUMAR等[16]3種銀染法的背景反差較小，DNA條帶強度低和清晰度不高，一些具有多態性的次級條帶難觀察到，檢測效果差.SANGUINETTI等[8]和BYUN等[13]銀染法的條帶強度和清晰度要高于前3種方法，主條帶清晰易辨，且能粗略判斷次級條帶的多態性，但清晰度不高.而AN等[14]、LIANG等[15]和本研究建立的銀染法效果更進一步，經掃描成像后的凝膠背景較淺、清晰度高，菜心和煙草SSR標記的主、次條帶強度高且清晰，容易檢測；尤其是本研究建立的改良銀染法，檢測效果最佳.

圖1　不同聚丙烯酰胺凝膠銀染法檢測菜心和煙草SSR標記的結果

A～H分別為BASSAM等[5]、SANGUINETTI等[8]、QU等[10]、BYUN等[13]、AN等[14]、LIANG等[15]、KUMAR等[16]和本研究建立的銀染法.圖中M為DNA分子大小標樣，1～4分別為煙草品種“巖煙97”、“ 紅花大金元”、“ 118-3”和“粵煙98”的SSR標記TME0580的擴增產物，5～8分別為菜心品種“油綠501”、“柳葉50”、“四九-19號菜心”和“3T6”的SSR標記CX-3的擴增產物.

2.2不同銀染方法所需時間和試劑種類分析

根據各個銀染方法報道的從固定或染色步驟開始至完全顯色或終止步驟的操作流程，測定各銀染法檢測菜心和煙草SSR標記PCR擴增產物所耗費的時間.幾種銀染方法實際所需檢測時間見表3.從表3可見，BASSAM等[5]、SANGUINETTI等[8]和KUMAR等[16]建立的銀染方法所需的時間較長，檢測需時在30 min以上；QU等[10]和BYUN等[13]建立的銀染方法需要15 min或以上，而AN等[14]和LIANG等[15]建立的銀染法減少了銀染所需的時間，但仍分別需時10 min；而本研究建立的銀染法只需6～7 min，整個銀染過程所需時間最短.

從銀染所需試劑的種類來看，BASSAM等[5]、SANGUINETTI等[8]和BYUN等[13]的方法需5種試劑，QU等[10]、AN等[14]、LIANG等[15]和KUMAR等[16]銀染法需6種試劑，而本研究建立的改良銀染法僅需3種試劑(表3)，這3種試劑為AgNO3、NaOH和甲醛，且用量亦相對較少(表2).

表3幾種銀染方法檢測菜心和煙草SSR標記所需時間和試劑種類的比較

Table 3Comparison of time and types of reagents for detecting SSRs of flowering Chinese cabbage and tobacco by different silver staining methods

項目BASSAM等[5]方法SANGUINETTI等[8]方法QU等[10]方法BYUN等[13]方法AN等[14]方法LIANG等[15]方法KUMAR等[16]方法本研究建立的銀染法檢測時間/min723016151010426～7試劑種類數55656663

3　討　論

目前SSR標記主要采用瓊脂糖凝膠電泳檢測和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的方法，其中瓊脂糖凝膠電泳技術由于易于操作而被廣泛使用，但存在難以分辨幾個堿基差異的不足；聚丙烯酰胺凝膠電泳可區分幾個堿基的差異，但BASSAM等[5]和SANGUINETTI等[8]建立的傳統銀染法檢測聚丙烯酰胺凝膠中SSR擴增產物，具有操作步驟較多(包括固定、清洗、染色、清洗、顯色、終止和清洗等步驟)、耗時較長等不足；使用熒光SSR標記技術能提高檢測效率[18]，但需要較為昂貴的專用儀器設備，檢測所需的試劑藥品花費也較高，普通實驗室里難以開展檢測工作.據此，不少研究對銀染法進行了改進，如在染色步驟中加入5%～10%乙醇，將原銀染法中的固定、清洗和染色步驟合并成一個同時進行固定和染色的步驟[6, 10, 13-16, 19]，或不加乙醇直接進入染色步驟[11]；將銀染檢測過程減少至2個[6, 15]或3～4個主要步驟[10-11, 13-14, 16]，但有些銀染法流程的操作較為復雜，如需在5 ℃[16]或55 ℃條件下顯色[13].報道這些改進方法銀染操作時間最少可達13～15 min[11, 16],有的最低可至10 min左右[6, 10, 13-14],甚至達7 min[15].但利用業已報道的銀染法的操作步驟檢測本研究菜心和煙草SSR標記時發現，需時最少的為AN等[14]和LIANG等[15]建立的銀染法，均為10 min，但高于其報道所需的7～9 min的檢測時間，這一現象亦在其他銀染法[5, 10, 13, 16]中出現.究其原因，是各方法中顯色步驟所需時間均高于其報道所需的最少時間(數據未發表)，因而導致整個檢測過程所需時間的增加.而本研究建立的銀染法，只有染色和顯色2個主要步驟，檢測菜心和煙草SSR標記只需要6～7 min；從檢測SSR標記所需時間來看，優于其他銀染法.

從菜心和煙草SSR標記的檢測效果來看，BASSAM等[5]、QU等[10]和KUMAR等[16]建立的銀染方法背景較淺、顯淡黑色，DNA條帶強度較弱，盡管能分辨出SSR標記的主條帶，但次級條帶相對較模糊，辨別難度較大，表明這些方法的分辨力較低.SANGUINETTI等[8]、AN等[14]、BYUN等[13]、LIANG等[15]及本研究建立的改良銀染法染色背景呈淺黃色，SSR標記的DNA條帶強度高，經掃描除黃色背景色、調整亮度和對比度后，凝膠圖背景淺、SSR標記的主、次級條帶較清晰，易于辨別，均可有效檢測菜心和煙草的SSR標記.其中AN等[14]、LIANG等[15]及本研究建立的改良銀染法DNA條帶強度高、對比度大、分辨力高，檢測效果好,尤為本研究建立的改良銀染法，DNA條帶更為清晰易辨.

另外，本研究建立的改良銀染法檢測菜心和煙草SSR標記時所需試劑種類和用量最少，與檢測效果較好、耗時較短的AN等[14]和LIANG等[15]所需6種試劑相比，未使用這2種方法需要的乙醇、HNO3、Na2CO3或鉻黑T(EBT)，只利用這2種方法均具有的AgNO3、NaOH和甲醛3種試劑.AgNO3和NaOH的用量與An等[14]方法基本一致，但分別為LIANG等[15]方法的75%和25%；而甲醛的含量則為這2種方法的25%.這一結果表明，染色步驟中溶液的乙醇和HNO3成分不影響DNA的檢測效果，但較高濃度的HNO3可能延長顯色步驟中DNA顯色所需的時間.究其原因是染色液中具有的HNO3，染色結束后1次5～10 s的去離子水沖洗難以將HNO3清洗完全，殘留在凝膠中的HNO3減緩顯色步驟中堿性環境下甲醛與Ag+的反應速度，從而延長顯色時間.

4　結　論

本研究建立一種能快速、有效檢測SSR標記的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的銀染方法，檢測效果明顯優于傳統的銀染方法.該銀染法只需染色和顯色2個主要步驟，整個銀染過程耗時6～7 min，檢測只需AgNO3、NaOH和甲醛3種試劑且用量少.具有簡便快速、成本低、檢測效果好和對環境污染少的特點，適合于大量樣品的SSR標記的基因分型工作.

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【責任編輯： 陳鋼】

A rapid and effective method of silver staining for detecting SSR markers in nondenaturing polyacrylamide gels

GUO Pei-guo, LIU Wen-jie, LI Hai-yang, WANG Zhi-liang, XIA Yan-shi, LI Rong-hua

(School of Life Sciences, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China)

Silver staining is an effective method to detect SSRs with high resolution in polyacrylamide gel. However the conventional methods of silver staining are time-consuming because they have a number of time-dependent procedures with more kinds of reagents. Here we reported a rapid and effective silver staining method for detecting PCR amplification products in nondenaturing polyacrylamide gel by using SSRs of flowering Chinese cabbage and tobacco. This method includs two major steps——staining and development,within 6 to 7 mins, and requirs only three reagents which are HNO3, NaOH and HCOH. With the method, DNA fragments of SSRs are unambiguously detected with high resolution. Compared with other silver staining methods, this new method has advantages of easy operation, time-saving, less amount of chemical reagents and good detection effect.

SSR marker; detection; nondenaturing polyacrylamide gel; silver staining

2016-06-03;

2016-06-09

國家自然科學基金資助項目(30871526);廣東省自然科學基金資助項目(2015A030310136, 2015A030313500)；廣東省科技計劃資助項目(2016B020201001)；廣東省煙草專賣局科技計劃資助項目(201201, 201403)；廣東省普通高校國際暨港澳臺合作創新平臺及國際合作重大資助項目(2015KGJHZ015)；廣州市科技計劃資助項目(2014J4100123)；廣州市屬高校科技計劃資助項目(1201420621)

郭培國(1963-),男，教授，博士．E-mail: guopg@gzhu.edu.cn; guopg@yahoo.com

1671- 4229(2016)04-0008-05

Q 503

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