節律基因hBmal1在人結腸癌中的表達及臨床意義

魯力　熊治國　謝敏　熊莉娜

?論著?

節律基因hBmal1在人結腸癌中的表達及臨床意義

魯力1熊治國1謝敏1熊莉娜2

目的 檢測hBmal1在人結腸癌中的表達，探討其臨床意義。方法 應用免疫組織化學方法檢測湖北省腫瘤醫院30例人結腸癌患者中hBmal1的表達，以圖像分析軟件進行相關測定，并分析其表達與臨床及病理常用指標的關系。結果 人結腸癌組織和癌旁正常對照組織中hBmal1表達陽性率為76.67%（23/30） vs 26.67%（8/30）（χ2=15.016，P＜0.01）；hBmal1在人結腸癌Dukes分期B、C期中強陽性表達率為46.15%（6/13） vs 88.24%（15/17）（χ2=6.212，P=0.013）。結論 hBmal1在人結腸癌組織中有高表達，可能與癌癥的發生發展侵襲轉移有關。

結腸腫瘤； 基因表達； 節律基因； hBmal1基因

生物鐘是地球上的生命體為適應周圍的環境，與外界環境（尤其是日出、日落）同步而在長期的進化過程中形成的內在節律。近日節律的研究涉及衰老、時差、睡眠障礙、輪班工作、節食和人類腫瘤發生、發展等問題。流行病學研究發現晝夜節律的打亂與乳腺癌［1］、卵巢癌、前列腺癌、腎癌［2］、非小細胞肺癌［3］、胰腺癌［4］、胃腸癌［5］等的發生相關。節律基因通過調控、干擾癌基因、抑癌基因、生物周期、血管內皮生長因子及對于內分泌通路的作用等多方面參與了腫瘤的發生和發展［6］。本實驗選取人結腸癌為研究對象，探討hBmal1在人結腸癌組織和癌旁正常組織中的表達變化，及其在不同Dukes分期結腸癌的表達。

資料與方法

一、臨床資料

選取2009年至2015年湖北省腫瘤醫院胃腸外科人結腸癌手術患者組織標本30例，其中結腸腺癌27例（其中低分化6例，中低分化8例，中分化8例，中高分化4例，高分化1例），粘液腺癌2例，腺鱗癌1例；腫瘤侵犯及淋巴結轉移：Dukes分期：B期13例，C期17例。自手術切除的人結腸癌及癌旁組織取材，以癌中心組織為癌癥組，以癌旁正常組織為正常對照組。30例人結腸癌患者中男19例，女11例，年齡分布于35～77歲，平均年齡59.86歲。所有病例均無糖尿病、糖耐量異常病史，術前均未作放療、化療及免疫治療。所有癌癥組織均經病理組織學檢測確診，所有作為正常對照的斷端組織均未發現癌細胞。

二、方法

免疫組織化學染色方法檢測hBmal1的表達，采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物法（SABC法）對hBmal1的蛋白表達進行檢測。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，以隨試劑所附已知陽性對照片作為陽性對照。

三、染色結果觀察

使用顯微鏡及顯微攝影儀對染色組織切片進行觀察、照相，使用全自動彩色圖像分析系統進行圖像分析。癌癥細胞質中出現棕黃色顆粒為hBmal1蛋白染色陽性表達，隨機觀察5個高倍鏡視野計算均值。按癌癥細胞中陽性比例計算百分率，＜5%為-，5%～25%為1+，26%～50%為2+，＞50%為3+區分染色強度。最后隨機攝取5個高倍鏡視野照相。

四、統計學分析

應用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理，計數資料以百分數表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結　果

一、hBmal1的表達和分布

hBmal1在絕大部分癌癥組標本（23/30，76.67%）中可見著色，hBmal1蛋白以細胞質呈現棕黃色顆粒為陽性細胞（圖1）。結腸癌組織中hBmal1陽性表達率也顯著高于正常對照組織（χ2=15.016，P＜0.01）（表1）。

圖1　hBmal1的表達（×200）

表1　hBmal1在結腸癌組織、癌旁正常組織中的表達［例（%）］

二、hBmal1的表達和臨床病理因素的關系

hBmal1在Dukes分期B期中強陽性表達率為46.15%（6/13），C期中強陽性表達率為88.24%（15/17），差異有統計學意義（χ2=6.212，P＜0.05）（表2）。

表2　hBmal1在結腸癌組織中的表達和分化程度的關系［例（%）］

討　論

近日節律是身體內部的時鐘，通過控制能量、警惕性、生長、情緒和衰老的影響來調節器官和活動、休息周期。生物鐘節律存在于健康人，然而，在早期的胃腸癌患者中，這種節律是紊亂的［7-8］。細胞生物鐘機制的變更可能在相當大的程度上影響腫瘤的進程和對化療藥物的耐藥性，同時，晝夜節律活動的改變和腎上腺皮質的分泌活動伴隨著結腸癌轉移患者的低存活率［9］。目前根據腫瘤生長的節律特點，選擇最適合時間進行治療，以達到最大的療效和最小的毒副作用，即腫瘤時間治療在臨床已經取得了滿意的效果［10-12］。

Bmal1（brain and muscle ARNT-like-1），又名MOP3和芳烴受體核轉位蛋白3（ARNT3），是1997年Ikeda和Nomura發現，長32 kb，其編碼產物也屬bHLH-PAS家族成員。Bmal1在小鼠的視交叉上核中的表達呈明顯的近日節律，Bmal1敲除的小鼠在持續黑暗的條件下近日節律完全喪失。Bmal1除了參與生物鐘的調控外，與糖代謝、能量守恒及衰老也有明顯的關系。有研究報道，Npas2是機體維持正常節律所必需的基因，當其突變或缺失后，會引起節律系統的紊亂，同時，Npas2可以和Bmal1形成Npas/Bmal1異二聚體，同靶基因啟動子E-box結合，調控Per和Cry基因的表達，從而調節生物鐘節律，最近的研究發現，植入到小鼠體內的腫瘤細胞VEGF mRNA水平表現出近日節律性，而這種節律性與近日表達的Per2 及Cry1 抑制了VEGF基因啟動子的活性有關，表現出小鼠血漿中 VEGF 的濃度在白天升高，夜間下降，這為臨床抗血管生成因子的擇時治療提供了參考。原位雜交顯示，hclock基因mRNA和hBmal1基因mRNA均與結腸腫瘤的發生發展及侵襲轉移有相關性，免疫組織化學提示clock蛋白參與了結腸腫瘤的發生，并沒有顯示其與結腸腫瘤的侵襲轉移相關。由此推測hclock基因與hBmal1基因一起構成異二聚體，介導及調控其他鐘基因的轉錄過程［13］，除這兩種基因之外的其他鐘基因亦會參與結腸腫瘤的發生發展及侵襲轉移。

本實驗研究結果顯示，（1）hBmal1基因蛋白在人癌變結腸組織和癌旁正常組織中均有以細胞質棕黃色染色為主的陽性表達，在30例人結腸癌組織中表達陽性率為76.67%（23/30），在30例癌旁組織中表達陽性率為26.67%（8/30），兩者比較差異有統計學意義（P＜0.01）；（2）Dukes分期中，hBmal1蛋白在人癌變結腸組織B期中強陽性表達率為46.15%（6/13），C期中強陽性表達率為88.24%（15/17），兩者差異有統計學意義（P＜0.05）。提示hBmal1基因蛋白與人結腸癌的發生發展有關系，而且hBmal1蛋白可以作為人結腸癌生物學行為及預后的一個評價指標，其陽性表達提示腫瘤惡性程度高、預后相對較差。

另外，時辰化療被廣泛運用于臨床，它是根據正常組織、腫瘤組織和藥物代謝的生物節律，選擇腫瘤組織對藥物最敏感和/或對機體毒性最低的時間給藥，提高化療藥物的療效。歐洲3個國家9個研究中心報道，116例轉移性結直腸癌，時間化療和常規化療各93例，兩組有效率分別為51%與29%，因此目前認為，對晚期結腸癌患者采用近日節律性用藥方案與傳統以5-FU為主的聯合化療方案相比，客觀有效率可提高 2～6 倍，中位生存期可提高50%，不良反應率降低2～10倍左右。

在針對Bmal1和時辰化療的研究中，Gorbacheva等發現對晝夜節律基因Bmal1基因敲除鼠與野生鼠對環磷酰胺毒性的時辰敏感性進行比較，發現兩組之間對環磷酰胺的化療敏感性有明顯差異，其中Bmal1基因敲除鼠無論何時均對環磷酰胺敏感［14］。還有研究報道，結腸癌細胞中Bmal1過度表達能夠抑制細胞的生長，而且，Bmal1表達變化還影響了紫杉醇的化療敏感性［15］。

目前，EGFR作為大腸癌治療的靶點普遍被看好，已出現了多種針對EGFR的靶向抑制劑，如西妥昔單抗、吉非替尼、埃羅替尼等藥物。厄洛替尼是第一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI），其時辰化療的作用機制可能與EGFR-AKT-CyclinD-CDK-4通路有關。晝夜節律紊亂會導致多種疾病或者機體生理功能失調，且與腫瘤的關系密切。目前的研究主要針對褪黑素，褪黑素作為體現中樞晝夜節律的主要激素，由于其對于免疫系統的廣泛的調節作用，將神經內分泌系統、精神和軀體、以及免疫系統聯結成為一個整體，影響著腫瘤的發生、發展和轉移。既往實驗動物腫瘤模型的研究支持褪黑素抑制腫瘤細胞增殖，抑制EGFR和MARK通路［16］分化和凋亡的作用。

生物鐘同腫瘤分子生物學整合而產生的新興交叉學科必將拓展人類對腫瘤發生發展的認識，同時也為腫瘤的治療提供了新的思路。下一步的研究是如何利用細胞生物鐘機制控制腫瘤的發生發展進程，控制腫瘤患者對化療藥物的耐藥性，提高結腸癌轉移患者的存活率［17-19］。

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Significance and expression of hBmal1 in human colon carcinoma

Lu Li1， Xiong Zhiguo1， XieMin1，Xiong Lina2.
1Department of Gastrointestinal Surgery， Cancer Hospital of Hubei Province， Wuhan 430000，China；2Department of Digestive Disease， Liyuan Hospital， Huazhong University of Science & Technology，Wuhan 430077， China

Xiong Lina， Email: xionglina1978@163.com

Objective The aim of study is to investigate the expression of hBmal1 gene in human colon carcinoma tissue and their relation to invasion and metabasis of colon carcinoma. Methods Immunochemical staining was performed to detect the expression of hBmal1 protein in 30 cases of colon carcinoma tissues and 30 cases of normal tissues from Cancer Hospital of Hubei Province. Results The positive expression rate of hBmal1 in colon carcinoma tissues and in adjacent noncancerous tissues were 76.67% （23/30） vs 26.67% （8/30） （χ2=15.016， P＜0.01）. The strong positive expression rate of hBmal1 in B and C Dukes stage of were 46.15% （6/13） vs 88.24% （15/17） （χ2=6.212，P=0.013）. Conclusions Increased expression of hBmal1 gene contributes to occurrence and development of colon carcinoma.

Colon neoplasms； Gene expression； Rhythm gene； hBmal1 gene

2016-05-21）

（本文編輯：姜爭）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.04.007

湖北省自然科學基金資助項目（No.2013CFB117）；華中科技大學青年教師基金資助項目（No.2013QN128）

430000 武漢，湖北省腫瘤醫院胃腸外科1；華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院消化內科2

熊莉娜，Email：xionglina1978@163.com

魯力， 熊治國， 謝敏， 等. 節律基因hBmal1在人結腸癌中的表達及臨床意義［J/CD］. 中華結直腸疾病電子雜志， 2016，5（4）: 315-318.