玻璃化冷凍的卵母細胞在卵母細胞捐贈中的應用

林玉婷，馬翔，蔡令波，曾橋，吳畏，刁飛揚，劉嘉茵，千日成

玻璃化冷凍的卵母細胞在卵母細胞捐贈中的應用

林玉婷，馬翔，蔡令波，曾橋，吳畏，刁飛揚，劉嘉茵，千日成

目的：分析玻璃化冷凍的卵母細胞在供卵周期中的臨床結局，以期為卵母細胞捐獻的臨床應用提供參考。方法：回顧性分析2006年2月—2014年10月南京醫科大學第一附屬醫院臨床生殖醫學中心216個供卵周期的玻璃化冷凍的卵母細胞，比較解凍后的復蘇率、行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）的正常受精率、累計臨床妊娠率、種植率和累計活產率等臨床結局。結果：解凍玻璃化凍存的卵母細胞的復蘇率為82.0%（899/1 097），二原核（2PN）受精率76.9%（691/899）。在216個周期中，胚胎種植率為21.4%（84/393），累計臨床妊娠率為33.3%（72/216），累計活產率達27.3%（59/216）。每解凍1枚卵母細胞獲得活產兒的概率為6.5%（71/1 097）。結論：卵母細胞玻璃化凍融技術在卵母細胞捐贈的臨床應用上可以獲得較好的臨床結局。

卵母細胞；低溫保存；受精，體外；胚胎移植；妊娠結局

【Abstract】Objective:To analyse the clinical outcomes of the ovum donation cycles conducted with the vitrified oocytes，so as to provide the predictive information for the clinical application of this technique.M ethods: The clinical outcomes of 216 ovum donation cycles，which conducted with the vitrified-thawed oocytes undergoing IVF-ET in our reproductive center from February 2006 to October 2014，were retrospective analyzed.The main outcome parameterswere the survival rate of the freezen-thawed oocytes，the normal fertilization（2PN）rate of in vitro fertilization，the cumulative clinical pregnancy rate，the implantation rate and the cumulative live birth rate. Results:The survival rate of the freezen-thawed oocytes was 82.0%（899/1 097）.The normal fertilization（2PN）rate was 76.9%（691/899）.The rates of implantation，cumulative clinical pregnancy and live birth were 21.4%（84/393），33.3%（72/216）and 27.3%（59/216），respectively.The oocyte-to-baby rate was 6.5%（71/1 097）.Conclusions: There is relatively good clinical outcomes of the freezen-thawed oocyteswhen applied in the ovum donation.

【Keywords】Oocytes；Cryopreservation；Fertilization in vitro；Embryo transfer；Pregnancyoutcome

（JInt Reprod Health/Fam Plan，2016，35：362-364）

自1986年世界上第1例凍卵試管嬰兒誕生以來［1］，人卵母細胞冷凍保存技術取得了極大進步。截止2008年文獻報道的全球出生的凍卵試管嬰兒有900多例［2］。目前，玻璃化冷凍技術已成為冷凍保存卵母細胞的金標準［3］。卵母細胞的捐獻為卵巢功能早衰、卵巢功能不全或遺傳疾病婦女獲得贈卵誕生新生命帶來了希望［1］。南京醫科大學第一附屬醫院生殖中心在國內率先開展了卵母細胞玻璃化冷凍-捐贈分享技術［4-5］。本研究回顧性分析了該技術開展之初的216個供卵周期的臨床數據，以期為今后更好地改善供卵周期的臨床結局提供參考依據。

1　對象與方法

1.1研究對象選擇2006年2月—2014年10月本院臨床生殖醫學中心的216個供卵周期。供卵來源為在本院臨床生殖醫學中心接受體外受精-胚胎移植/胞漿內單精子注射（IVFET/ICSI）治療、年齡≤35歲、獲卵數≥15～20枚并獲得活產兒女性的剩余冷凍卵子。卵母細胞受者平均年齡（38.3±7.0）歲，不孕時間中位數和四分位數為5（3，9）年，平均體質量指數（BMI）為（22.2±2.6）kg/m2。臨床資料由本院不孕不育數據庫系統（CCRM）收錄。受者不孕原因包括卵巢功能減退、染色體異常、子宮內膜異位癥等。根據解凍卵母細胞數目的不同，對216個供卵周期進行分組（解凍卵母細胞數目≤4枚、5～6枚、7～8枚、≥9枚），比較每組供卵周期的臨床結局，包括累計臨床妊娠率、種植率和累計活產率。

1.2方法

1.2.1玻璃化冷凍方法成熟的卵母細胞用玻璃化冷凍試劑盒（Jieying Laboratory，Canada）冷凍。首先，在室溫下將成熟卵母細胞置于1號液（7.5%乙二醇+7.5%丙二醇）平衡10min，然后轉入2號液（15%乙二醇+15%丙二醇+0.5mol/L蔗糖）2 min，再裝載于JY冷凍載桿（Jieying Laboratory，Canada）上，最后投入液氮中保存。

1.2.2凍卵復蘇方法卵母細胞復蘇前，將復蘇液（Jieying Laboratory，Canada）升溫至室溫，將載有卵母細胞的冷凍載桿從液氮中取出，前端置于T1（含1mol/L蔗糖）液中使卵母細胞脫落至液體中，平衡1～3min后，將卵母細胞依次轉移至T2液（含0.5mol/L蔗糖）、T3液（含0.25mol/L蔗糖）、T4液（不含蔗糖）中各3min，最后將卵母細胞轉移至受精液中，在37℃、6%CO2下培養2 h后行ICSI受精。

1.2.3復蘇后胚胎移植時機自然周期卵泡監測，排卵日復蘇冷凍卵母細胞并行ICSI受精，第3天行ET。排卵障礙的患者采用人工周期準備子宮內膜，自月經周期的第3天開始口服戊酸雌二醇或17β-雌二醇4mg/d，定期B超監測子宮內膜變化，調整雌激素用量，內膜厚度達8mm時開始給予黃體支持。次日復蘇冷凍卵母細胞并行ICSI受精，第3天行胚胎移植，移植后繼續使用黃體支持。

1.2.4臨床結局判斷和計算移植后第14天測血人絨毛膜促性腺激素β亞單位（β-hCG）＞5.3 IU/L，移植28 d后超聲檢查見孕囊及胎心搏動確定為臨床妊娠，隨訪到嬰兒出生為活產。臨床指標的計算如下。卵母細胞復蘇率=解凍后存活卵母細胞數/解凍卵母細胞總數×100%；二原核（2PN）受精率=2PN卵子數/ICSI卵子數×100%；累計臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/供卵周期數×100%；種植率=超聲見孕囊數/移植胚胎數× 100%；流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%；累計活產率=活產周期數/供卵周期數×100%。

1.3統計學方法應用SPSS 17.0軟件進行數據分析，率的比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1卵母細胞凍融結果和胚胎移植后的臨床結局共解凍玻璃化凍存的卵母細胞1 097枚，復蘇率82.0%（899/1 097），2PN受精率76.9%（691/899）。216個供卵周期中，有194個周期有可移植胚胎，占89.8%，平均移植胚胎（1.8±0.6）個，累計臨床妊娠率為33.3%（72/216），種植率為21.4%（84/393），流產率為12.5%（9/72），累計活產率為27.3%（59/216）。

59例患者共分娩71個活產兒，隨訪均未發現新生兒出生缺陷。每解凍1枚卵母細胞獲得活產兒的概率為6.5%（71/1 097），即獲得1個活產兒所需冷凍卵母細胞數目約為15.5（1 097/71）個。

2.2解凍不同數目卵母細胞的各供卵周期的臨床結局比較本研究結果顯示，4組的累計臨床妊娠率、種植率和累計活產率的差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1　解凍不同數目卵母細胞的各供卵周期的臨床結局比較%（n/n）

3　討論

目前，人卵母細胞冷凍技術主要有慢速程序化冷凍和玻璃化冷凍2種。研究表明，玻璃化冷凍技術優于慢速程序化冷凍技術，采用玻璃化冷凍的卵母細胞復蘇成活率更高［6］。玻璃化凍融卵母細胞，能在減數分裂中使紡錘體更快恢復［7］，對卵母細胞線粒體DNA（mtDNA）缺失及拷貝數影響較小，可較好地實現保存卵母細胞的目的［8］。2013年美國生殖學會頒布的指南中表明，成熟卵母細胞的冷凍已不再局限于實驗階段，正式將卵母細胞凍融技術納入人類輔助生殖技術的臨床應用［3］。

本研究的216個供卵周期共解凍玻璃化凍存的卵母細胞1 097枚。其中22個周期無可移植胚胎，周期取消率為10.1%，平均移植胚胎（1.8±0.6）個，最終成功獲得71例活產兒。相關研究報道的卵母細胞復蘇率在70%～88%［9］，復蘇后行ICSI的正常受精率為71%～79%［10-14］，移植后種植率為17.1%～20.4%［12-13］，每解凍1枚卵母細胞獲得活產兒的概率為6.5%［14］，均與本研究結果相似。

本研究根據解凍卵母細胞數目的不同，對216個供卵周期進行分組，比較每組供卵周期的臨床結局，4組的臨床結局差異均無統計學意義。西班牙的一項研究報道顯示，解凍卵子數目在25個以內，隨著解凍數目的增加，累計活產率升高的趨勢越快；而解凍卵子數目在25～40個，累計活產率升高的趨勢較慢，直至接近于100%［14］。由于我國供卵來源限制嚴格，卵源稀缺，本院臨床生殖醫學中心的每個供卵周期解凍卵子數目主要集中在6個以內，所以比較解凍不同卵子數目的臨床結局還需要更多的樣本。

本研究的卵子來源均為在本院臨床生殖醫學中心接受IVF/ICSI治療、年齡≤35歲、獲卵數≥15～20枚并已成功分娩的女性的剩余冷凍卵子。在目前供卵來源困難的情況下，對IVF-ET獲卵較多的患者進行冷凍部分卵母細胞，待分娩后進行冷凍卵子捐贈的方法是可行的，且累計活產率達27.3%，臨床結局尚可；卵子來源均為較年輕且有成功分娩史的女性，既保障了供受雙方的利益，又避免多余的卵子因形成了剩余胚胎無法捐獻而造成的資源浪費。

本研究對采用卵母細胞玻璃化凍融技術的供卵周期中分娩的59例新生兒進行隨訪，并未發現新生兒出生缺陷。2009年，Noyes等［2］統計了從1986—2008年全球出生的936例“凍卵寶寶”健康情況，結果發現，通過凍卵出生的新生兒出生缺陷率僅為1.3%（12例），與美國自然出生的新生兒相比，凍卵并未增加新生兒出生缺陷的風險，與本研究隨訪結果一致。

隨著卵母細胞玻璃化凍融技術的應用和發展，卵母細胞的冷凍復蘇率較以前有了明顯的提高，但是冷凍損傷不可避免，又因卵母細胞的特殊性，與胚胎冷凍相比冷凍復蘇率仍較低，面對我國卵源緊張的局面，卵母細胞冷凍技術的進一步改進顯得尤為重要。另外該技術臨床應用時間較短，對子代遠期的影響仍需持續關注。

［1］Chen C.Pregnancy after human oocyte cryopreservation［J］. Lancet，1986，1（8486）：884-886.

［2］Noyes N，Porcu E，Borini A.Over 900 oocyte cryopreservation babies born with no apparent increase in congenital anomalies［J］. Reprod Biomed Online，2009，18（6）：769-776.

［3］Practice Committees of American Society for Reproductive Medicine，Society for Assisted Reproductive Technology.Mature oocyte cryopreservation:a guideline［J］.Fertil Steril，2013，99（1）：37-43.

［4］Cai LB，Qian XQ，Wang W，et al.Oocyte vitrification technology hasmade egg-sharing donation easier in China［J］.Reprod Biomed Online，2012，24（2）：186-190.

［5］王媁，嚴正杰，蔡令波，等.卵子冷凍技術的臨床應用［J］.中華醫學雜志，2008，88（39）：2755-2758.

［6］Smith GD，Serafini PC，Fioravanti J，et al.Prospective randomized comparison of human oocyte cryopreservation with slow-rate freezing orvitrification［J］.Fertil Steril，2010，94（6）：2088-2095.

［7］CiottiPM，Porcu E，Notarangelo L，etal.Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing［J］.Fertil Steril，2009，91（6）：2399-2407.

［8］蔡學泳，彭南妮，刁瑞英，等.冷凍保存對人類卵母細胞線粒體DNA缺失和能量代謝的影響［J］.國際生殖健康/計劃生育雜志，2015，34（5）：357-360，363.

［9］Avraham S，Machtinger R，Cahan T，et al.What is the quality of information on social oocyte cryopreservation provided bywebsites of Society for Assisted Reproductive Technology member fertility clinics？［J］.Fertil Steril，2014，101（1）：222-226.

［10］Parmegiani L，Cognigni GE，Bernardi S，etal.Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes［J］. Reprod Biomed Online，2011，23（4）：505-512.

［11］Cobo A，Kuwayama M，Pérez S，et al.Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method［J］.Fertil Steril，2008，89（6）：1657-1664.

［12］Cobo A，Meseguer M，RemohíJ，et al.Use of cryo-banked oocytes in an ovum donation programme:a prospective，randomized，controlled，clinical trial［J］.Hum Reprod，2010，25（9）：2239-2246.

［13］Rienzi L，Romano S，Albricci L，etal.Embryo developmentof fresh′versus′vitrified metaphase II oocytes after ICSI:a prospective randomized sibling-oocyte study［J］.Hum Reprod，2010，25（1）：66-73.

［14］Cobo A，Garrido N，Pellicer A，etal.Six years′experience in ovum donation using vitrified oocytes:report of cumulative outcomes，impactof storage time，and development of a predictivemodel for oocyte survival rate［J］.Fertil Steril，2015，104（6）：1426-1434. e1-e8.

Application of Human Vitrified Oocytes in Ovum Donation

LINYu-ting，MAXiang，CAILing-bo，ZENG Qiao，WUWei，DIAOFei-yang，LIUJia-yin，CHIANRi-cheng.
TheClinicalCenterforReproductiveMedicine，The State Key Laboratory of Reproductive Medicine，The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China
Corresponding author:CHIAN Ri-cheng，E-mail:rchian@126.com

2016-06-20）

［本文編輯秦娟］

國家自然科學基金（81270746、81200444）；江蘇省婦幼保健重點學科（FXK201221）

210029南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學科（林玉婷，馬翔，蔡令波，曾橋，吳畏，刁飛揚，劉嘉茵，千日成）；南京醫科大學生殖醫學國家重點實驗室（劉嘉茵，千日成）

千日成，E-mail：rchian@126.com