體外操作對人精子運動參數及細胞內活性氧簇的影響

史瀟，王婷，周瑤，劉厲，詹曉敏，陳思梅，全松

體外操作對人精子運動參數及細胞內活性氧簇的影響

史瀟，王婷，周瑤，劉厲，詹曉敏，陳思梅，全松

目的：研究體外物理操作（離心以及微量加樣器抽吸）對人精子運動參數以及細胞內活性氧簇（ROS）的影響，旨在優化人精子體外處理方法。方法：7例精液常規參數正常的標本，采用不同離心力（200 g，600 g）及離心時間（5min，15min）以及不同微量加樣器抽吸次數（2，6，10次）進行處理，測試精子運動參數和細胞內ROS的變化。結果：①活動精子百分比以及活精子細胞內ROS水平主要受到離心時間的影響（P＜0.05）；前向運動精子百分比（PR）以及平均運動速率（VAP）均不受離心力及離心時間的影響（P＞0.05）。單因素方差分析多重比較結果提示，當離心時間為5min以上時精子活動力顯著下降，而ROS水平顯著增加（P＜0.05）。②加樣器抽吸2次以上可致人精子活動力顯著下降（P＜0.05），抽吸6次以上可導致人精子PR及VAP顯著降低（P＜0.05）；但抽吸操作并未顯著影響精子細胞內ROS的水平。結論：在人精子體外操作時應盡量縮短離心時間并控制加樣器抽吸次數從而保證正常的精子運動參數，也應盡量縮短離心時間從而減少體外操作所致的細胞內ROS升高。

精子；精子能動性；離心法，梯密度；抽吸；氧化性應激；受精，體外

【Abstract】Objective:To study the effects of centrifugation and pipette on humanmotility and intracellular ROS，so as to optimize the sperm handling procedure.Methods:Seven sperm samples with normal seminal parameters were treated with various centrifugation force（200 g，600 g）and centrifugation duration（5 min，15 min）and different pipetting times（2，6，10 times）.Motility parameter and intracellular ROS were measured. Results:For the centrifuge procedure，the centrifugation duration could significantly influence the sperm motility and intercellular ROS level（P＜0.05），while centrifugation did not significantly influence the percentage of progressivemotile sperm（PR）and the velocity of average path（VAP）（P＞0.05）.The centrifugation durationmore than 5 minutes could significantly decrease the sperm motility and intracellular ROS level（P＜0.05）.For the pipetting procedure，the pipetting more than 2 times would significantly decrease the sperm motility（P＜0.05），while the pipetting over 6 times would significantly decrease the PR and VAP（P＜0.05）.However，the intracellular ROS levelwas not significantly changed by the repeated pipetting.Conclusions:The special causion is that the centrifuge over 5 m inutes and pipetting over 2 times should be avoided during in vitro hand ling human sperm sample.

【Keywords】Spermatozoa；Sperm motility；Centrifugation，density gradient；Suction；Oxidative stress；Fertilization in vitro

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：369-371）

精液體外處理是輔助生殖技術（assisted reproductive techniques，ART）的常規步驟，離心、加樣器抽吸等體外操作是精液分析、冷凍以及優選等過程中必不可少的操作。根據以往對小鼠、大鼠等動物精子體外操作的經驗，離心、加樣抽吸等物理操作均可能造成精子損傷，并且不同動物精子對于離心、抽吸等體外操作的敏感性不同，因而精子所受損傷的程度也不同［1-4］。在ART臨床應用及科學研究中如何優化精子體外處理的條件是學者們共同關注的問題，然而目前仍缺乏人精子體外處理的相關實驗證據。本研究采用析因分析的方法，探討離心力、離心時間以及加樣器抽吸次數等操作對人精子運動參數以及細胞內活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的影響，旨在為優化ART過程中精子體外處理條件提供參考。

1　資料與方法

1.1標本收集根據世界衛生組織（WHO）第5版精液參數參考值，收集南方醫科大學南方醫院婦產科生殖中心有生育史且精液常規分析參數正常的30～40歲男性精液標本7例（禁欲3～5 d，手淫法取精）。本研究經南方醫科大學南方醫院倫理委員會批準同意采用精液常規分析后剩余標本進行研究。

1.2主要儀器與試劑①CASA精液分析儀（SCA全自動精液分析系統，西班牙Microptic S.L.公司）；②離心機（Sorvall Legend Mach 1.6/R，美國Thermo公司）；③正置顯微鏡（BX51，日本Olympus公司）；④流式細胞儀（美國BectonDickinson公司）；⑤ROS分析試劑盒（H2DCFDA，KGAF018，南京凱基生物公司）；⑥碘化丙啶（PI）染色試劑盒（KGA214，南京凱基生物公司）；⑦人輸卵管液（Human Tubal Fluid，HTF）按照文獻［5］配制。

1.3研究方法

1.3.1實驗分組本研究共分為3個大組，分別為對照組、離心處理組以及抽吸處理組。其中離心處理組分為4個亞組（200 g，600 g；5min，15m in；兩個因素各水平組合）；抽吸處理組分為3個亞組（2，6，10次抽吸）；對照組不做任何處理。每份標本同時完成上述3個大組的實驗。

1.3.2精子體外操作的處理實驗Ⅰ為離心力及時間對精子的作用，實驗Ⅱ為抽吸對精子的作用。實驗Ⅰ的具體方案為：離心處理組的每個亞組取1×106個精子置于1.5mLEP管中加入200μLHTF。分別采用200 g，600 g的離心力及5m in，15min的離心時間進行離心。共有4個亞組。對照組精子于37℃靜置，不進行離心處理。實驗Ⅱ的具體方案為：抽吸處理組的每個亞組取10×106個精子加入1mLHTF。置于1.5mLEP管中，采用1 000μL微量加樣器分別抽吸2，6，10次。共有3個亞組。對照組不進行抽吸處理。

1.3.3精液參數分析將射精后的精液置于干凈的一次性取精杯內，觀察精液一般性狀，然后置入37℃恒溫金屬浴保溫槽內孵育，待其液化進行檢測。離心和抽吸處理組在完成相應體外處理后，再次進行精液參數檢測。檢測時取7μL液化的精子懸液于一次性精子計數板（荷蘭Leja公司）上，置于顯微鏡載物臺上靜置1min后開始采用CASA精液分析系統分析精子活動率、前向運動精子百分比（PR）以及精子平均運動速率（VAP）。每份樣本分析4個視野。

1.3.4精子細胞內ROS檢測每份樣本均按照ROS檢測試劑盒（H2DCFDA）的操作步驟進行檢測。將200μL濃度為106/mL的精子懸液與200μL的H 2DCFDA工作液及1μL PI工作液于37℃共同孵育30min。將孵育后的精子懸液標本進行物理應激處理，隨后采用流式細胞分析儀分析2’，7’-二氯熒光素（DCF）熒光強度，從而檢測細胞內ROS的產生情況。流式細胞儀激發波長488 nm，采用前向散射光（FSC）和側向散射光（SSC）設門后，通過FL1（綠）檢測DCF熒光強度，FL2（紅）檢測PI熒光強度。每份樣本收集10 000個細胞。并采用Flow J軟件分析數據，計算存活精子DCF平均熒光強度（DCFMFI，即PI陰性群中DCF平均熒光強度）。

1.4統計學方法采用SPSS16.0進行統計學分析，定量資料正態分布的數據用均數±標準差（x±s）表示，實驗Ⅰ為2×2析因設計資料，實驗Ⅱ為單因素3水平設計資料，分別采用析因方差分析和單因素方差分析進行數據分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1存活精子細胞內ROS的檢測本研究采用PI和H2DCFDA聯合染色檢測存活精子細胞內的ROS水平，避免了混雜的死精子影響ROS檢測的結果。通過PI染色區分存活與凋亡細胞群，H2DCFDA染色計算得出DCFMFI評估細胞內ROS的含量。流式細胞儀分析結果見圖1。

圖1　H2DCFDA/PI雙染精子細胞結果圖

2.2離心力及離心時間對人精子的影響析因分析結果提示，活動精子百分比以及活精子細胞內ROS（即DCFMFI）主要受離心時間的影響；PR以及VAP均不受離心力或離心時間的影響。進一步進行單因素方差分析多重比較發現，當離心時間為5min和15min時精子活力顯著下降（P=0.01），同時活精子細胞內ROS水平也顯著增加（P=0.00）。見表1。

2.3加樣器抽吸次數對人精子的影響加樣抽吸次數的增加可致活動精子百分比、PR以及VAP顯著下降（P＜0.05），但并不引起存活精子細胞內ROS水平產生變化。進一步進行多重比較提示，當1mL的微量加樣器抽吸精子2次及以上即可造成活動精子百分比的下降（P＜0.05），在抽吸達到6次及以上可造成PR以及VAP的顯著下降（P＜0.05）。多重比較也提示細胞內ROS水平并無顯著改變（P＞0.05）。見表2。

表1　離心力及離心時間對人精子的影響（x±s，n=7）

表2　微量加樣器抽吸次數對人精子的影響（x±s，n=7）

3　討論

在ART中如何優化精子處理條件以減少對精子損傷是輔助生殖領域長期探討的熱點問題。一些研究報道了經過體外操作后動物精子活動力、膜完整性改變的現象［1-4］，然而人精子的相關研究資料較為缺乏。本研究根據實際操作中ART實驗室常用的人精子離心處理參數進行析因設計，設定離心力參數為200 g、600 g同時離心時間參數為5min、15min進行研究。發現當離心時間增加至5min時，人精子活力顯著下降，而ROS水平顯著增加。而與對照組比較的結果也提示，離心時間增加可導致精子活動率的進一步下降。這一研究結果與本研究團隊的動物精子研究結果相似［4］。Kim等［2］以及Katkov等［5］的動物實驗研究結果也證實了這一點。離心導致精子活動率以及PR的原因可能是由于離心過程中小鼠精子成團，尾部折疊而致的運動能力損傷［2］。本研究還發現，離心操作顯著增加人精子內的ROS水平。過高水平的ROS可能會影響精子的功能和受精能力，并導致精子DNA損傷［6］。因此，在精子體外操作的過程中必須盡量減少人為操作帶來的細胞內ROS水平升高。本文研究結果提示，人精子體外處理操作中，離心時間應控制在5min以內，以減少對精子活動力的損傷。

本研究還發現，對人精子實施抽吸操作不宜超過2次，否則人精子活動率下降，而加樣器抽吸超過6次時PR以及VAP均會顯著降低。這一結果與本研究團隊對小鼠精子的研究結果相似［4］，同時也與Varisli等［1］以及Kim等［2］的動物實驗研究結果相似。Varisli等［1］認為造成這一現象的原因與抽吸過程的機械剪切力有關，抽吸并未導致精子細胞內ROS水平的改變，這可能是因為抽吸操作所致的氧化應激強度不高，小鼠精子內的抗氧化系統（anti-oxidative system）足以將ROS還原，因此不至于使ROS水平升高。

本研究針對離心、抽吸操作對有生育史、精液參數正常人精子的影響進行研究，試圖優化人精子體外操作的條件，為ART的操作過程提供參考。本研究發現加大離心力、延長離心時間以及加樣抽吸均會影響精子的活動力，同時可能增加精子內源性ROS的產生。根據本研究的結果，建議在ART中體外離心人精子時應控制離心時間不超過5min，抽吸次數少于2次。然而，在ART的操作過程中更多涉及到的是精液參數異常患者精子的處理。精液參數異常的精子標本比正常精子標本更易產生內源性ROS，從而影響體外處理后的精子質量［7］。本研究的局限性在于未能夠探討經過離心、抽吸等操作后精子功能的變化以及對妊娠結局的影響，同時未能夠對處理后的精子功能和DNA完整性進行評估。今后的研究可對精液參數正常和異常的精液標本處理前后，精子結構、DNA完整性等指標進行更完善的評估，進而對臨床ART操作有更為全面的指導意義。

［1］VarisliO，Uguz C，Agca C，et al.Various physical stress factors on rat sperm motility，integrity of acrosome，and plasmamembrane［J］. JAndrol，2009，30（1）：75-86.

［2］Kim S，AgcaC，Agca Y.Effectsofvariousphysicalstress factorson mitochondrial function and reactive oxygen species in rat spermatozoa［J］.Reprod FertilDev，2013，25（7）：1051-1064.

［3］Agarwal A，Makker K，Sharma R.Clinical relevance of oxidative stress in male factor infertility：an update［J］.Am J Reprod Immunol，2008，59（1）：2-11.

［4］史瀟，王婷，劉厲，等.體外操作對小鼠精子參數及內源性ROS的影響［J］.國際生殖健康/計劃生育雜志，2015，34（6）：503-506.

［5］Katkov II，Mazur P.Influence of centrifugation regimes onmotility，yield，and cell associations ofmouse spermatozoa［J］.JAndrol，1998，19（2）：232-241.

［6］Aitken RJ，Smith TB，Jobling MS，et al.Oxidative stress and male reproductive health［J］.Asian JAndrol，2014，16（1）：31-38.

［7］Guz J，Gackowski D，Foksinski M，et al.Comparison of oxidative stress/DNA damage in semen and blood of fertile and infertilemen［J］.PLoSOne，2013，8（7）：e68490.

The E ffect of Physical Stress on Hum an Sperm M otility and Intracellular ROS Generation

SHI Xiao，WANG Ting，ZHOU Yao，LIU Li，ZHAN Xiao-min，CHEN Si-mei，QUAN Song.
Center for Reproductive Medicine，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 501515，China
Corresponding author:QUAN Song，E-mail:quansong@smu.edu.cn

2015-12-17）

［本文編輯王昕］

廣東省科技計劃項目（311220700174）；南方醫科大學南方醫院院長基金項目（2013C026）

510515廣州，南方醫科大學南方醫院生殖中心

全松，E-mail：quansong@smu.edu.cn