鋪散亞菊超臨界CO2 萃取揮發油成分及其抑菌活性研究

達洛嘉 馬家麟 白雪等

摘要[目的]研究藏藥鋪散亞菊揮發油的主要成分及其抑菌活性。 [方法]采用超臨界CO2法萃取鋪散亞菊揮發油成分，采用氣相色譜質譜聯用（GC-MS）結合相對保留指數進行組分分析鑒定，并通過濾紙片擴散法篩選鋪散亞菊揮發油對常見13種致病菌的抑菌活性。 [結果]從鋪散亞菊超臨界CO2萃取物中共分離出127個可識別峰，含量高于0.02%的化學成分為46種，占總萃取物的67.30%。鋪散亞菊揮發油對乙型副傷寒沙門菌、產氣腸桿菌等11種供試菌表現出抑菌活性。 [結論] GC-MS結合保留指數對鋪散亞菊超臨界CO2萃取揮發油進行定性分析，使定性結果更為可靠。該研究結果可為鋪散亞菊揮發油的抗菌活性研究提供試驗依據。

關鍵詞鋪散亞菊；超臨界CO2 萃??；GC-MS；抑菌活性

中圖分類號R284.2文獻標識碼A文章編號0517-6611（2016）04-004-04

Study on the Chemical Constituents and Antibacterial Activity of the Volatile Oil from Ajania khartensis by Supercritical CO2 Fluid Extraction

DA Luojia，MA Jialin，BAI Xue，LIN Pengcheng* et al （Key Laboratory of Pharmaceutical Analysis in Qinghai Province，Key Laboratory of Plant Resources of QinghaiTibet Plateau in Chemical Research，College of Pharmacy，Qinghai University for Nationalities，Xining，Qinghai 810007）

Abstract[Objective] To research the chemical components of volatile oil from Ajania khartensis，and to investigate their antimicrobial activities. [Method] The volatile oil from Ajania khartensis was obtained by supercritical CO2 fluid extraction，then combined GCMS analysis with retention index to appraise the chemical components，and screened antimicrobial activities of the volatile to thirteen common bacterial pathogens by filter paper diffusion method. [Result] 127 identifiable peaks were isolated from the volatile oil，among them，46 components′ relative content were higher than 0.02% which accounted for 67.30% of the total extract. The volatile oil from Ajania khartensis showed some antimicrobial activities against Salmonella paratyphy B and Enterobacter aerogenes. [Conclusion] It ensures the qualitative results by using GCMS and retention index to analyze the chemical components of volatile oil from Ajania khartensis.The filter paper diffusion method provides a reliable preparatory screening result for antimicrobial activities of volatile oil from Ajania khartensis.

Key wordsAjania khartensis； Supercritical CO2 fluid extraction； GCMS； Antibacterial activity

鋪散亞菊（Ajania khartensis），為菊科亞菊屬多年生鋪散草本，分布在印度、俄羅斯以及我國青海、云南、寧夏、西藏、四川、甘肅等地區，生長于海拔2 500～5 300 m的地區，一般生長于向陽山坡[1]，具有濃郁的特征氣味。鋪散亞菊在藏藥典籍《晶珠本草》中記載為蒿阿仲，主要用于治療肺熱癥[2]。張興旺等[3]通過水蒸餾法提取鋪散亞菊揮發油并使用GCMS進行分析鑒定，但使用超臨界CO2 提取鋪散亞菊揮發油及后續抑菌活性的研究則鮮見報道。筆者采用超臨界CO2 通用條件對鋪散亞菊揮發油進行萃取[4]，獲得揮發油使用GCMS分離鑒定，結合相對保留指數進行更準確地定性[5]。致病微生物所引起的肺部感染屬于中醫肺熱證范疇[6]。筆者用鋪散亞菊治療肺熱，采用濾紙片擴散法[7-8]研究其揮發油對13種常見致病菌的抑菌效果，以佐證其在藏藥中的功效。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。13株供試菌株購自中國藥品生物制品檢定所，具體見表1。

1.1.2藥材。藏藥鋪散亞菊于2014年8月采自青海省互助北山林場，經青海民族大學藥學院毛繼祖教授鑒定為藏藥鋪散亞菊。

1.1.3試劑與耗材。CO2為醫用級（北京市華元氣體化工有限公司）；正構烷烴混合對照品（C7～C30），購自上海安譜科學儀器有限公司；營養瓊脂，購自北京陸橋技術責任有限公司；蛋白胨，購自北京奧博星生物技術有限責任公司；牛肉膏，購自北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉，購自天津市大茂化學試劑廠；丙酮，購自天津市富宇精細化工有限公司。所用試劑都為分析純。耗材有濾紙片等（d=6 mm）。

1.1.4儀器。氣相色譜/質譜聯用儀，型號為7890A/5975C，為美國Agilent公司產品； G1888頂空進樣器，為Agilent公司產品；四極桿質譜檢測器；質譜檢索數據庫：NIST08 MS search 2.0；色譜數據處理系統（MSD Chemstation D.03.00.611），為美國Agilent公司產品；超臨界CO2萃取儀，型號為7071（SFE-2），購自美國ASI公司；空壓機；SDC6冷循環水系統；HZQX100A型恒溫振蕩培養箱，為上海一恒科學儀器有限公司產品；AS1060L型高壓滅菌鍋，為鄺杏生物技術有限公司產品；SWCJ2FD型超潔凈工作臺，為蘇州凈化設備有限公司產品。

1.2方法

1.2.1超臨界CO2萃取物的制備。將鋪散亞菊全草粉碎后過60目篩，稱取200 g投入1 L萃取釜中，加熱萃取釜溫度至50 ℃穩定，泵入CO2壓力設定為25 MPa，靜態萃取1.5 h，出樣口溫度100 ℃。

1.2.2鋪散亞菊萃取物的GC-MS保留指數分析。

1.2.2.1樣品制備。取0.01 g鋪散亞菊萃取物，加到2 mL丙酮中充分溶解。

1.2.2.2色譜條件。色譜柱為HP5彈性石英毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；載氣為He 氣，柱流量為0.8 mL/min。用于手動進樣的程序升溫條件為：初始溫度60 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min 升至150 ℃，保持5 min；以5 ℃/min升至260 ℃，保持10 min。進樣量5 μL。

1.2.2.3質譜條件。標準質譜調諧；電離方式EI，電子能量70 eV；四級桿溫度：150 ℃；離子源溫度：230 ℃；輔助區溫度：295 ℃；溶劑延遲時間：3 min；數據采集掃描模式：全掃描。質譜掃描質量范圍（m/z）50～550。

1.2.2.4保留指數（KI）的測定。手動進樣針精密移取正構烷烴混合對照品5 μL，按照“1.2.2.3”下的條件直接進樣，經程序升溫后得到條件分析的結果，用于組分KI 值的計算；記錄該條件下C7～C30各正烷烴的保留時間，采用線性升溫公式KI=100n +100（tx-tn）/（ tn+1- tn）計算各組分的KI 值，其中tx、tn和tn+1分別為被分析組分流出峰的保留時間和被分析組分保留時間相鄰的碳原子數處于n 和n+1 之間的正烷烴（tn

1.2.3鋪散亞菊揮發油的抑菌活性測定。

1.2.3.1菌種活化。①接種乙型溶血性鏈球菌、產氣腸桿菌、藤黃微球菌等11種細菌的新鮮培養物于營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基，30 ℃培養18～24 h。②接種白色念球菌和黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁培養基上，25 ℃下培養3～5 d。

1.2.3.2菌懸液的制備。①將上述細菌培養物加入無菌0.9%氯化鈉溶液配制成濃度為108 CFU/mL的菌懸液；②將上述真菌培養物加入3 mL無菌的0.9%氯化鈉溶液（含0.05%（V/V）吐溫80），混勻后將溶液表面的孢子緩慢吸出至無菌試管內，并配制成濃度為108 CFU/mL的孢子懸液。

1.2.3.3含菌平板的制備及最低抑菌濃度（MIC）的測定。采用濾紙片瓊脂平板擴散法，對鋪散亞菊揮發油的抑菌圈直徑進行測定。用移液槍吸取已制備好的待試菌株菌懸液0.2 mL，加入200 mL的營養瓊脂培養基或馬丁氏培養基中，混合均勻。將帶有菌懸液的培養基依次倒入培養皿中，待培養基凝固。配制不同濃度（2.00、1.00、0.50和0.25 mg/mL）的揮發油。用移液槍分別吸取4種不同濃度的揮發油溶液，加至濾紙片上，待濾紙片完全潤透，用已滅菌的鑷子將浸有揮發油溶液的濾紙片貼在待試菌培養基上，用丙酮或0.9%氯化鈉溶液（含0.05%（V/V）吐溫80）溶液作為空白對照。每個濃度進行3次平行試驗。將含菌平板置于培養箱中，將細菌在30 ℃下培養18～24 h，真菌25 ℃條件下培養24～48 h后測量抑菌圈直徑。置于培養箱培養10 h后，每1 h對平板進行觀察，以抑菌圈最大直徑為最終記錄值。

2結果與分析

2.1超臨界CO2萃取物所得萃取物為黃色固體，具有濃郁的香氣。

2.2鋪散亞菊萃取物的GC-MS保留指數分析以峰面積歸一化法計算萃取物各組分相對含量，選擇峰面積大于0.02%、NIST標準譜庫匹配度高于90以上的組分共46個，并計算各峰與標準譜庫匹配度前3位的組分保留指數，與NIST數據庫中保留指數進行比較，以質譜和保留指數匹配度最接近的物質為最優結果。由表2可知，從鋪散亞菊超臨界CO2萃取物中共分離出127個可識別峰，按照以上條件鑒定出46種組分，占總萃取物的67.30%。

2.3最低抑菌濃度（MIC）平板產生抑菌效果時的揮發油最低濃度即為最低抑菌濃度。由表3可知，鋪散亞菊揮發油對11種致病菌具有抑菌活性。其中，乙型副傷寒沙門菌、產氣腸桿菌、藤黃微球菌、肺炎克雷伯菌的MIC值為0.50 mg/mL；金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌、乙型溶血性鏈球菌、白色念球菌的MIC值為1.00 mg/mL；蠟樣芽胞桿菌、銅綠假單胞菌的MIC值為2.00 mg/mL。

3結論與討論

筆者通過超臨界CO2所萃取的鋪散亞菊揮發油，外觀上為黃色固體，具有濃烈的特異性氣味，區別于常規水蒸汽蒸餾法提取的揮發油，這是由于超臨界CO2 所萃取組分為小極性，含較多的脂肪族類化合物，此類物質常溫下大多為固體，在揮發油中占據主要成分，因此通過超臨界CO2 萃取的藏藥鋪散亞菊揮發油常溫下為固態。在收集萃取物時應將出樣口溫度保持在100 ℃，以防止樣品中所含水分在出樣口結冰堵住管路，出樣時氣體流速不能過快，流速過快會使揮發油得率下降，尤其是低沸點組分容易流失。超臨界CO2萃取法具有提取得率高、沒有有機溶劑殘留、操作溫度低、萃取物純度高等優點，非常適合于高效率制備植物揮發油成分[9]。

GC-MS結合相對保留指數對鋪散亞菊揮發油進行分析鑒定，能夠使鑒定結果更為準確。從鋪散亞菊超臨界CO2萃取物中共分離出127個可識別峰，其中峰面積大于0.02%，NIST標準譜庫匹配度高于90以上的組分46個，占總萃取物的67.30%，其中以脂肪酸類、烴類、醇類、酯類為主要成分。脂肪酸中亞麻油酸含量高達20.15%，具有調節血脂作用、預防心肌梗塞和腦梗塞、抗炎等作用[10-11]。

筆者通過濾紙片瓊脂平板擴散法對鋪散亞菊揮發油進行抑菌試驗，發現對乙型副傷寒沙門菌、產氣腸桿菌、藤黃微球菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌、乙型溶血性鏈球菌、白色念球菌、蠟樣芽胞桿菌、銅綠假單胞菌11種供試菌具有抑菌作用，且對其中的乙型副傷寒沙門菌、產氣腸桿菌、藤黃微球菌、肺炎克雷伯菌4種菌具有較好的抑菌作用。鋪散亞菊揮發油濃度與抑菌效果成正比，鋪散亞菊揮發油濃度越高，抑菌效果越好，而且無論是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌，均有著明顯的抑菌活性，說明鋪散亞菊揮發油有廣譜、高效的抗菌活性。該試驗結果可為今后對鋪散亞菊揮發油在抑菌方面的開發提供有效的試驗依據。

參考文獻

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