miR—148b對肝癌SMMC7721細胞衰老的影響

張軍港 石英 黃東勝 張成武 洪德飛

[摘要] 目的 探討miR-148b對肝癌SMMC7721細胞衰老的影響。 方法 分別使用50 nmol/L的miR-148b mimics（miR-148b）和negative control（miR-NC）轉染肝癌SMMC7721細胞48 h后，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-148b表達的變化。通過β-半乳糖苷酶染色法檢測細胞衰老的變化，應用western blot檢測P21表達的影響。 結果 與對照組相比，miR-148b能明顯增加肝癌SMMC7721細胞中miR-148b的表達。50 nmol/L的 miR-148b轉染SMMC7721細胞48 h后，細胞形態變得大而扁平，衰老細胞比例明顯增加[（9.67±2.08）% vs （43.67±3.51）%，P<0.01]。miR-148b使肝癌細胞P21蛋白的表達也明顯增加。 結論 miR-148b可能通過影響P21的表達促進肝癌SMMC7721細胞的衰老，miR-148b有可能成為肝癌SMMC7721細胞生物治療的新靶點。

[關鍵詞] 肝癌；miR-148b；衰老；P21

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）05-0025-04

microRNAs是一類長度為20～24 bp、具有基因調控功能的非編碼小分子RNA，主要通過影響mRNA的穩定及翻譯調控基因表達功能[1]。大量研究發現，microRNAs在細胞增殖、分化、凋亡、衰老等多種生物學過程中發揮重要的作用[2-4]。miR-148b在多種腫瘤中異常表達，與腫瘤的生物學功能及預后密切相關。前期研究結果發現miR-148b在肝癌組織和細胞中低表達，與肝癌的增殖侵襲密切相關[5，6]，目前miR-148b對肝癌細胞衰老的影響機制尚不清楚。本研究在2013年10～12月將50 nmol/L的miR-148b的類似物轉染肝癌SMMC7721細胞48 h后，觀察對細胞衰老特性及衰老相關蛋白P21的影響，為探討miR-148b作為肝癌治療靶點提供基礎依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

RPMI1640培養基和胎牛血清購自美國Gibco BRL公司， 肝癌細胞系SMMC7721購自中國科學院上海細胞庫。衰老相關β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自碧云天生物有限公司。miR-148b mimics（miR-148b）和negative control（miR-NC）轉染試劑盒購自廣州銳博生物技術有限公司。LipofectmanineTM2000及Trizol試劑均購自美國Invitrogen公司。兔抗人P21和GAPDH一抗購自美國 Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶結合的二抗購自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 常規細胞培養 肝癌SMMC7721細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，在37℃、含5%CO2培育箱下常規培養。

1.2.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR） 采用TaKaRa公司的試劑盒，miR-148b和內參U6的引物探針由廣州瑞博公司設計合成。miR-148b：5-AAGTTCTGTTATACACTCAGGC-3，內參基因U6：5-CTCGCTTCGGCA-GCACA-3。反應體系為 SYBRR Green qRT-PCR Mix（2×）10 μL，PCR Forward Primer和Reverse Primer各0.4 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O 7.8 μL，cDNA 1 μL。其反應條件：95 ℃ 30 s，95℃ 5 s， 60℃ 30 s×40循環，儀器為ABI公司7500型Real-time PCR儀。ABI step-one附帶qRT-PCR分析軟件分析CT（cycle threshold）值。目的基因RNA的相對表達量=2-Δ Δ CT， Δ Δ CT=待測樣本（CT目的基因-CT內參）-對照組（CT目的基因-CT內參）。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色法檢測細胞衰老 轉染組和對照組細胞培養48 h后離心后重懸，以1×105個/孔接種于12孔培養板中，貼壁 24 h 后用細胞衰老檢測試劑盒染色，在37℃孵育過夜，細胞質內出現均勻一致藍色細顆粒表示β-半乳糖苷酶染色陽性，即細胞出現衰老改變。

1.2.4 Western blot檢測P21蛋白的變化 各組細胞轉染培養48 h后， 提取細胞蛋白。總蛋白提取方法參照Beyotime公司操作說明進行。分別將相同適量蛋白含量的樣品和2×蛋白上樣緩沖液等體積混合，沸水中煮5 min使蛋白變性，10% SDS-PAGE電泳后電轉移至硝酸纖維素膜上，然后 5 g/L脫脂奶粉封閉，加入1：1000稀釋的一抗，4℃過夜，加入1∶2000稀釋的二抗，室溫1 h，TBS漂洗膜，ECL增強發光，X線曝光。以GAPDH蛋白作為內參照，BANDSCAN圖像分析軟件光密度積分值分析。

1.3 統計學處理

使用統計學軟件SPSS 13.0進行分析，經方差齊性檢驗，數據符合正態分布，所有數據以（x±s）表示，組間差異比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-148b對肝癌SMMC7721細胞中miR-148b表達的影響

將50 nmol/L miR-148b或miR-NC作用SMMC 7721細胞48 h，采用qRT-PCR的方法，檢測miR-148b表達的影響，結果發現與對照組相比（1.00±0.08），miR-148b明顯增加了肝癌細胞miR-148b的表達（151.22±9.77），差異具有高度統計學意義（t=21.73，P<0.01）（圖1）。

2.2 miR-148b對肝癌SMMC7721細胞衰老的影響

將50 nmol/L miR-148b 或miR-NC作用SMMC7721細胞48 h，采用倒置顯微鏡觀察細胞形態的變化。結果顯示，與對照組相比，miR-148b處理組的部分細胞形態變得更加大而扁平（封三圖1A）。進一步采用β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老變化。結果顯示，與對照組（9.67±2.08）%相比，miR-148b引起的衰老細胞比率明顯增加（43.67±3.51）%，差異具有高度統計學意義（t=14.42，P<0.01）（封三圖1B）。

2.3 miR-148b對肝癌SMMC7721細胞衰老相關p21蛋白的影響

采用Western blot方法檢測P21蛋白變化，結果發現，與對照組相比，50 nmol/L的miR-148b作用SMMC 7721細胞48 h后，P21蛋白的表達明顯增加（圖2A）。具體灰度值變化見圖2B（灰度值：1.16±0.02 vs 0.77±0.03），差異具有高度統計學意義（t=15.89，P<0.01）（圖2B）。

3 討論

肝癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一。由于肝癌的發病隱匿，早期無特異性的臨床癥狀，且病程進展迅速，當患者出現明顯的自覺癥狀時，往往已到了中晚期[7]。目前肝癌的治療仍以手術為主，而不能手術的患者則以化療為主。手術的效果受限于手術時機，而化療藥物易產生耐藥性、腫瘤殺傷效率不高。因此迫切需要尋找有效地早期生物標志物機開發新的有效藥物治療肝癌。

肝癌的發生發展是一個多因素多步驟多階段的病理過程， 涉及到很多相關癌基因和抑癌基因的變化。研究結果顯示，microRNA可能通過類似于抑癌基因、癌基因或其它方式來調控腫瘤發生、發展和轉歸過程，表現為同抑癌基因或癌基因相似的生物學效應[8]。microRNA主要通過與特定靶基因mRNA 的 3-非翻譯區（3-UTR）完全或不完全配對，導致靶基因mRNA降解或翻譯抑制，從而參與個體發育、細胞增殖、凋亡、分化、衰老和代謝等生命活動的調控[2，9，10]。

近年來研究發現miR-148b參與多種腫瘤的發生發展過程。Ghasemkhani N等[11]研究發現miR-148b在肺癌中低表達，同肺癌的TNM分期和淋巴結轉移及不良預后密切相關。Zhao等[12]研究發現miR-148b在胰腺癌低表達，通過影響AMPKα1信號通路影響腫瘤的生物學行為。我們前期已經發現miR-148b在肝癌中低表達，通關過調控WNT1/β-catenin通路抑制肝癌的增殖和侵襲行為[5]。然而miR-148b同肝癌細胞衰老的關系未做進一步研究。細胞衰老是指細胞不可逆地離開細胞周期、發生形態及細胞學改變的現象。細胞衰老作為細胞潛在的抗腫瘤機制，在腫瘤的發生發展過程中起著重要屏障作用，能夠有效防止腫瘤發生[13，14]。

本研究結果顯示miR-148b能夠使SMMC7721中的miR-148b表達明顯增加，miR-148b使SMMC 7721細胞的形態變得大而扁平，呈現出衰老狀態。同時我們發現miR-148b使β-半乳糖苷酶染色陽性的細胞數目明顯增加，進一步驗證了miR-148b能夠誘導肝癌細胞衰老，使肝惡性腫瘤細胞惡性生物學行為發生一定程度逆轉。

P21是細胞周期調控家族的重要成員之一，是依賴于細胞周期蛋白激酶（CDK）的抑制物，它能夠通過調控細胞周期過程，參與細胞的增殖、分化、衰老及死亡過程[15-17]。已知P21是通過依賴p53和不賴p53的途徑調節的。既往研究發現，P21能增加腫瘤細胞內的ROS水平，而ROS的抑制劑N-乙酰半胱氨酸能夠明顯阻止P21誘導的細胞衰老，表明P21可能通過ROS積聚機制誘導衰老[18]。Hu B等[19]研究發現女貞果實提取物通過正調控P21誘導肝癌細胞的衰老和凋亡。既往研究發現阿霉素能夠誘導結腸癌野生型HCT-116細胞發生衰老樣生長停滯，而這種作用對敲除P21的HCT-116細胞株作用大大降低，表明P21在結腸癌的衰老過程中起重要作用[20]。我們的研究結果發現miR-148b能夠使P21蛋白的表達量明顯增加，表明miR-148b可能通過調通P21的表達誘導肝癌細胞的衰老過程。

綜上所述，本研究結果顯示，miR-148b能夠通過調控P21來誘導肝癌SMMC7721細胞衰老，我們將進一步深入研究miR-148b在肝癌中的功能和調控分子機制，系統闡明miR-148b參與肝癌發生發展可能的機制，為肝癌的治療提供新的靶點。

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（收稿日期：2015-11-05）