沉默人宮頸癌細胞Hela中FAL1的表達對人宮頸癌細胞Hela增殖、侵襲及遷移的影響*

石興源，余宏偉，黃文瑾，廖志偉，賈保昌，羅凱

（1.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院，廣東廣州510095；2.廣州醫科大學腫瘤研究所，廣東廣州510095）

沉默人宮頸癌細胞Hela中FAL1的表達對人宮頸癌細胞Hela增殖、侵襲及遷移的影響*

石興源1，余宏偉1，黃文瑾1，廖志偉1，賈保昌1，羅凱2

（1.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院，廣東廣州510095；2.廣州醫科大學腫瘤研究所，廣東廣州510095）

目的探討沉默人宮頸癌細胞Hela中功能基因組趨化基因（FAL1）的表達對人宮頸癌細胞Hela增殖、侵襲及遷移的影響。方法設計并合成FAL1的siR NA片段轉染Hele細胞分別命名為FAL1-siR NA/Hela細胞組和FAL1-NC/Hela細胞組。比較兩組Hela細胞轉染FAL1-siR NA后的FAL1 mR NA相對表達量、光密度（OD）值、穿膜細胞數、遷移距離的差異。結果FAL1-siR NA/Hela細胞的FAL1 mR NA相對表達量（0.49± 0.21）低于FAL1-NC/Hela細胞（1.34±0.13），差異有統計學意義（P<0.05）。FAL1-siR NA/Hela細胞在72、96和120h的OD值分別為（2.04±0.15）、（2.43±0.08）和（2.48±0.15），低于FAL1-NC/Hela細胞的（2.36±0.18）、（3.11±0.27）和（3.44±0.26），差異有統計學意義（P<0.05）；FAL1-siR NA/Hela細胞的穿膜細胞數（126.18± 8.75）個低于FAL1-NC/Hela細胞（208.54±6.75）個，差異統計學意義（P<0.05）；FAL1-siR NA/Hela細胞在24、48和72h的細胞遷移距離為（6.34±1.48）、（11.65±2.52）和（15.08±3.19）μm低于FAL1-NC/Hela細胞的（11.42± 2.73）、（19.56±4.33）和（27.71±5.12）μm，差異有統計學意義（P<0.05）。結論FAL1-siR NA/Hela細胞的FAL1 mR NA相對表達量下降，進而抑制Hela細胞的增殖、侵襲和遷移能力。

宮頸癌；Hela細胞；功能基因組趨化基因siR NA；增殖；侵襲；遷移

R 737.33

A

宮頸癌是臨床上較為常見的婦科惡性腫瘤，雖然宮頸人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）篩查和細胞學篩查，如膜式液基檢測等可以提高宮頸癌的早期篩查成功率，但近年來我國宮頸癌的發病率仍然呈上升趨勢[1]。手術是治療宮頸癌的主要方式，廣泛全子宮切除術聯合盆腔或者髂總淋巴結清掃雖然可以提高患者術后的生存時間，但17.5%的宮頸癌患者術后半年內復發，且臨床分期越晚，復發和局部轉移陽性率越高[2-3]。

腫瘤分子生物學研究表明，基因水平的編碼異?；蛘叻蔷幋a基因產物的調控失衡，往往可以導致細胞增殖、侵襲能力的增強[4]。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）不僅承擔遺傳信息中間載體的輔助性角色，同時更多地承擔各種調控功能。相關研究表明，lncRNA在卵巢癌、肺癌及乳腺癌等惡性腫瘤的早期發生、發展中具有重要的介導作用[5-6]，但對于功能基因組趨化基因（functional genomic approach identifies，FAL1）標志物的異常表達與宮頸癌的增殖和侵襲能力的改變研究不足。本研究通過基因敲除進而沉默FAL1的表達，從而探討FAL1對宮頸癌細胞株Hela的影響，為臨床上控制宮頸癌術后復發和轉移提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1細胞來源

Hela細胞購置于上海交通大學醫學院細胞中心，FAL1-siRNA/Hela細胞和FAL1-NC/Hela細胞由廣州醫科大學基礎實驗室轉染、鑒定和保存。設計并合成FAL1的siRNA片段轉染Hela細胞分別命名為FAL1-siRNA/Hela細胞組和FAL1-NC/Hela細胞組。

1.2細胞培養和轉染方法

Hela細胞用含10%血清的洛斯維帕克紀念研究所改良Eagle培養基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養，置于37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度的培養箱中，2～3 d更換培養基。將8μg待轉重組質粒、10μl Lipafectamine 2000脂質體及無血清的DMEM混勻后于室溫下孵育20 min，均勻滴加于細胞培養皿中，培養6h后，更換完全培養基。

1.3FAL1 mRNA表達的檢測方法

取已消化的細胞懸浮液，10 000 r/min離心，每1 ml Trizol試劑裂解的樣品中加入0.2 ml氯仿，進行裂解操作，采用無酶RNA沖洗液在4℃冰上進行洗滌，10000r/min離心5min，得到RNA?；旌弦涸诩尤肽孓D錄酶（cdna synthesis kit，CSK）前先70℃干浴3min，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60min，室溫放置5min使其完全溶解，使其逆轉錄為cDNA。以肌動蛋白β為模版，在反應體系中加入SYBR Green1染料、正向引物、反向引物、脫氧核糖核苷三磷酸，使總體積達20μl。反應條件為：93℃預變性2 min，93℃變性1min，55℃退火2min，共40個循環。SYBR Green和逆轉錄試劑盒購自南京碧云天生物科技有限公司。

1.4Hela細胞遷移和侵襲實驗方法

Hela細胞以2×105個細胞/小室的濃度小心加入上室，保證上室的無血清培養基量為200μl，下室中加入含有血清的正常培養基500μl，常規培養細胞24h后，進行細胞固定、染色。在100倍顯微鏡下每張片子隨機取5個視野，照相、計數分析穿過小室的細胞數。

1.5細胞增殖檢測

Hela細胞生長至融合度為90%時，用胰蛋白酶乙二胺四乙酸消化液消化細胞，加入適當培養基，吹勻后細胞計數，使細胞最終密度為1×105個/ml，96孔板每孔加入100μl吹勻后的細胞，置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，24 h后每孔加入10μl新型細胞增殖，用活細胞計數法試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（南京凱基生物科技發展有限公司KGA317）檢測毒性溶液，37℃培養箱中孵育2 h，酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度光密度（optical density，OD）值。細胞增長率（%）=（OD值MVs-OD值空白）/OD值空白×100%。

1.6統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，FAL1 mRNA相對表達量、OD值、穿膜細胞數和遷移距離，用均數±標準差（±s）表示，用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Hela細胞轉染FAL1-siRNA后FAL1 mRNA相對表達量

FAL1-siRNA轉染Hela細胞后，兩組FAL1 mRNA相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t= 8.430，P=0.000），FAL1-siRNA/Hela細胞的FAL1 mRNA相對表達量（0.49±0.21）低于FAL1-NC/Hela細胞（1.34±0.13）。

2.2FAL1-siRNA轉染后對Hela細胞增殖的影響

FAL1-siRNA/Hela細胞和FAL1-NC/Hela細胞在48h內的OD值比較，經t檢驗，差異無統計學意義（P>0.05）。FAL1-siRNA/Hela細胞在72、96和120 h的OD值比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P<0.05），FAL1-siRNA/Hela細胞72、96和120 h的OD值低于FAL1-NC/Hela細胞。FAL1-siRNA/Hela細胞在48h后增殖速度明顯受到抑制。見表1。

表1　FAL1-siRNA轉染后對Hela細胞增殖的影響（%±s）

表1　FAL1-siRNA轉染后對Hela細胞增殖的影響（%±s）

組別24 h48 h72 h96 h120 h FAL1-NC/ Hela細胞0.94±0.11 1.73±0.25 2.36±0.18 3.11±0.27 3.44±0.26 FAL1-siRNA/ Hela細胞0.97±0.08 1.78±0.22 2.04±0.15 2.43±0.08 2.48±0.15 t值0.5400.3683.3455.9157.834 P值0.1740.2860.0070.0000.000

2.3FAL1-siRNA轉染后對Hela細胞侵襲能力的影響

兩組穿膜細胞數比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=18.255，P=0.000），FAL1-siRNA/Hela細胞的穿膜細胞數（126.18±8.75）個低于FAL1-NC/Hela細胞（208.54±6.75）個。FAL1-siRNA組穿過濾膜的細胞數目明顯減少，沉默FAL1表達可抑制Hela細胞的侵襲能力。見圖1。

圖1　FAL1-siRNA轉染后對Hela細胞侵襲能力的影響（結晶紫染色×100）

2.4FAL1-siRNA轉染后對Hela細胞遷移距離的影響

兩組24、48和72 h的細胞遷移距離比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P<0.05）（見表2）。FAL1-siRNA組細胞遷移距離明顯縮短，沉默FAL1表達可抑制Hela細胞的遷移能力（見圖2）。

表2　FAL1-siRNA轉染后對Hela細胞遷移距離的影響（μm±s）

表2　FAL1-siRNA轉染后對Hela細胞遷移距離的影響（μm±s）

組別FAL1-NC/Hele細胞24h 11.42±2.73 48h 19.56±4.33 72h 27.71±5.12 FAL1-siRNA/Hele細胞6.34±1.4811.65±2.5215.08±3.19 t值4.0073.8675.128 P值0.0010.0030.000

圖2　FAL1-siRNA轉染后對Hela細胞遷移距離的影響（結晶紫染色×100）

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，原位癌高發年齡為30～35歲，浸潤癌為45～55歲，近年來其發病有年輕化的趨勢。近幾十年宮頸細胞學篩查的普遍應用，使宮頸癌和癌前病變得以早期發現和治療，宮頸癌的發病率和死亡率已明顯下降[7-11]。但臨床上對于宮頸的相關臨床特征進行分析，發現25%左右的早期宮頸癌（宮頸癌臨床分期為Ⅰb1~Ⅱa1）的患者，其子宮宮旁組織的浸潤率可達35%[12-15]，同時根治性手術患者術后盆腔后腹膜和直腸的轉移率可>15%，較高的臨床復發率和術后轉移率促進宮頸癌患者術后病死率上升，同時可降低6～8個月的術后生存時間，預后較差[16-20]?，F階段臨床上術后聯合放、化療已廣泛應用于臨床，但其控制宮頸癌患者術后復發和轉移的整體效果并不理想，且副反應較多，嚴重的并發癥已嚴重影響到患者的生存質量。而腫瘤生物分子靶向治療可以通過對靶基因或者靶分子的沉默和清除，進而抑制下游信號通路或者癌蛋白的轉錄和翻譯，控制宮頸癌殘留細胞的侵襲和轉移[21-23]。

腫瘤基礎研究發現，非編碼RNA在包括宮頸癌在內的多種腫瘤發生、發展中發揮重要作用，使宮頸癌的研究又向前邁進一步，其中lncRNAFAL1可以通過對于穩定PCR1基因調節穩定家族相關非編碼RNA的表達，促進BMI1蛋白末端殘基的磷酸化，并影響轉錄起始區相關增強子和啟動子，促進瘤蛋白P21的表達，影響惡性腫瘤的增殖和轉移[14-26]。腫瘤侵襲能力的改變與上皮間質轉換、E-cadherin、Vimemtin蛋白等的表達具有重要的關系，lncRNA FAL1可以抑制E-cadherin、Vimemtin的表達，降低細胞間的黏附作用，進而促進腫瘤細胞的侵襲能力，以及對于局部臨近組織或者器官的浸潤[27]。本研究的創新性在于首次探討lncRNAFAL1對于宮頸癌細胞株Hela生物學特性的影響，重點探討Hela細胞株增殖和侵襲能力的改變。

本研究發現，在RNA干擾技術沉默lncRNAFAL1的表達后，宮頸癌細胞株Hela的lncRNAFAL1表達下降，FAL1-siRNA/Hela細胞的FAL1 mRNA相對表達量（0.49±0.21）低于FAL1-NC/Hela細胞（1.34± 0.13），提示基因轉染成功。在成功轉染后，觀察組細胞株的細胞增殖能力下降，轉染后48 h后OD值低于對照組，特別是轉染成功96和120 h后，觀察組細胞株Hela的增殖率與對照組比較，差異有統計學意義，表明lncRNAFAL1對于維持Hela細胞的增殖具有重要作用。MENG[28]、鄭春花[29]、袁俐等[30]學者也發現，lncRNAFAL1沉默后24h，即可發現宮頸癌細胞株擴增能力改變，雖然OD值下降<5%，但隨后觀察48h后，OD值可持續下降20%～35%。本研究進一步探討lncRNAFAL1對于宮頸癌細胞株侵襲和轉移能力的影響，在沉默lncRNAFAL1基因后，Hela細胞的穿膜細胞數僅為（126.18±8.75）個，相比于FAL1-siRNA組下降30%左右，表明低表達或者不表達FAL1基因的細胞株，其細胞侵襲能力較低。穿膜細胞數每下降50個，宮頸癌細胞侵襲和局部浸潤即可明顯改善。FAL1-siRNA/Hela的穿膜細胞株下降>70個，進一步表明通過特異性地沉默FAL1基因可以為臨床上控制宮頸癌患者術后復發和轉移提供新的思路。另外，FAL1-siRNA/Hela細胞在24、48和72h的細胞遷移距離下降，其機制可能與FAL1沉默導致E-cadherin、Vimemtin蛋白高表達有關，但仍然需要進一步證實。

綜上所述，沉默FAL1基因后宮頸癌細胞株Hela的生物學特性明顯改變，FAL1-siRNA/Hela細胞的FAL1 mRNA相對表達量下降，可以抑制Hela細胞的增殖、侵襲和遷移能力。針對腫瘤細胞侵襲轉移過程中的關鍵分子進行干涉，可以實現控制宮頸癌術后腫瘤侵襲、轉移。

[1]劉變利,郭霞.高遷移率蛋白1（HMGB1）在宮頸癌中表達及其意義[J].現代儀器與醫療,2015,21(6):86-87.

[2]湯英姿,鄭洪,魏娜,等.XIAP、OMI/HTRA2蛋白對HeLa細胞的影響及兩種蛋白間相互作用[J].臨床與實驗病理學雜志,2012,23(3): 287-291.

[3]翁梅英,洪順家,鄭澄宇.巨噬細胞移動抑制因子在復發性宮頸癌中的表達及其對預后的影響[J].中國病理生理雜志,2013,29(9): 1641-1644.

[4]吳素霞,張賽男,李偉華,等.沉默TNFAIP8基因對宮頸癌HeLa細胞生物學特性的影響[J].腫瘤,2015,33(11):1208-1215.

[5]肖艷,成慧君,王莉.貝伐珠單抗聯合化療治療復發及轉移性子宮頸癌的安全性及近期療效觀察[J].中華婦產科雜志,2015,26(3): 223-224.

[6]楊慧,余敏敏,陸曉媛.長鏈非編碼RNA在宮頸癌及宮頸上皮內瘤樣病變中的表達[J].江蘇醫藥,2014,34(22):2685-2688.

[7]ZHANG Y H,WANG J J,LI M,et al.Matrix metallopeptidase 14 plays an important role in regulating tumorigenic gene expression and invasion ability of Hela cells[J].Int J Gynecol Cancer,2016,26(3):600-606.

[8]SHI C,ZHANG G,HAN B,et al.Effects of alpha1-PDX,a furin inhibitor,on growth,invasion,and tumorigenicity of cervical cancer Hela cells[J].Journal of Southern Medical University,2015, 35(3):432-436.

[9]LU J N,LEE W S,YUN J W,et al.Anthocyanins from vitis coignetiae pulliat inhibit cancer invasion and epithelial-mesenchymal transition,but these effects can be attenuated by tumor necrosis factor in human uterine cervical cancer Hela cells[J].E-vid Based Complement Alternat Med,2013,20(06):90-93.

[10]張金曉,張瑞,汪蓓蕾,等.雙啟動子shRNA表達載體對hTERT和bcl-2基因表達的抑制作用[J].天津醫藥,2012,43(5):480-482.

[11]張乃懌,高雨農,燕鑫,等.具復發危險因素的ⅠB1～ⅡA期宮頸癌術后輔助化療的療效和安全性評價[J].實用婦產科雜志,2014, 30(1):21-25.

[12]張艷梅,陳曉忠.長鏈非編碼RNA HOTAIR在宮頸癌中的表達及其對宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡的影響[J].腫瘤,2015,33(4): 446-452.

[13]朱麗紅,高燕,朱瑾.子宮頸癌細胞中HOXA10、NF-κB對MMP-9基因的調控作用[J].中華婦產科雜志,2015,24(2):144-145.

[14]李菲菲,唐慧子,吳猛猛,等.宮頸癌中SOCS-1表達的研究新進展[J].現代生物醫學進展,2015,15(7):1383-1385.

[15]ARTINI M,SCOARUGHI G L,CELLINI A,et al.Holo and apo-transferrins interfere with adherence to abiotic surfaces and with adhesion/invasion to Hela cells in staphylococcus spp[J]. Biometals,2012,25(2):413-421.

[16]葉裕豐,陳秋梅,向之明,等.磁共振灌注加權成像在宮頸癌表現特點的研究[J].磁共振成像,2015,6(4):299-303.

[17]劉唯,吳素慧,史曉峰,等.RNA干擾沉默MIF基因對宮頸癌SiHa細胞上皮細胞間質變的影響[J].中國腫瘤,2014,23(11):956-960.

[18]劉洪麗.TMPyP_4光動力療法聯合核仁素沉默對人宮頸癌SiHa細胞殺傷作用的研究[D].山東:山東大學,2014.

[19]趙紅珂,莫凌昭.慢病毒介導的siRNA沉默hTERT基因對宮頸癌Caski細胞增殖和凋亡的影響[J].廣西醫學,2015,5:599-602.

[20]江艷.MALAT1對宮頸癌細胞生物學表型的影響[D].湖南:中南大學,2014.

[21]鄭海燕,阮健,潘玲蘭,等.溶酶體組織蛋白酶L對人宮頸癌細胞Hela遷移及侵襲能力的影響[J].廣東醫學,2014,35(22):3460-3463.

[22]任卉.Survivin基因沉默對Hela細胞凋亡、細胞周期和啟動子甲基化的影響[D].廣東:廣東醫學院,2015.

[23]張德太,左曙蓉,楊文,等.siRNA沉默轉酮醇酶樣基因1下調人宮頸癌細胞HIF-α表達及糖酵解關鍵酶活性[J].中國病理生理雜志,2014,30(1):72-76.

[24]潘巍巍,徐營,曹利仙,等.shRNA介導的hWAPL表達沉默對人宮頸癌CaSki細胞增殖與凋亡的影響[J].中國病理生理雜志,2013, 29(7):1213-1218.

[25]吳琦,于紅,張文卿.siRNA沉默SIRT1基因對宮頸癌細胞HeLa增殖和凋亡的影響[J].微生物學雜志,2014,34(3):47-51.

[26]王平,劉珊,程波,等.siRNA介導的HPV16E6/E7基因沉默對宮頸癌SiHa增殖及凋亡的影響[J].診斷病理學雜志,2015,22(12): 781-786.

[27]陳雪,李欣,高福祿,等.MTT與HOECHST染色法檢測膜聯蛋白A7基因沉默對Hela細胞的影響[J].中國臨床解剖學雜志,2014, 32(1):57-60.

[28]MENG F,CHEN X,SONG H,et al.LAPTM4B down regulation inhibits the proliferation,invasion and angiogenesis of HeLa cells in vitro[J].Cell Physiol Biochem,2015,37(3):890-900.

[29]鄭春花,付艷.RNA干擾技術在宮頸癌中應用進展[J].中華實用診斷與治療雜志,2014,28(7):625-626.

[30]袁俐,姜忠敏,盛鳳,等.聚酰胺-胺介導耐藥基因ABCG2沉默策略治療宮頸癌側群細胞[J].國際婦產科學雜志,2015,42(3):273-276.

（童穎丹編輯）

Effect of silencingFAL1expression on proliferation，invasion and migration of human cervical carcinoma Hela cells*

Xing-yuan Shi1，Hong-wei Yu1，Wen-jin Huang1，Zhi-wei Liao1，Bao-chang Jia1，Kai Luo2
（1.The Affiliated Cancer Hospital，2.Cancer Institute，Guangzhou Medical University，Guangzhou，Guangdong 510095，China）

Objective To study the effects of silencingFAL1expression on the proliferation，invasion and migration of the human cervical carcinoma Helacells.MethodsSiRNAFAL1fragmentwasdesigned，synthesized and transfected into Hela cells，which were namedFAL1-siRNA/Hela cell group andFAL1-NC/ Hela cell group.The differences inFAL1mRNA relative expression，OD value，number of transmembrane cells and migration distance were compared between the two groups after transfection.Results The relative expression ofFAL1mRNA in theFAL1-siRNA/Hela cells（0.49±0.21）was significantly lower than that of FAL1-NC/Hela cells［（1.34±0.13），P＜0.05］.The OD value of theFAL1-siRNA/Hela cells in 72，96 and 120 h［（2.04±0.15），（2.43±0.08）and（2.48±0.15）respectively］was significantly lower than that of the FAL1-NC/Hela cells［（2.36±0.18），（3.11±0.27）and（3.44±0.26）respectively，P＜0.05］.The number of transmembrane cells in theFAL1-siRNA/Hela cells（126.18±8.75）was significantly smaller than that of the FAL1-NC/Hela cells［（208.54±6.75），P＜0.05］.The cell migration distance of theFAL1-siRNA/Hela cells in24，48 and 72 h［（6.34±1.48），（11.65±2.52）and（15.08±3.19）μm respectively］was significantly shorther than that of theFAL1-NC/Hela cells［（11.42±2.73），（19.56±4.33）and（27.71±5.12）μm respectively，P＜0.05］.Conclusions The relative expression ofFAL1mRNA in theFAL1-siRNA/Hela cells decreases，which inhibits proliferation，invasion and migration of Hela cells.

cervical carcinoma；Hela cell；FAL1-siRNA；proliferation；invasion；migration

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.007

1005-8982（2016）17-0034-05

2016-04-08

廣州醫科大學青年基金（No：2013A45）