濃香型和醬香型大曲微生物多樣性分析

黃曉寧，黃晶晶，李兆杰，韓北忠*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院食品質量與安全北京實驗室，北京100083；2.中國檢驗認證集團北京有限公司，北京100026）

濃香型和醬香型大曲微生物多樣性分析

黃曉寧1，黃晶晶2，李兆杰1，韓北忠1*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院食品質量與安全北京實驗室，北京100083；2.中國檢驗認證集團北京有限公司，北京100026）

大曲是中國白酒釀造過程中的糖化發酵劑，具有自然接種的特點。為探究同一酒廠濃香型和醬香型大曲微生物群落組成，分別采用傳統培養和聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳法（PCR-DGGE）對其微生物進行分析鑒定。傳統培養法共分離鑒定出198株菌，其中濃香型大曲中24種，醬香型大曲12種。兩種大曲中地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）數量占絕對優勢，在濃香型大曲中優勢真菌為謝瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri）和米曲霉（Aspergillus oryzae），而在醬香型大曲中，以傘狀毛霉（Lichtheimia corymbifera）和多變擬青霉（Paecilomyces variotii）居多；通過PCR-DGGE共鑒定出14種菌，兩種大曲中葡萄球菌（Staphylococcus）、高溫放線菌（Thermoactinomyces）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）為優勢菌。

大曲；微生物多樣性；傳統培養；聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳

大曲又稱塊曲或磚曲，形似磚塊，大小不等，是中國白酒在釀造過程中使用的糖化劑、發酵劑和酶制劑，一般以小麥、大麥或高粱為原料。盡管大曲種類繁多，但其制作基本可歸納為原料配比、粉碎和攪拌、成型、培曲、儲存這五個步驟［1］。大曲微生物在利用自身酶系進行代謝的同時也將其反應產生的香氣物質帶入白酒中，形成白酒獨特風味，如在發酵過程中形成的氨基酸類物質在酒體風味形成的過程中具有重要貢獻，氨基酸進行脫氨基反應生成醇類，這些高級醇再與酸進行酯化反應生成酯類，形成了白酒風味的主體成分［2］。目前對于大曲中微生物多樣性的研究主要集中在單一酒廠的單一曲，如茅臺酒大曲作為醬香型大曲代表，內部細菌和真菌分布通過表型和傳統的生化鑒定得到芽孢桿菌屬為最優勢細菌，曲霉屬為最優勢真菌［3］，以瀘州老窖大曲作為濃香型大曲代表，采用構建細菌16S rRNA基因克隆文庫得知優勢群落為魏斯氏菌、高溫放線菌和乳酸桿菌［4］。

研究選用同一酒廠濃香型和醬香型大曲作為研究對象，其制曲頂溫分別達到60℃和65℃，旨在分析同一廠區兩種不同類型大曲中微生物多樣性差異，采用了傳統培養法結合聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE），該技術能夠快速鑒定環境中不可培養的微生物種群［5］，與傳統培養有互補作用，同時對優勢菌群的功能進行了初步探究。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原料

南方某酒廠濃香型和醬香型大曲樣品各2 kg，均為粉末或麩皮基質碎屑，樣品置于4℃冷藏條件下儲存。

1.1.2培養基

平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基，結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（violet red bile glucose agar，VRBGA）培養基，乳酸細菌培養基（MRS培養基），孟加拉紅（rose bengal agar，RBA）培養基，麥芽汁瓊脂（malt extract agar，MEA）培養基：北京奧博星生物技術有限公司。

1.1.3主要試劑

ExTaqDNA聚合酶等PCR體系用試劑：大連Takara公司；細菌、酵母菌DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司。

1.2儀器與設備

DHP-9052生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；ZDZX-40B1高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；TGL-16B冷凍離心機：上海安亭有限責任公司；Dcode system 170-9081 DGGE電泳儀：美國BIO-RAD公司；LMS-26凝膠圖像分析系統：美國UVP公司；AG 223B1 PCR儀：德國EPPENDORF公司。

1.3方法

1.3.1傳統培養法

取兩種大曲樣品各10 g用無菌水作梯度稀釋，選擇合適稀釋倍數的稀釋液，每個稀釋度3個平行，按照以下方法進行操作。

總好氧性細菌總數、嗜熱菌總數：分別在30℃和55℃選用PCA培養基培養；細菌芽孢孢子總數、嗜熱細菌芽孢孢子總數：將菌懸濁液至于80℃水浴中熱處理后，選用PCA進行培養計數；乳酸菌總數：采用MRS，培養基加入終質量濃度為500 μg/mL的納他霉素；腸桿菌：采用VRBGA培養基；真菌：分別選用MEA和RBCA培養基（含氯霉素100 μg/mL）培養。真菌均為涂布培養，細菌均為傾注培養。

在平板上劃線純化兩次后，采用細菌和酵母菌基因組提取試劑盒提取純菌DNA，基于細菌16S rRNA基因序列，真菌ITS1-5.8S-ITS2序列進行分子生物學分類鑒定。所用引物序列：

細菌上游引物B-for：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

細菌下游引物B-rev：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′［6］

真菌上游引物ITS1-for：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'

真菌下游引物ITS4-rev：5′-TCCTCCGCTTATTGATAT-GC-3′［7］

25 μL PCR反應體系如下：10×PCR buffer 2.5 μL，脫氧核糖核酸三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTPs）（10 mmol/L）2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，ExTaqDNA酶0.13 μL，ddH2O 18.37 μL，基因組DNA（10 ng/μL）1 μL。細菌PCR反應條件：94℃、5 min，94℃、30 s，45℃、30 s，72℃、1 min，35個循環；72℃、7min；真菌PCR反應條件：95℃、5min，95℃、60 s，52℃、45 s，72℃、1 min，30個循環，72℃、7 min。

1.3.2PCR-DGGE培養

酚-氯仿抽提法進行大曲基因組DNA提取［8］。將所得DNA稀釋到1～50 ng/μL，進行PCR擴增，DGGE后采用銀染法染色［9］，然后用Quantity One 4.6.2軟件進行校對成像，切膠后，加入50 μL超純水，4℃靜置過夜，取上清液進行PCR擴增，測序。

2　結果與分析

2.1選擇性培養基菌落計數結果

通過不同培養基和培養條件，計數結果如圖1所示。由圖1可知，濃香型大曲細菌整體數量比醬香型大曲高一個數量級，但兩種大曲的真菌數量無顯著性差異。濃香和醬香型大曲中細菌孢子的數量與細菌總數無顯著性差異，其原因可能是這兩種大曲中的細菌主要以芽孢桿菌為主。濃香型大曲的好氧細菌和芽孢孢子的數量在30℃培養時要多于55℃，但是醬香型大曲中，兩者并無顯著性差異。通過對比真菌數量可知，用RBA培養基培養所得的真菌數量要多于MEA培養基。乳酸菌總數和腸桿菌總數遠小于細菌總數，這說明乳酸菌和腸桿菌在大曲的制作過程中不是優勢菌種。由于濃香型和醬香型大曲制曲溫度都較高，所以其中的微生物數量低于低溫大曲，如汾酒大曲微生物數量對數值低1～2［9］。

圖1　兩種大曲中不同微生物的數量Fig.1 Microbial count of two kinds of Daqu

2.2菌落分子鑒定結果

通過純化培養后，共挑選出了198個單菌落進行鑒定。其中濃香型大曲中共分離得到24種微生物，醬香型大曲中共分離得到12種。由表1、表2可知，濃香型和醬香型大曲中最為優勢的細菌均為芽孢桿菌，尤其是以地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌居多。在濃香型大曲中，芽孢桿菌占總細菌數量的73%，其中地衣芽孢桿菌占所有芽孢桿菌數量的68%。在醬香型大曲中，芽孢桿菌占總細菌數量的92%，其中地衣芽孢桿菌占所有芽孢桿菌數量的51%。據ZHENG X W等［9］的研究可知，汾酒大曲中芽孢桿菌占總細菌數量的57%，由于汾酒大曲為低溫大曲，所以可推測在不同種大曲制作時，制曲溫度越高，成曲樣品中芽孢菌的比例增加。由表3、表4可知，濃香型大曲中最為優勢的真菌為曲霉屬，以謝瓦氏曲霉和米曲霉數量最多。而在醬香型大曲中，以傘狀毛霉和多變擬青霉居多。濃香型大曲中的微生物種類較醬香型較多，可能是由于其制曲溫度較醬香型較低。但是在兩種大曲中均未分離得到酵母菌。

表1　濃香型大曲中細菌種類Table 1 Bacterial diversity in strong-flavorDaqu

表2　醬香型大曲中細菌種類Table 2 Bacterial diversity in sauce-flavorDaqu

表3　濃香型大曲中真菌種類Table 3 Fungal diversity in strong-flavorDaqu

表4　醬香型大曲中真菌種類Table 4 Fungal diversity in sauce-flavorDaqu

2.3PCR-DGGE分析細菌和真菌類群

采用Quantity One 4.6.2對DGGE圖譜（圖2a、圖3a）進行分析，得到條帶強度示意圖（圖2b、3b）。直觀上看，兩種大曲的細菌和真菌圖譜分別相似，由表5可知，切膠測序后，共鑒定出8種細菌，其中葡萄球菌屬、高溫放線菌屬和地衣芽孢桿菌在兩種大曲中均為優勢菌，同時在醬香型大曲中耐酸乳桿菌也較為優勢；鑒定出6種真菌，在兩種大曲中，傘狀毛霉和多枝橫梗霉為優勢菌。通過PCR-DGGE檢測到了兩種酵母菌，分別是扣囊復膜酵母和庫氏畢赤酵母，但是在傳統培養法中沒有分離得到，推測是由于制曲時溫度高，酵母菌的高溫耐受性相對較差造成的。同樣在PCR-DGGE中測到的葡萄球菌屬也在傳統培養中沒有分離得到，可能是由于葡萄球菌屬大多為兼性厭氧或者不可培養，所以在PCA平板上未分離出來，或者由于制曲溫度較高，葡萄球菌屬后期大量死亡造成的，高溫大曲在制曲過程中的溫度可高達65℃，絕大多數酵母菌和不耐高溫的細菌死亡，只有耐高溫的細菌可以繼續生長，所以在傳統培養法中芽孢桿菌優勢明顯。在細菌DGGE指紋圖譜中切膠測序成功的5條帶都為泛生菌屬，與LI P等［11］通過PCR-DGGE對醋曲微生物多樣性的檢測中也得到泛生菌屬結論一致。

圖2　濃香型和醬香型大曲細菌DGGE指紋圖譜（a）及其條帶示意圖（b）Fig.2 DGGE fingerprint（a）and band sketch diagram（b）of bacteria in strong-flavor and sauce-flavorDaqusamples

圖3　濃香型和醬香型大曲真菌DGGE指紋圖譜（a）及其條帶示意圖（b）Fig.3 DGGE fingerprint（a）and band sketch diagram（b）of fungi in strong-flavor and sauce-flavorDaqusamples

表5　DGGE指紋圖譜切膠條帶的鑒定結果Table 5 Sequencing results of selected bands from the DGGE fingerprint

續表

地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽胞桿菌等都可以分泌多種具有淀粉水解能力的酶，促進淀粉轉變為可發酵糖類，為白酒生產的第二階段，酒精發酵階段產生底物。同時，芽孢桿菌屬細菌可以產生吡嗪、芳香族類、有機酸類物質，它們可能對白酒的風味產生重要作用［12］。ZHANG R等［13］研究了地衣芽孢桿菌在固態發酵中對白酒風味的影響，發現經過強化發酵后蒸餾的白酒，香氣增加，品質提高。在發酵食品中，有時會檢測到葡萄球菌屬，但同時該屬的細菌常被認為是一種食源性致病菌，事實上，葡萄球菌屬的大多數菌種是無害的，如本研究PCR-DGGE中鑒定的腐生葡萄球菌，GUAN L等［14］研究發現葡萄球菌屬的細菌參與了一種韓國腌制的海鮮食品的發酵過程，他們認為，葡萄球菌屬雖然蛋白水解能力弱，但可能在食品發酵后期對風味的形成有重要作用。在傳統培養和DGGE中均檢測到曲霉屬真菌，醬香型大曲中以傘狀毛霉和多變擬青霉為主，DGGE中檢測到兩種大曲中多枝橫梗霉均為優勢菌。霉菌能夠分泌大量的淀粉酶和蛋白酶從而將復雜的淀粉轉化為糖，蛋白質轉化為多肽或氨基酸，然后被酵母和乳酸菌等細菌在發酵中所利用。CHEN B等［15］研究茅臺酒生產中真菌多樣性發現，米曲霉和多變擬青霉為優勢微生物，其中米曲霉產淀粉酶的能力在其分離所得真菌中最高，而多變擬青霉具有最高的產葡萄糖淀粉酶的能力。通過傳統培養法在濃香型大曲中檢測到了嗜熱放線菌，通過PCR-DGGE在兩種大曲中均檢測到了高溫放線菌屬，推測在制曲原料中帶入了高溫放線菌，又由于制曲過程中營養物豐富，使得放線菌可以存活甚至繁殖。在SU Y等［16］的研究中發現，芝麻香型酒大曲中，高溫放線菌屬為優勢菌屬，芝香型大曲也屬于高溫大曲。高溫放線菌科屬于芽孢桿菌目，其在稻草、秸稈及一些高溫環境中均有發現，并且其孢子具有很好的抗藥性［17］，同時檢測到嗜熱放線菌具有多種酯酶、堿性磷酸酶、脂肪酸酶［18］，所以該菌屬可能在高溫大曲中有重要作用，需要結合酶學進行進一步的研究證實。在兩種大曲中均檢測得到根瘤菌屬、曲霉屬，在濃香型大曲中還檢測到歐文氏菌屬，LI P等［19］在醋曲的研究中發現會這三個屬的微生物均能編碼β-葡萄糖苷酶基因，對分解原料中纖維素類物質有很大作用，同時LOPEZ M C等［20］研究表明β-葡萄糖苷酶與酒體風味的形成有關，主要參與形成烯萜類化合物，賦予葡萄酒特征香氣，所以推測該酶在白酒香氣形成中也具有重要作用。

3　結論

以同一酒廠濃香型和醬香型大曲為研究對象，采用傳統培養法、PCR-DGGE系統地分析了兩種大曲中微生物多樣性。在傳統培養法中，細菌組成均是以地衣芽孢桿菌占絕對優勢，真菌組成在兩種大曲中差異較大，濃香型大曲中，以米曲霉和謝瓦氏曲霉較為優勢，而在醬香型大曲中，以傘狀毛霉和多變擬青霉居多。通過PCR-DGGE可知，兩種大曲DGGE圖譜非常相似，均以葡萄球菌屬、高溫放線菌屬、地衣芽孢桿菌和多枝橫梗霉為優勢菌。由于這兩種大曲來自同一廠區，環境微生物相差不大，濃香型和醬香型大曲在組成上比較相似，但因其制作過程和制曲溫度不同，又體現出了部分微生物的差異性尤其在真菌種類上較為明顯，對大曲微生物組成以及白酒風味和制曲地理位置的關系進行了初步探究。

致謝：感謝“中國白酒3C計劃”項目提供樣品和資金支持。

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Microbial diversity analysis in strong-flavor and sauce-flavorDaqu

HUANG Xiaoning1，HUANG Jingjing2，LI Zhaojie1，HAN Beizhong1*
（1.Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，College of Food Science&Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；2.China Certification&Inspection Group Beijing Co.，Ltd.，Beijing 100026，China）

Daquis used as saccharifying and fermenting agent for Chinese liquor production，and it is typically obtained from natural fermentation. The microbial diversity ofDaqufrom a distillery，starters for strong-flavor and sauce-flavor liquor was investigated by both culture-dependent method and PCR-denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）.A total of 198 microbial strains were isolated and identified，including 24 strains from strong-flavorDaquand 12 strais from sauce-flavor Daqu，and Bacillus licheniformis was the absolute dominant specie in both Daqu.In strong-flavor Daqu，Aspergillus chevalieriandAspergillus oryzaewere dominant genus，meanwhile in sauce-flavorDaqu，Lichtheimia corymbiferaandPaecilomyces variotiiwere dominant.14 species were identified by PCR-DGGE，Staphylococcus，Thermoactinomyces，Bacillus licheniformisand Lichtheimia ramosawere dominant in bothDaqu.

Daqu；microbial diversity；culture-dependent；PCR-DGGE

TS261.1

0254-5071（2016）09-0033-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.008

2016-06-29

高等學校博士學科點專項科研基金資助課題（20130008110013）

黃曉寧（1992-），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物學。

韓北忠（1961-），男，教授，博士，研究方向為食品微生物學與發酵工程。