葡糖醋桿菌RZS01發酵產細菌纖維素的研究

許云華，馬　波，，張　衡，羅　麗，張　雷，鄭　霞

（1.連云港師范高等專科學校 生命科學系，江蘇 連云港 222006；2.南京理工大學 化學生物功能材料研究所江蘇 南京 210094）

葡糖醋桿菌RZS01發酵產細菌纖維素的研究

許云華1，馬波1，2，張衡2，羅麗1，張雷1，鄭霞1

（1.連云港師范高等專科學校 生命科學系，江蘇 連云港 222006；2.南京理工大學 化學生物功能材料研究所江蘇 南京 210094）

采用葡糖醋桿菌（Komagataeibacter nataicola）RSZ01進行細菌纖維素發酵試驗，利用單因素和正交試驗對發酵培養基組成進行優化，并研究了菌株保藏時間、接種量和培養基初始pH對BC產量的影響。結果表明，保藏期限在30 d以內的菌種可基本保證BC產量；在接種量為8%、初始pH值為5.2時，最優發酵培養基組成為：葡萄糖2.50%，蔗糖3.00%，玉米漿2.2%，磷酸二氫鉀0.35%，硫酸銨0.125%。在此條件下，葡糖醋桿菌RSZ01發酵產細菌纖維素的產量為12.05 g/L。

葡糖醋桿菌RSZ01；細菌纖維素；發酵；條件優化

近十多年來，由微生物發酵產生的純天然細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）獲得了生物、材料、食品等實驗室研究人員的密切關注［1-3］。它具有的許多優良的特性使其已應用于食品［4］、造紙［5-6］、組織工程［7］、醫用敷料［8-9］等行業。然而，更高附加值的動態發酵絮狀細菌纖維素的廣泛應用卻嚴重地受制于其易突變不穩定的菌株及較低的產量［10］。目前，BC的靜態發酵工藝較為成熟，海南等地已可小批量進行工業化發酵生產。相對動態發酵，靜態發酵的BC產量較高，但同時存在發酵周期長、占地面積大、產品應用范圍較小等缺點，導致其生產成本高，工業化生產規模受限。而對于BC的純動態發酵，盡管已有研究人員通過小試和中試試驗研究解決搖瓶產量較低的問題，但迄今為止尚未完全形成細菌纖維素純動態發酵的產業化生產。究其原因，不難發現影響BC動態發酵的主要問題如產量低、成本高、高產穩定生產菌種缺乏、生產工藝不穩定等仍未被完全解決。國內外的研究人員已從產BC的菌種篩選與復壯［11-13］和培養基組成與培養條件［14-16］等方面開展了大量的研究工作，最近國內有關研究主要集中在廉價碳源和氮源的應用［17-19］等方面，然而其產量基本集中在5 g/L以下，不利于實現工業化生產。因此，為進一步提高其纖維素動態發酵產量、探究如何保持菌株高產特性，本研究采用實驗室保藏菌株葡糖醋桿菌（Komagataeibacter nataicola）RSZ01進行產細菌纖維素的動態發酵實驗研究，以期為實現我國細菌纖維素的動態發酵工業化生產奠定堅實基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

葡糖醋桿菌（Komagataeibacter nataicola）RZS01（保藏編號為CGMCC 10961）：南京理工大學化學生物功能材料研究所篩選并保藏。

1.1.2試劑

葡萄糖、蔗糖、硫酸銨、冰乙酸、檸檬酸、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、羧甲基纖維素鈉（分析純）、蛋白胨、酵母粉（生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；玉米漿（生化試劑）：上海西王淀粉糖有限公司。

1.1.3培養基［20］

斜面保藏培養基：葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，檸檬酸1.5 g/L，磷酸二氫鈉2.5 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂18 g/L，酵母粉0.1 g/L，pH 6.0；

種子培養基：葡萄糖20 g/L，硫酸銨6 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，蛋白胨3 g/L，酵母粉2.25 g/L，羧甲基纖維素鈉0.4 g/L，自然pH；

發酵培養基：葡萄糖22 g/L，蔗糖27 g/L，玉米漿18 g/L，硫酸銨1 g/L，磷酸二氫鉀4 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，檸檬酸0. 6 g/L，醋酸1.0 mL/L，pH 5.2。

在進行培養或發酵前，上述培養基均應在滅菌鍋中以121℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.2儀器與設備

YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；QHZ-98A恒溫振蕩培養箱：太倉市華美生化儀器廠；PH5-3CpH計：雷磁儀電科學儀器廠；XZ-21K離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司；XMTD-8222烘箱：上海精宏實驗設備有限公司；LWD300-38LT顯微鏡：上海測維光電技術有限公司。

1.3方法

1.3.1培養方法

將保藏于斜面培養基上的菌種接種至滅菌并冷卻的種子培養基中，于30℃、160r/min的恒溫培養振蕩箱中培養2 d，制備得到葡糖醋桿菌種子液。將種子液以一定比例的接種量接種至發酵培養基中，于30℃、160 r/min的恒溫培養振蕩箱中培養7 d，過濾除去殘留的發酵液。

1.3.2菌株保藏時間對細菌纖維素產量的影響

以實驗室4℃冰箱中菌種的不同保藏時間（0、10d、20d、30 d、40 d、50 d、60 d）進行對比試驗，30℃、以160 r/min的轉速下動態發酵7 d，測定細菌纖維素產量，考察菌種保藏時間對細菌纖維素產量的影響。

1.3.3單因素試驗

考察不同碳源（其中葡萄糖質量分數從0到3.50%，間隔0.25%；蔗糖質量分數從0.75%到4.00%，間隔0.25%）、氮源（其中玉米漿質量分數從0到2.2%，間隔0.2%；硫酸銨質量分數從0到0.300%，間隔0.025%）、無機鹽（其中磷酸二氫鉀質量分數從0到0.50%，間隔0.05%）；接種量（6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%）、初始pH值（4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0）對細菌纖維素產量的影響。

1.3.4正交試驗

為考察不同培養基組分對細菌纖維素產量的影響，在單因素試驗的基礎上，選取葡萄糖、蔗糖、玉米漿、硫酸銨和磷酸二氫鉀為考察因素，以細菌纖維素產量為評價指標，設計5因素4水平正交優化試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1　培養基組分優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium components optimization

1.3.5細菌纖維素產量的測定［24］

從發酵培養基中取細菌纖維素，過濾除去發酵液，收集絮狀BC并分散在含3‰NaOH和3‰H2O2的水溶液中，于80℃水浴鍋中處理2～4 h。用流動的自來水將細菌纖維素中殘留的堿液沖洗干凈，至pH值為中性后，將BC放置于80℃的干燥箱中干燥12 h，至質量恒定，計算每升發酵液中所含有的BC干質量即為BC產量。

2　結果與分析

2.1菌種保藏時間對細菌纖維素產量的影響

菌種保藏時間對細菌纖維素產量的影響，結果見表2。

表2　菌種保藏時間對細菌纖維素產量的影響Table 2 Effect of strain preservation time on the yield of bacterial cellulose

由表2可知，該菌種在4℃條件下，保藏超過30 d時，菌種產細菌纖維素滯后，且產量也有所減少。即實驗中應該使用新復壯的、保藏時間在1個月內的菌種較為合適。

2.2單因素試驗結果

2.2.1碳源質量分數對細菌纖維素產量的影響

分別選用葡萄糖、蔗糖為唯一碳源，考察發酵液中碳源質量分數對細菌纖維素產量的影響，結果見圖1。由圖1可知，隨著葡萄糖質量分數的增大，細菌纖維素產量呈先增加后減少的趨勢，當葡萄糖質量分數為2.25%時，細菌纖維素產量達到最大，為12 g/L；繼續增加葡萄糖質量分數，細菌纖維素產量逐漸下降。這可能是由于葡萄糖在發酵合成細菌纖維素過程中作為營養物質和能源物質，被菌體快速利用，滿足菌體的代謝，促進細菌纖維素的產生；隨著葡萄糖質量分數的繼續增加，滲透壓增大，不利于菌體的新陳代謝，從而限制細菌纖維素的產生；蔗糖的加入對細菌纖維素產量影響相對葡萄糖較小，可能是由于蔗糖屬于遲緩型碳源，較難被菌體利用，在有葡萄糖存在的培養液中隨蔗糖質量分數的增加，細菌纖維素產量增加相對緩慢。因此選擇葡萄糖和蔗糖最佳的質量分數分別為2.75%、2.25%進行正交試驗。

圖1　發酵液中碳源質量分數對細菌纖維素產量的影響Fig.1 Effect of carbon source concentration in fermentation liquid on the yield of bacterial cellulose

2.2.2氮源質量分數對細菌纖維素產量的影響

選用玉米漿、硫酸銨為唯一氮源，考察發酵液中氮源質量分數對細菌纖維素產量的影響，結果見圖2。由圖2可知，以硫酸銨為無機氮源時，隨著硫酸銨質量分數的增加，細菌纖維素的產量呈現先增加后下降的趨勢，當硫酸銨質量分數為0.100%時，BC產量達到最大；繼續增加發酵液中硫酸銨質量分數，可能導致發酵過程中pH的下降，進而抑制菌體的生長和細菌纖維素的合成。

圖2　發酵液中無機氮源和有機氮源質量分數對細菌纖維素產量的影響Fig.2 Effects of inorganic and organic nitrogen source concentration in fermentation liquid on the yield of bacterial cellulose

以玉米漿為氮源時細菌纖維素產量在一定范圍內隨玉米漿質量分數的升高而增加，可能是因為玉米漿中含有多種氨基酸、肽及生長因素，有利于菌體生長代謝和產物的積累，當玉米漿質量分數為1.8%時，BC產量達到最大值；繼續增加玉米漿質量分數，BC產量不再增加，可能是有機氮太多，菌種生長旺盛而不利于產物積累。因此確定硫酸銨和玉米漿的最佳質量分數分別為0.100%和1.8%進行正交試驗。

2.2.3發酵液中無機鹽質量分數對細菌纖維素產量的影響

選用磷酸二氫鉀為無機鹽時，考察發酵液中無機鹽質量分數對細菌纖維素產量的影響，結果見圖3。由圖3可知，隨著磷酸二氫鉀質量分數的增加，BC產量呈現上升的趨勢，當磷酸二氫鉀質量分數達到0.40%時，細菌纖維素的產量達到最高值（11.3 g/L）；而當磷酸二氫鉀質量分數繼續增加時，BC產量開始下降。其原因可能是由于磷、鉀參與細胞結構組成，并與能量轉移等功能有關，添加適量的磷酸二氫鉀能促進菌體的代謝，可以提高細菌纖維素的產量。因此選擇磷酸二氫鉀的最佳質量分數為0.40%進行正交試驗。

圖3　發酵液中磷酸二氫鉀質量分數對細菌纖維素產量的影響Fig.3 Effect of monopotassium phosphate concentration in fermentation liquid on the yield of bacterial cellulose

2.2.4接種量和發酵培養基初始pH對細菌纖維素產量的影響

圖4　發酵液接種量和初始pH對細菌纖維素產量的影響Fig.4 Effects of inoculum and initial pH of fermentation liquid on the yield of bacterial cellulose

考察接種量和初始pH值對細菌纖維素產量的影響，結果如圖4所示。由圖4可知，隨著培養基的初始pH值的增大，細菌纖維素的產量先增加，在初始pH值為5.2時，BC產量達到最大值（11.2 g/L）。當初始pH值繼續增加時，細菌纖維素產量略有下降。此外，發酵液的初始pH高易出現染菌現象。因此選擇最佳初始pH值為5.2。當接種量由6%逐漸增加至8%時，細菌纖維素的產量也呈現逐步升高趨勢，當接種量為8%時，BC產量達到最大值11.5g/L；繼續加大接種量，BC產量開始下降，其原因可能是接種量過大時，培養液的菌濃度較高，對基質消耗過多，不利于產物的積累，從而使得細菌纖維素產量降低。因此確定最佳初始pH為5. 2，最佳接種量為8%。

2.3正交試驗結果分析

結合單因素試驗結果，以細菌纖維素產量為評價指標，選取葡萄糖、蔗糖、玉米漿、硫酸銨、磷酸二氫鉀5因素進行正交試驗優化，正交試驗結果與分析見表3，方差分析結果見表4。

表3　培養基組分優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for medium components optimization

表4　正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3中R值的大小得知，各因素對細菌纖維素產量影響的順序依次為C＞D＞A＞E＞B，即葡萄糖的影響最大，蔗糖次之，之后是玉米漿、磷酸二氫鉀和硫酸銨。葡糖醋桿菌RSZ01發酵產細菌纖維素的最優方案為A4B4C4D3E2，即葡萄糖2.50%、蔗糖3.00%、玉米漿2.2%、磷酸二氫鉀0. 35%、硫酸銨0.150%。由表4可知，葡萄糖對BC產量影響最顯著（P＜0.1），與極差分析結果相一致。在此最佳條件下進行驗證試驗，葡糖醋桿菌RSZ01發酵產細菌纖維素的產量為12.05 g/L。

3　結論

本研究為提高葡糖醋桿菌（Komagataeibacternataicola）RSZ01發酵產細菌纖維素產量，采用單因素和正交試驗對發酵培養基組成進行了優化，并研究了菌株保藏時間、接種量和培養基初始pH對BC產量的影響。結果表明，保藏期限在30 d以內的菌種可基本保證其穩定地發酵產BC產量的水平；在接種量為8%、初始pH值為5.2時，最優發酵培養基組成為：葡萄糖2.50%，蔗糖3.00%，玉米漿2.2%，磷酸二氫鉀0.35%，硫酸銨0.150%。在此條件下，葡糖醋桿菌RSZ01發酵產細菌纖維素的產量為12.05g/L，較S-H培養基BC產量（1.02g/L）提高了約12倍。為細菌纖維素高產菌株及其工業化應用研究奠定了堅實基礎。

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Fermentation of Komagataeibacter nataicola RZS01 for bacterial cellulose production

XU Yunhua1，MA Bo1，2，ZHANG Heng2，LUO Li1，ZHANG Lei1，ZHENG Xia1
（1.Department of Life Sciences，Lianyungang Normal College，Lianyungang，222006，China；2.Chemicobiology and Functional Materials Institute of Nanjing University of Science and Technology，Nanjingm，210094，China）

Komagataeibacter nataicolaRSZ01 was used to bacterial cellulose（BC）fermentation tests.The components of fermentation medium were optimized by single factor and orthogonal experiments，and the effects of strain preservation time，inoculum and medium initial pH on BC yield were researched.The results showed that bacteria can guarantee the BC yield basically within preservation time 30 d.In the conditions of inoculum 8%，initial pH 5.2，the optimal fermentation medium components were glucose 2.50%，sugar 3.00%，corn starch 2.2%，monopotassium phosphate 0.35% and ammonium sulfate 0.125%，the BC yield withK.nataicolaRSZ01 fermentation was 12.05 g/L.

Komagataeibacter nataicolaRSZ01；bacterial cellulose；fermentation；conditions optimization

Q939.97

0254-5071（2016）09-0038-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.009

2016-05-16

國家自然科學基金（21206076）；江蘇省高校自然科學研究面上項目（16KJB180034）；江蘇省高等職業院校國內高級訪問學者計劃項目（2015FX032）

許云華（1968-），女，副教授，碩士，主要從事微生物及生理學研究工作。