酵母胞外酶的產酯發酵條件優化研究

王　攀，隗程峰，蔡鳳嬌，汪江波*

（湖北工業大學 生物工程與食品學院 工業發酵湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430068）

酵母胞外酶的產酯發酵條件優化研究

王攀，隗程峰，蔡鳳嬌，汪江波*

（湖北工業大學 生物工程與食品學院 工業發酵湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430068）

以觀音土曲中的一株酵母菌Y2為研究對象，將菌株Y2在發酵培養基培養后取其胞外酶，并將其運用于酯化反應體系中進行催化反應，以產酯能力為評價指標，先后采用單因素試驗和正交試驗優化菌株Y2產酯發酵條件。結果表明，當酵母菌接種量為4%、培養基初始pH值為5、發酵溫度為30℃、發酵時間為4 d時，菌株Y2具有最高產酯力1.24 g/L。

酵母；胞外酶；產酯發酵條件；優化

酯化酶是脂肪酶和酯酶的統稱，它與短碳鏈酯類的合成有關。傳統白酒釀造所用曲含有大量的微生物，它們是白酒釀造的天然“發動機”及“風味調節師”。其中的產酯酵母就是非常重要的一類菌種，它們能代謝產生酯化酶。酯化酶能催化白酒發酵體系中的醇類與酸類發生酯化反應而產生酯類物質。酯類物質是白酒體系的風味調節劑，特別是乙酸乙酯，它在酯類物質中處于主導地位，其含量高低很大程度決定著清香型白酒的質量及風格，是清香型小曲白酒的特征香味成分之一［1-5］。

有研究表明，清香型小曲酒中乙酸乙酯是由生香酵母在發酵過程中利用葡萄糖后首先代謝乙醇和乙酸，而后在酵母產生的酯化酶作用下生成的。因此，篩選適合清香型白酒釀造的優質產酯酵母對清香型白酒優質高效釀造具有重要的實用價值。在清香型小曲酒的釀造過程中，小曲為白酒釀造提供各種酶類，這些酶促使原料所含的淀粉、蛋白質等高分子物質的水解，保證了黃酒發酵的正常進行；同時生長在小曲表面的產酯酵母一方面利用原料進行酒精代謝，另一方面一些產酯酵母分泌酯化酶使得酒體用有以乙酸乙酯為主的酯類物質，賦予白酒酒體獨特的風格，保證了白酒的品質。相比于提高酒體的酒精度，提高酒體的香味物質濃度顯得更加重要［6-9］。

產酯酵母被廣泛用于傳統發酵食品（如白酒、黃酒、葡萄酒、醬油、食醋等）當中。而在白酒行業，與大曲酒相比，清香型小曲原酒中的酯含量較低，具有較大的提升空間。傳統工藝下生產的小曲就存在著品質不穩定及酒體酯類物質含量低等問題，而盲目的改動生產工藝會增大生產成本，為企業帶來巨大的經濟壓力。本研究以觀音土曲中的一株產酯酵母Y2為研究對象，通過對其發酵培養條件的優化提高其分泌胞外酯化酶的能力。這種方法不僅簡單實用，而且對實際清香型小曲酒生產具有極強的指導意義，對小曲白酒傳統技術的改造和提升都有著積極的現實意義［10-15］。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

酵母菌Y2：湖北工業大學生物工程與食品學院實驗室。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，115℃滅菌20 min。

發酵培養基：酵母浸膏1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.1 g，KH2PO40.1 g，MgSO47H2O 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，115℃滅菌20 min。

酚酞指示劑、濃硫酸、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；酵母浸膏、蛋白胨、葡萄糖、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.2儀器與設備

AR3130電子分析天平、FE20型pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；T500普通工業天平：常熟市雙杰測試公司；TG16-WS臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；ZWY-2102C雙層恒溫搖床、ZXFD-B5250鼓風干燥箱：上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-75KB高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠。

1.3方法

1.3.1胞外粗酶液制備

（1）將試管斜面保藏的酵母菌Y2用10 mL無菌水溶解后，倒入盛有100mLPDA培養基的250mL錐形瓶中，30℃、180 r/min恒溫搖床振蕩培養3 d，制成液態種子液，備用。

（2）按試驗設計吸取一定量酵母菌Y2種子液，倒入裝液量為100 mL/250 mL發酵培養基中，并按照試驗設計培養一段時間，離心取上清液（10 000 r/min、5 min），微膜過濾得胞外粗酶液，4℃條件下保存待用。

1.3.2酵母產脂能力測定

（1）酯化反應

準確吸取1 mL乙酸于100 mL容量瓶中，再取20 mL無水乙醇，再加20 mL微膜過濾后的粗酶液，加蒸餾水至刻度線，同時做空白對照，于35℃條件下酯化5 d，待測備用。

（2）總酯含量測定

將酯化完成的待測液置入500 mL具支口的平底蒸餾燒瓶，添加100 mL蒸餾水，加熱蒸餾提取，截取100 mL前餾出液，待測。

總酯含量測定采用皂化中和滴定法：準確吸取上述餾出液50.0 mL于300 mL回流瓶中，加酚酞指示劑2滴，以0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定至粉紅色，30 s不褪色，即為其終點，記錄消耗體積作為總酸含量計算。再準確加入0.1 mol/L NaOH溶液25.0 mL，搖勻，裝上回流冷凝管，于沸水浴中回流30 min（冷凝回流滴下第一滴開始計時），取下冷卻至室溫。然后，用0.1 mol/L硫酸標準溶液滴定至微紅色剛好消失，30 s保持不變色，即為滴定終點，記錄消耗的0.1 mol/L硫酸標準溶液體積。以總酯含量反映菌株總酯含量，總酯含量計算公式如下：

式中：X為發酵液樣品中總酯含量，g/L；C為氧氧化鈉標準溶液的物質的量濃度，mol/L；V為皂化時，加入0.1mol/L氧氧化鈉標準溶液的體積，mL；C1為硫酸標準溶液的物質的量濃度，mol/L；V1為測定時，滴定消耗0.1 mol/L硫酸標準溶液的體積，mL；50為取樣體積，mL；0.088為與1.00 mL氫氧化鈉標準溶液（C=1.000 mol/L）相當的乙酸乙酯的質量，g。

1.3.3產酯發酵培養條件優化的單因素試驗

設定發酵培養基初始pH值分別為3、4、5、6、7，發酵培養溫度分別為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，發酵培養時間分別為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，菌種接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%，考察培養基初始pH值、發酵溫度、發酵時間及菌種接種量對產酯酵母菌Y2總酯含量的影響。

1.3.4產酯發酵培養條件優化的正交試驗

在單因素試驗基礎上，菌種接種量（A）、培養基初始pH（B）、發酵溫度（C）、發酵時間（D）為影響因素，以產酯酵母總酯含量為評價指標，進行L9（34）正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1　產酯發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for esterproducing fermentation conditions optimization

2　結果與分析

2.1產酯發酵培養條件單因素試驗結果

2.1.1菌種接種量對產酯酵母總酯含量的影響

圖1　接種量對酵母Y2產酯力的影響Fig.1 Effect of inoculum on ester-producing ability of yeast Y2

由圖1可知，菌種接種量不同，酵母總酯含量也所有不同，當菌種接種量為4%左右時酵母總酯含量較高，測得總酯含量為1.02 g/L，在接種量為2%～4%時，酵母總酯含量隨著接種量的增加而增大；在接種量為4%時，總酯含量最高；而當接種量＞4%時，酵母總酯含量又會緩慢降低。可能由于在一定生長環境中，菌種數量越多，所產總酯含量也越大，而當接種量增加時，菌種之間存在相互競爭，進而影響其總酯含量。因此，接種量4%為宜。

2.1.2培養基初始pH對酯化酵母總酯含量的影響

圖2　初始pH對酵母Y2產酯力的影響Fig.2 Effect of initial pH on ester-producing ability of yeast Y2

由圖2可知，當發酵培養基初始pH值在3～7范圍內時，酵母的總酯含量呈現先上升后下降的趨勢，當初始pH值為3～5時，酵母的總酯含量隨著pH的升高而增加；當發酵培養基初始pH值為5左右時，該菌株總酯含量達到最高，測定得總酯含量為1.01 g/L；當發酵培養基初始pH值＞5之后，菌株總酯含量有所下降。因此，選擇培養基最佳初始pH值為5。

2.1.3發酵溫度對產酯酵母總酯含量的影響

圖3　發酵溫度對酵母Y2產酯力的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on ester-producing ability of yeast Y2

由圖3可知，發酵溫度在一定范圍內，酵母的總酯含量先升高再降低。當發酵溫度為26～28℃時，酵母的總酯含量隨溫度增高而增加；當發酵溫度為28℃時，酵母的總酯含量達到最高，測定得總酯含量為1.12 g/L；當發酵溫度＞28℃之后，酵母的總酯含量有所下降。可能是一方面當發酵溫度升高時，微生物體內的生化反應和產酶速率都有所提升，所以總酯含量會有一定的提升；而另一方面，溫度超過微生物最適宜生長的范圍，則會使微生物體內的蛋白質變性，導致微生物生長和發酵產酯都受到影響，從而總酯含量下降。因此，選擇28℃為最佳的發酵溫度。

2.1.4發酵時間對酯化酵母總酯含量的影響

圖4　發酵時間對酵母Y2產酯力的影響Fig.4 The effect of fermentation time on ester-producing ability of yeast Y2

由圖4可知，發酵時間在1～5 d時，酵母總酯含量也隨之增加。當發酵培養時間到達4 d時，酵母總酯含量達到相對最高，測定得總酯含量為1.21 g/L；發酵時間＞4 d之后，酵母總酯含量雖然有所增加，但極其平緩。可能隨著發酵時間的增加，產酯酵母快速的生長繁殖并大量的分泌酯化酶，當發酵培養到4 d左右時，生長最為旺盛，酵母總酯含量也相對最高，隨后繼續發酵培養，隨著營養物質的消耗殆盡，菌株生長減緩甚至凋亡，故基本喪失總酯含量。因此，發酵時間4 d較為適宜。

2.2產酯發酵條件優化的正交試驗

根據單因素試驗結果，選擇菌種接種量（A）、培養基初始pH（B）、發酵溫度（C）、發酵時間（D）4個因素，以產酯酵母總酯含量為考察指標，進行4因素3水平L9（34）正交試驗，試驗結果見表2，方差分析見表3。

表2　產酯發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for esterproducing fermentation conditions optimization

表3　正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，4個因素對產酯酵母總酯含量的影響由大到小依次為培養基初始pH＞發酵溫度＞發酵時間＞菌種接種量。由極差分析結果表明，酵母接種量、培養基初始pH、發酵溫度、發酵時間最優的水平組合為A2B2C3D2，即菌種添加量為4%、培養基初始pH為5、發酵溫度為30℃、發酵時間為4 d。在此最佳發酵條件下，總酯含量為1.24 g/L。由表3可知，各因素對酯化酵母總酯含量的影響均不顯著（P＞0.05）。

3　結論

產酯酵母不僅能卓有成效的提高出酒率，且其分泌的酯化酶能促進酯化反應，使酒體協調，進而突出了清香型白酒乙酸乙酯的主體香味，提高清香型白酒的品質。以酯化酵母的總酯含量為考察指標，采用單因素試驗及正交試驗得到最佳發酵條件為接種量4%、培養基初始pH值為5、發酵溫度30℃、發酵時間4 d。在此最佳條件下，產酯酵母Y2具有最高的總酯含量1.24 g/L。

［1］王曉丹，班世棟，胥思霞，等.濃香型大曲中酶系與白酒品質關系研究［J］.中國釀造，2014，33（1）：44-47.

［2］張中義，暢曉霞，鐘其頂.酒曲酶系、菌系特征及釀造過程中微生物動態變化［J］.釀酒，2008（5）：24-29.

［3］羅惠波，黃治國，李浩，等.濃香型大曲原核微生物群落PCR-SSCP解析［J］.微生物學通報，2009（9）：1363-1367.

［4］隋延鐸.產酯酵母在白酒生產過程中的應用［J］.釀酒，2004，31（3）：16-17.

［5］陸振群，薛正蓮.紫外誘變選育高產酯酵母［J］.中國釀造，2012，31（5）：111-113.

［6］徐柏田，吳生文，林培.大曲不同尺寸對特香型大曲儲存期間相關酶活影響的研究［J］.釀酒，2015，42（6）：38-40.

［7］董士偉，吳興權，王德良，等.豉香型白酒產酯酵母的篩選及應用［J］.中國釀造，2012，31（2）：125-128.

［8］陳清嬋，簡清梅，王勁松，等.從自然發酵小麥醬中篩選曲霉及制曲工藝研究［J］.中國釀造，2015，34（4）：86-89.

［9］胡家俊，李銳利，陳茂彬，等.高產乙酸乙酯酵母的菌種選育［J］.食品與發酵科技，2010，46（6）：81-83.

［10］唐潔.清香型小曲酒微生物菌落結構及功能的研究［D］.無錫：江南大學，2012.

［11］艾金忠，馬美榮，聶建光，等.高酯化酶活性紅曲霉及生香酵母在二鍋頭白酒生產中的應用［J］.中國釀造，2013，32（4）：37-38.

［12］王和才，李金生，錢菊根.中國釀酒小曲生產現狀的調查與分析［J］.中國釀造，2011，30（5）：13-15.

［13］姜濤，任國軍，楊玉珍，等.高酸高酯發酵液的制備［J］.釀酒，2015（4）：37-44.

［14］吳赫川，馬瑩瑩，楊建剛，等.川法小曲白酒發展現狀及其瓶頸問題分析［J］.安徽農業科學，2014（33）：50-56.

［15］劉源才，郭圣祥，李銳利，等.高產乙酸乙酯酵母的產酯條件研究［J］.食品與發酵科技，2011，47（2）：22-24.

Optimization of fermentation conditions for producing ester of extracellular enzyme of yeast

WANG Pan，WEI Chengfeng，CAI Fengjiao，WANG Jiangbo*
（Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation，College of Biological Engineering and Food Science，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

With the yeast Y2 from the Guanyintu koji as the research object，the extracellular enzyme fermented by strain Y2 fermentation medium was applied in esterification reaction system for catalytic reaction.Using the ester-producing ability as evaluation index，the ester-producing fermentation conditions of the strain Y2 were optimized by single factor and orthogonal experiments.The results showed that in the conditions of yeast inoculum 4%，medium initial pH 5，fermentation temperature 30℃and time 4 d，the strain Y2 had the highest ester-producing ability（1.24 g/L）.

yeast；extracellular enzyme；ester-producing fermentation conditions；optimization

TS261

0254-5071（2016）09-0055-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.013

2016-04-30

湖北省科技支撐計劃（2013BBA010）

王攀（1992-），男，本科生，研究方向為發酵工程。

汪江波（1962-），男，副教授，本科，研究方向為釀造及酒體設計。