一株產纖溶酶芽孢桿菌的分離鑒定與產酶特性

張振坤，王玉嬌，霍玲玲，袁小轉，孫　瑩，吳建峰*

（1.江蘇今世緣酒業股份有限公司，江蘇 漣水 223400；2.南京工業大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 210000）

一株產纖溶酶芽孢桿菌的分離鑒定與產酶特性

張振坤1，2，王玉嬌1，霍玲玲1，袁小轉1，孫瑩1，吳建峰1*

（1.江蘇今世緣酒業股份有限公司，江蘇 漣水 223400；2.南京工業大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 210000）

從大曲中分離到一株產纖溶酶的芽孢桿菌，命名為B4。該菌革蘭氏染色呈陽性，菌體桿狀，專性好氧，能夠利用甲醇作唯一碳源。通過形態特征觀察、生理生化特性并結合基于16S rDNA序列比對及系統發育分析，鑒定菌株B4為甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。該菌最適生長溫度為35℃，最適發酵初始pH值為7.0，發酵42 h酶活力最高可達649 U/mL。

大曲；纖溶酶；甲基營養型芽孢桿菌；鑒定；產酶特性

血栓是一種常見的心腦血管類疾病。鏈激酶（streptokinase，SK）、尿激酶（urokinase，UK）、葡激酶（staphylokinase，SAK）等是臨床上治療該類疾病的常用藥物，但這些藥物存在著特異性差、半衰期短、需大劑量連續用藥等缺點［1-2］。1987年日本學者從納豆中分離到一種高效纖溶酶——納豆激酶［3］，引起了各界的廣泛關注，產蛋白酶微生物成為重要的產纖溶酶潛在菌種。此后國內外研究人員先后從豆豉、豆醬、魚蝦醬等材料中分離到多株具有產纖溶酶能力的菌株，這些菌株絕大多數屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）及其近緣種群［4-6］。

目前研究篩選纖溶酶產生菌多以高蛋白發酵食品為對象，較少涉及其他材料。大曲是一種傳統的固態發酵酶制劑，是白酒釀造過程中微生物和酶的主要來源。經過長期的培養篩選，大曲中富集了多種產酶性能優良的微生物，其中包括大量產中性或堿性蛋白酶的芽孢桿菌，其所產蛋白酶一般具有活力較高、溫度耐受性較強等特性［7-8］。本研究以釀酒大曲這一傳統固態發酵酶制劑為材料，分離其中的芽孢桿菌，采用酪蛋白平板法初篩、瓊脂糖-纖維蛋白平板法復篩，篩選產纖溶酶能力較強的芽孢桿菌，為挖掘大曲微生物資源、開發高效的纖溶酶提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1大曲及試劑

分菌樣品中高溫大曲：今世緣酒業股份有限公司；牛纖維蛋白原、凝血酶（430 U/瓶）、尿激酶（1 240 U/支）：中國食品藥品檢定研究院；擴增引物27F、1492R：上海生工生物工程有限公司。

1.1.2培養基

斜面與平板培養基采用營養瓊脂培養基：蛋白胨10.0g/L，牛肉浸出粉3.0g/L，氯化鈉5.0g/L，瓊脂粉20.0g/L，121℃滅菌15 min。

酪素培養基：葡萄糖1.0g/L，酵母膏1.0g/L，酪素5.0g/L，K2HPO41.0g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO40.5g/L，瓊脂15.0g/L，pH7.0～7.2，121℃滅菌15 min。

種子培養基：葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min。

發酵培養基：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，K2HPO44.0 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min。

1.2儀器與設備

GHP-9160隔水式恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；HHS214電熱恒溫水浴鍋：江蘇省醫療器材廠；SHZ-82恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；BX-41顯微鏡：日本OLYMPUS公司；KGSX500高壓蒸汽滅菌器：日本TOMY公司；GelDoc2000凝膠成像儀：美國BIO-RAD公司；UV-2550分光光度計：日本島津公司。

1.3實驗方法

1.3.1菌種的分離與篩選

大曲用無菌研缽研碎，取10 g放入無菌三角瓶，加入90mL無菌水，搖床振蕩30min后將三角瓶置于80℃水浴鍋中保溫10min。取1mL菌液逐級稀釋，每個梯度吸取0.1mL涂布營養瓊脂平板37℃條件下培養48 h，根據菌落形狀、大小、表面形態等特征挑取不同的單菌落多次劃線獲得純培養［9］。

粗酶液的制備［10］：將分離獲得的純培養采用稀釋涂布法涂布酪素培養基平板，挑取有明顯溶解圈的菌落接入試管并編號保藏。初篩得到的菌種挑取一環分別接入種子培養基，37℃條件下150 r/min培養18 h，按照4%接種量接到發酵培養基（裝液量60 mL/250 mL）中振蕩培養48 h。發酵液8 000 r/min離心10 min得粗酶液。

菌種篩選：凝血酶和纖維蛋白原作用生成交聯纖維蛋白，呈乳白色，不透明。交聯纖維蛋白被纖溶酶分解后乳白色消失，在瓊脂糖-纖維蛋白平板上形成半透明的溶解圈，以溶解圈的大小反映纖溶酶活力。制作的瓊脂糖-纖維蛋白平板，用直徑3 mm的打孔器打孔［11］。用微量進樣器吸取10 μL粗酶液注入瓊脂糖-纖維蛋白平板上的孔中，同時以不接菌的發酵培養基離心上清液作空白對照，以尿激酶溶液作陽性對照，于37℃條件下溫育并觀察記錄溶解圈情況。

1.3.2纖溶酶活力測定

瓊脂糖-纖維蛋白平板法是測定尿激酶、蚓激酶、納豆激酶等纖溶酶活力的常用方法，纖溶酶活力通常以已知活力值的尿激酶來衡量。將尿激酶溶液梯度稀釋（124 U/mL、248 U/mL、496 U/mL、744 U/mL、992 U/mL、1240 U/mL），各取10 μL點樣于瓊脂糖-纖維蛋白平板上，于37℃條件下溫育15 h后用游標卡尺測量溶解圈垂直的兩個直徑，以溶解圈面積（以互相垂直的兩直徑之積表示，下同）為橫坐標，以尿激酶活力為縱坐標繪制尿激酶標準曲線，得出標準曲線線性方程。同時測定樣品的溶解圈面積，按照尿激酶標準曲線線性方程計算出纖溶酶活力［12］。

1.3.3形態觀察與生理生化鑒定

將分離菌株在營養瓊脂平板上劃線，37℃條件下培養24 h后觀察菌落形態并拍照；參照《常見細菌系統鑒定手冊》［13］中芽孢桿菌屬鑒別特征選擇生理生化實驗項目進行初步鑒定。結合分子生物學鑒定結果參照相關文獻對分離菌株作進一步鑒定［14］。

1.3.4菌株基于16S rDNA的分子生物學鑒定［9，15］

菌株基因組的提取與16S rDNA的擴增：用煮沸法提取的菌株脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）作為模板，采用通用引物27F和1492R進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工測序。16S rDNA序列比對與系統發育樹構建：將測序結果在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上進行基本局部聯配搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源序列比對分析，下載同源性高的模式菌株16S rDNA序列，與試驗菌株的序列一起用ClustalX1.8和MEGA4.0采用鄰接法構建系統發育樹。

1.3.5菌株B4產纖溶酶條件

最適產酶溫度：發酵培養基接種后分別于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃恒溫振蕩培養48 h后，按照1.3.1所述方法制備粗酶液并測定溶解圈面積。最適產酶pH：發酵培養基初始pH分別調為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，于最適溫度下恒溫振蕩培養48 h后，按照1.3.1所述方法制備粗酶液并測定溶解圈面積。生長曲線及最佳產酶時間：在最適溫度、最適pH條件下培養，每隔6 h取發酵液按照1.3.1所述方法制備粗酶液并測定溶解圈面積，并以未接菌的培養基做參比測定波長600 nm處的OD600nm值。

2　結果與分析

2.1產纖溶酶芽孢桿菌的分離篩選

用酪蛋白平板法初篩得到菌株9株，采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法對上述菌株進行復篩，結果見圖1。由圖1可知，有7株菌的粗酶液在瓊脂糖-纖維蛋白平板上產生溶解圈，其編號分別為A3、B2、B4、B6、B7、B8和C6。

圖1　粗酶液在瓊脂糖-纖維蛋白平板上產生的溶解圈Fig.1 Lysis zone of the crude enzyme on agarose-fibrin plates

尿激酶活力與其在纖維蛋白平板上的溶解圈面積呈線性關系，實驗得其標準曲線回歸方程為y=2.824x-875.9，相關系數R2=0.991 0。按照回歸方程計算各菌株發酵液的纖溶活性，結果如表1所示。由表1可知，菌株B4產纖溶酶活力最高，為524 U/mL。菌株B7、菌株B2及菌株B6產纖溶酶活力分別為494 U/mL、436 U/mL、380 U/mL，而菌株A3、菌株B8及菌株C6產纖溶酶活力較低（＜124 U/mL）。因此，選擇菌株B4用于后續試驗。

表1　分離菌株產纖溶酶活力的比較Table 1 Comparison of fibrinolytic enzyme activity produced by isolated strains

2.2菌株B4形態特征

菌株B4的菌落形態及革蘭氏染色結果見圖2。

圖2　菌株B4的菌落形態（A）與革蘭氏染色（B）Fig.2 Colony morphology（A）and gram staining（B）of strain B4

由圖2A可知，菌株B4的菌落近圓形，直徑4～8 mm，扁平，邊緣有缺刻，表面干燥，呈灰白色。由圖2B可知，菌株B4的革蘭氏染色呈陽性，菌體桿狀。

2.3菌株B4生理生化特性

按照《常見細菌系統鑒定手冊》中芽孢桿菌屬鑒別特征，選擇生理生化實驗項目進行初步鑒定，結果見表2。

表2　生理生化實驗結果Table 2 Results of physiology and biochemistry experiments

由表2可知，菌株B4能夠分解酪素和淀粉，液化明膠，V-P測定與觸酶實驗呈陽性，專性好氧，可以利用檸檬酸鹽，不能利用丙酸鹽，發酵D-木糖、D-甘露醇產酸，能夠利用甲醇作唯一碳源。形態特征與生理生化特性符合文獻中關于枯草芽孢桿菌及其近源種的描述［13］。

2.4菌株B4的分子生物學鑒定

選擇產纖溶酶活最高的菌株B4進行16S rDNA序列鑒定，提取菌株B4基因組DNA，將得到的基因組作為模板進行PCR擴增。PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖3。由圖3可知，PCR擴增產物序列長度為1500bp左右。

圖3　菌株B4 16S rDNA PCR擴增產物電泳圖Fig.3 PCR amplification products electrophoresis of 16S rDNA of strain B4

將菌株B4的16S rDNA序列信息遞交到GenBank上獲得登錄號KU059179。序列比對發現菌株B4與枯草芽孢桿菌亞種及其近緣種同源性較高，其中與甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）的同源性最高，達到99.38%。下載同源性高于97%的前14株菌的16S rDNA序列構建系統發育樹，結果見圖4。由圖4可知，菌株B4與甲基營養型芽孢桿菌聚為一支且自展值達到95，與文獻中關于甲基營養型芽孢桿菌生理生化特性和形態特征的報道一致［14］，因此將菌株B4鑒定為甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

圖4　基于16Sr DNA構建的株菌B4系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain B4 based on the 16S rDNA

2.5菌株B4的產酶特性分析

2.5.1發酵溫度對菌株B4產酶的影響

由圖5可知，發酵溫度為35℃時，溶解圈面積最大，溫度過低或過高酶活性均有所下降，尤其發酵溫度＞35℃時，溶解圈面積下降明顯。發酵溫度＜35℃不利于B4的生長繁殖，產酶量少；而發酵溫度過高容易導致纖溶酶失活。因此，確定最佳發酵溫度為35℃。

圖5　發酵溫度對菌株B4產酶的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on enzyme production of strain B4

2.5.2初始pH對菌株B4產酶的影響

由圖6可知，培養基初始pH值為7.0時，溶解圈面積最大，說明中性條件有利于菌株B4產酶，初始pH＜6.5或＞7. 5均對菌株B4產酶不利。因此，最佳初始pH值為7.0。

圖6　初始pH對菌株B4產酶的影響Fig.6 Effect of initial pH on enzyme production of strain B4

2.5.3發酵時間對菌株B4產酶的影響

圖7　發酵時間對菌株B4生長和產酶的影響Fig.7 Effect of fermentation time on the growth and enzyme production of strain B4

由圖7可知，菌體生長的延滯時間很短，接種后很快進入對數生長期，發酵至第18小時時菌體生長達到穩定期，24 h后進入衰退期。接種后0～6 h無溶解圈產生，從第6小時開始大量產生纖溶酶，18 h后產酶速率趨緩，至第42小時發酵液中溶解圈面積達到最高，此后酶活力逐漸下降。可知菌株B4發酵產纖溶酶屬于部分生長偶聯型，產酶滯后于菌體生長。因此，最佳發酵時間為42 h。

3　結論

采用酪蛋白平板法初篩、瓊脂糖-纖維蛋白平板法復篩，從釀酒大曲中分離到一株產纖溶酶活力較高的芽孢桿菌B4。對菌株B4進行了形態學觀察和生理生化試驗，同時進行16SrDNA序列比對并構建了系統發育樹，將菌株B4鑒定為甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。產酶特性實驗結果表明，該菌最適產酶溫度為35℃，最適初始pH值為7.0，發酵42 h產酶活力最高為649 U/mL。

［1］龔麗英，袁樂宏，黃潔，等.口服抗栓藥物的研究進展［J］.中國臨床藥理學雜志，2016，32（3）：279-282.

［2］翁郁華，楊曉彤，楊明俊，等.微生物纖溶酶的多樣性及應用前景［J］.現代生物醫學進展，2010，10（8）：1562-1565.

［3］SUMI H，HAMADA H，TSUSHIMA H，et al.A novel fibrinolytic enzyme（nattokinase）in the vegetable cheese Natto：a typical and popular soybean food in the Japanese diet［J］.Experientia，1987，43（20）：1110-1111.

［4］PENG Y，YANG X J，ZHANG Y Z.Microbial fibrinolytic enzymes：an overview of source，production，properties，and thrombolytic activityin vivo［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2005，69（2）：126-132.

［5］KIM H K，KIM G，KIM D K，et al.Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme fromBacillussp.KA38 originated from fermented fish［J］.J Ferment Bioeng，1997，84（4）：307-312.

［6］THANGJAM A S，KHUNJAMAYUM R D，GIASUDDIN A.Microbial and endogenous origin of fibrinolytic activity in traditional fermented foods of northeast India［J］.Food Res Int，2014，55：356-362.

［7］申孟林，張超，王玉霞.白酒大曲微生物研究進展 ［J］.中國釀造，2016，35（5）：1-5.

［8］王俊英，侯小歌，張杰，等.酒曲中高蛋白酶產生菌篩選及酶學性質研究［J］.中國釀造，2012，31（4）：33-35.

［9］吳建峰，徐巖.白酒酒曲中高產四甲基吡嗪菌株的篩選和鑒定［J］.工業微生物，2013，43（6）：7-13.

［10］梅樂和，胡升，許靜，等.納豆枯草桿菌的篩選和納豆激酶發酵條件優化［J］.浙江大學學報：工學版，2004，38（10）：1355-1360.

［11］王剛，陳光，薛健，等.9株納豆菌產酶活力的比較研究［J］.吉林農業大學學報，2006，28（4）：376-378.

［12］王常蘇，孫曉彤，余潔，等.納豆激酶高活性菌株BN-05鑒定及發酵工藝優化［J］.中國釀造，2014，33（1）：91-95.

［13］東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，2001：353-389.

［14］RAMESH M，ANBUSARAVANAN N.Isolation and growth kinetic studies ofBacillus methylotrophicusP10&P11 from godavarikhani open cast-Iii coal mine soil of the Singareni Collieries，Andra Pradesh［J］.Int J Eng Sci，2015，4（2）：32-38.

［15］楊春霞，廖永紅，劉峻雄，等.牛欄山二鍋頭酒醅中芽孢桿菌分離鑒定及發酵風味分析［J］.食品工業科技，2012，33（9）：69-74.

Isolation and identification of a fibrinolytic enzyme-producingBacillusand its enzyme-production characteristics

ZHANG Zhenkun1，2，WANG Yujiao1，HUO Lingling1，YUAN Xiaozhuan1，SUN Ying1，WU Jianfeng1*
（1.JiangSu King's Luck Brewery Co.，Ltd.，Lianshui 223400，China；2.College of Biological and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 210000，China）

A fibrinolytic enzyme-producingBacillusnamed B4 was isolated fromDaqu.The strain was a Gram-positive，rod-shaped，obligate aerobic bacterium and could use methanol as sole carbon source.According to morphology observation，physiological-biochemical characteristic and phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequence，the strain B4 was identified asBacillus methylotrophicus.The optimum growth temperature of strain B4 was 35℃，the optimum fermentation initial pH was 7.0 and fermentation time was 42 h.Under the conditions，the fibrinolytic enzyme activity could be up to 649 U/ml.

Daqu；fibrinolytic enzyme；Bacillus methylotrophicus；identification；enzyme-production characteristics

Q939.9

0254-5071（2016）09-0064-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.015

2016-05-05

張振坤（1985-），男，助理工程師，碩士研究生，研究方向為應用微生物。

吳建峰（1966-），男，教授級高級工程師，博士，研究方向為釀酒科學。