鉚釘菇D447黑色素高產菌株誘變育種及遺傳穩定性研究

戴德慧，胡偉蓮

（浙江科技學院 生物與化學工程院，浙江 杭州 310012）

鉚釘菇D447黑色素高產菌株誘變育種及遺傳穩定性研究

戴德慧，胡偉蓮

（浙江科技學院 生物與化學工程院，浙江 杭州 310012）

為提高鉚釘菇（Gomphidiussp.）D447的誘變育種的效率，首先對該菌的孢子最佳活化時間及定向篩選劑曲酸的最優添加量進行了研究，結果表明孢子最佳活化時間為6.0 h，曲酸的最優添加量為0.4%。在此基礎上，以紫外線、硫酸二乙酯、氯化鋰、5-溴尿嘧啶等誘變劑對D447的活化孢子進行了單一及復合誘變，通過曲酸平板初篩，搖瓶復篩方法，最終獲得一株黑色素產量為（2.45±0.16）g/L的誘變株DB-3，較出發菌株D447提高了1.57倍。對突變株進行傳代穩定性試驗，結果表明誘變株DB-3經斜面傳代9代以后，黑色素產量仍較穩定，無明顯的回復突變。

鉚釘菇；黑色素；誘變育種；遺傳穩定

天然黑色素是通過多羥基酚氧化而形成結構不規則的非均質的類多酚聚合體，廣泛存在于動物、植物及微生物中［1-4］。黑色素具有重要的生理功能和廣泛應用前景，可作為食用色素、天然染發劑、生物農藥的光保護劑及化工染料等而應用于食品工業、日用化妝品工業、農業等眾多領域［5-7］。此外，作為新型的天然藥物載體、還可用來治療某些與黑色素缺乏相關的神經性疾病，一些可溶性的黑色素在體外還具有抑制人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染宿主細胞的作用［8］。

與動植物源黑色素相比，微生物源黑色素更易實現工業化生產。但目前研究的黑色素合成絲狀真菌，如黑曲霉、米曲霉、黑木耳等［9-10］，其合成的黑色素大多為胞內黑色素，產量極低，難以工業化。絲狀真菌D447從前期寧夏分離得到并鑒定為鉚釘菇（Gomphidiussp.），其在液體培養過程中能產生大量的孢外黑色素。該黑色素難溶于水，溶于堿溶液，對光、熱、金屬離子、蔗糖、葡萄糖穩定［11］。鉚釘菇是常用的藥食同源菌，具有較高的安全性［12］，因此，利用鉚釘菇D447發酵生產黑色素具有較高的應用前景，本研究以鉚釘菇D447為出發菌株，利用多種誘變劑對其黑色素的合成能力進行了提高，以期為黑色素工業化生產提供適合的菌種。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

鉚釘菇（Gomphidiussp.）D447：由本實驗室分離及保存。

1.1.2試劑

黑色素標準品（色譜純）：美國Sigma公司；NaNO3、K2HPO4、KCl、MgSO4、FeSO4、LiCl、蔗糖、曲酸、硫酸二乙酯（均為分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.1.3主要培養基

（1）斜面及孢子著生培養基

NaNO32.0 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖30.0 g，瓊脂20.0 g，水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

（2）液體種子培養基

NaNO32.0 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖30.0 g，水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

（3）發酵培養基

NaNO32.0 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖50.0 g，水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設備

BS224S電子天平：北京賽多利斯系統有限公司；YXQLS-50SII高壓蒸汽滅菌鍋、MJX-250B-Z霉菌培養箱、GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱：上海博訊有限公司醫療設備廠；SW-CJ-1B凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；UV5100分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌種的活化和培養

在超凈工作臺上，將鉚釘菇D447轉接到新鮮的斜面培養基中活化，28℃培養7 d后備用。

1.3.2孢子獲得方法

將無菌水倒入培養7 d的斜面培養基中，用接種環將菌絲刮入無菌水中，倒入鋪有玻璃紙的查氏培養基平板中，涂布均勻后，28℃培養7 d。將玻璃紙上的菌體刮入無菌水中，充分振蕩，用滅菌的帶有三層擦鏡紙的小漏斗過濾除去菌絲，獲取孢子懸液。血球計數板計數孢子個數，備用。

1.3.3孢子萌發時間

將純化好的孢子懸液，加入裝有已滅菌的15 mL查氏液體培養基的100 mL三角瓶中，調整好孢子濃度為106個/mL，在28℃，180 r/min振蕩培養，每隔30 min用顯微鏡觀察孢子萌發狀態。

1.3.4黑色素代謝抑制劑曲酸添加量確定

取制備好的孢子懸液，稀釋成102個/mL，取0.1 mL振蕩均勻的菌懸液分別涂布于曲酸質量分數為0（空白對照）、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的曲酸查氏培養基。

1.3.5鉚釘菇D447誘變劑量的選擇

紫外燈（功率15 W）預熱20 min后，將活化好的孢子懸液（106個/mL）6 mL倒入無菌平皿中，置于磁力攪拌器上，距燈管30cm，打開皿蓋，用紫外線照射。分別在照射5 min、10 min、13 min、16 min、19 min、22 min、25 min、28 min時，取0.1 mL孢子懸液適量稀釋后涂布于查氏培養基上，28℃培養箱內培養4 d，計數菌數總數，根據誘變后的平板總菌落與未誘變的平板總菌落之比計算致死率。

1.3.6硫酸二乙酯對鉚釘菇D447誘變劑量的選擇

活化好的孢子懸液離心除去上清液后，用pH=7.2的0.1 mol/L磷酸緩沖液稀釋至106個/mL，加入硫酸二乙酯溶液至處理液終含量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，作用20 min后。用2%硫代硫酸鈉溶液終止誘變反應。取0.1 mL誘變后的孢子懸液適量稀釋后涂布于查氏培養基上，28℃的培養箱內培養4 d，計數菌數總數，并計算致死率。

1.3.7誘變方法

用制備的活化孢子稀釋成約106個/mL的菌懸液，選取合適劑量的紫外線及硫酸二乙酯處理活化孢子菌懸液，分別涂布含有0.4%曲酸查氏培養基及含有25 μg/mL的5-溴尿嘧啶和0.5%LiCl的0.4%曲酸查氏培養基，28℃培養6 d，挑取黑色或褐色的菌落，斜面保存備用。

1.3.8黑色素高產突變株的復篩

28℃培養6 d后，在篩選培養平板上挑出黑色或褐色的菌落，進行液體發酵培養復篩，28℃，180 r/min振蕩培養9 d，發酵液處理后，測定培養基中的黑色素的含量。

1.3.9誘變株DB-3遺傳穩定性分析

將誘變株DB-3斜面傳代9次，其奇數代次分別接種搖瓶發酵后，發酵液抽提后定量分析黑色素產量，分析誘變株DB-3遺傳穩定性。

1.3.10黑色素測定方法

黑色素標準曲線制定：將黑色素標準品用NaOH溶液（pH=10）分別配制成0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L、0.04 g/L、0.05 g/L、0.06 g/L的黑色素樣品溶液，將這些樣品溶液依次在波長415 nm條件下測定吸光度值，繪制黑色素標準曲線（y=3.436x+0.255，R2=0.998 3）。

發酵完成后，發酵液經5 000 r/min，20 min離心除去菌體。以蒸餾水作空白對照，上清液在波長415nm處測定吸光度值。按照黑色素標準曲線回歸方程，計算樣品黑色素產量。

2　結果與分析

2.1孢子萌發時間

孢子一般是單核的，作為誘變材料優于菌絲，但孢子是處于休眠不活躍狀態的細胞，同時有較厚的孢子壁，不利于誘變劑對孢子的遺傳物質作用。采用剛萌發的孢子能有效提高突變頻率。但孢子出芽時間過長。細胞中會有多個萌發管和兩套以上的細胞核，被誘變后易造成菌株不純［13］。一般認為芽長與孢子長度接近時，作為誘變材料最佳。鉚釘菇D447不同培養時間孢子萌發狀態見圖1。

由圖1可知，鉚釘菇D447孢子在5 h左右開始萌芽，培養6 h后，出芽長度接近孢子長度，因此選擇6 h為孢子活化時間。

圖1　鉚釘菇D447不同時間孢子萌發狀態Fig.1 Growth state ofGomphidiussp.D447 spores at different time

2.2不同質量分數曲酸對鉚釘菇D447的生長及色素合成的影響

不同質量分數曲酸對鉚釘菇D447的生長及色素合成的影響見表1和圖2。

表1　曲酸對黑色素合成的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of kojic acid on melanin synthesis

由表1可知，曲酸對鉚釘菇D447的黑色素合成及菌絲的生長有一定的抑制，其抑制作用隨著曲酸質量分數的增加而增加。由圖1a可知，鉚釘菇D447在無曲酸培養基可以正常合成黑色素，由圖2b可知，當培養基中曲酸質量分數達到0.4%后，鉚釘菇D447幾乎無黑色素合成。曲酸是一種黑色素專屬性抑制劑，能改變黑色素合成關鍵酶酪氨酸酶的立體結構，阻止酪氨酸酶的活化，從而抑制黑色素的形成［14］。在含有一定質量濃度曲酸的培養基中，只有黑色素合成關鍵酶酪氨酶的活性較高的菌株才能合成黑色素。誘變育種是一種非定向的育種方法，通過隨機篩選到高產菌株工作量極大。建立一種高通量、快速方便的高產菌株的初篩方法能大大減少工作量。因此，利用曲酸培養基來初篩黑色素高產菌株是一種非常有益的方法。

圖2　鉚釘菇D447在無曲酸（a）及0.4%曲酸（b）查氏培養中的生長狀態Fig.2 Growth state ofGomphidiussp.D447 on medium without kojic acid（a）and Czapek’s medium with 0.4%kojic acid（b）

2.3紫外照射時間對活化孢子致死率的影響

圖3　紫外線照射時間對致死率的影響Fig.3 Effect of UV irradiation time on lethality rates

誘變劑的劑量與產量性狀誘變作用關系大致趨勢為誘變劑量大，則殺菌率高，單位存活的菌株中正變菌株少，但在不多的正變株中可能篩選到產量提高幅度大的菌株［15］。紫外線照射時間對致死率的影響結果見圖3。由圖3可知，鉚釘菇D447的致死率與照射時間成正相關。當照射19 min時，致死率最高，可達98.6%。為獲得較大的突變幅度，選擇紫外線照射19 min作為紫外誘變處理時間。

2.4硫酸二乙酯誘變質量分數對活化孢子致死率的影響

硫酸二乙酯屬于烷化劑中的硫酸酯類，僅一個烷化基團，對生物毒性小，誘變效應大。不同質量分數硫酸二乙酯對活化孢子致死率的影響結果見圖4。

圖4　硫酸二乙酯對致死率的影響Fig.4 Effect of diethyl sulfate on lethality rates

由圖4可知，硫酸二乙酯質量分數與該菌株的致死率存在較明顯的量效關系，隨著硫酸二乙酯質量分數的增加，致死率明顯提高，當硫酸二乙酯質量分數在1.5%時致死率已經達到60%；在質量分數2.5%時致死率為97.1%，而質量分數在3.0%以上后，其致死率為100%。因此，選擇2.5%硫酸二乙酯作為誘變劑量。

2.5誘變處理結果

通過紫外線、硫酸二乙酯單因子處理及紫外線-氯化鋰、紫外線-5溴尿嘧啶、硫酸二乙酯-5溴尿嘧啶、硫酸二乙酯-氯化鋰復合處理，涂布0.4%曲酸查氏培養基，挑取直徑較大，且色澤較深的菌落，挑出后采用液體發酵復篩，其黑色素產量結果見圖5。

圖5　鉚釘菇D447誘變復篩結果Fig.5 Secondary screening results ofGomphidiussp. D447 mutation

由圖5可知，經過多次誘變與反復篩選后，得到6株黑色素產量變化較高的菌株，其中突變菌株DB-3變異幅度最大，黑色素產量為（2.45±0.16）g/L，是出發菌株D447的1.57倍。黑色素是一種生物大分子聚合物，不同來源的黑色素在結構及功能上均有較大的差異。

2.6突變菌株DB-3遺傳穩定性

取突變株DB-3平行樣本3個，斜面連續傳代9次，比較各奇數代之間的黑色素產量的差異。穩定性試驗結果見表2，各代次試驗結果方差分析見表3。

表2　鉚釘菇DB-3傳代穩定性試驗Table 2 Stability test ofGomphidiussp.DB-3

表3　鉚釘菇DB-3傳代穩定性試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of stability test ofGomphidiussp.DB-3

由表2可知，斜面連續傳代9次，各代次間黑色素的產量變化較小，通過方差分析對各代次間的差異進行了比較（表3），其P值為0.509＞0.05，因此，黑色素產量各代次間無顯著性差異。表明突變株DB-3多次傳代后黑色素產量仍較穩定，無明顯的回復突變。

3　結論

活化孢子有利于誘變劑對孢子的遺傳物質作用。從而有效提高突變頻率。鉚釘菇D447孢子最佳的活化時間為6.0 h。曲酸能有效地抑制鉚釘菇D447的黑色素的合成和菌體的生長，并有明顯的量效關系，當培養基中的添加量為0.4%，黑色素基本不合成。采用紫外線、硫酸二乙酯等理化誘變劑進行多次單一誘變和復合誘變，選育出一株黑色素高產突變株DB-3，其產量為（2.45±0.16）g/L，約是出發菌株的1.57倍，并有較好的遺傳穩定性。

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Mutation breeding ofGomphidiussp.D447 with high yield melanin and its genetic stability

DAI Dehui，HU Weilian
（School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310012，China）

To improve the efficiency of mutation breeding ofGomphidiussp.D447，the optimum spores culture time and kojic acid（directional filtering reagent）addition were studied first，and the results showed that the optimal results were 6.0 h and 0.4%，respectively.On that basis，a mutant strainGomphidiussp.DB-3 with high yield melanin was obtained by treating protoplasts with ultraviolet radiation（UV），diethyl sulfate（DES），LiCl，5-bromouracil（BU）through first screening with kojic acid plate and second screening with shake flask fermentation.The melanin yield ofGomphidiussp.DB-3 increased as much as 1.57 times than that of the original strain，reached（2.45±0.16）g/L.The genetic stability tests showed that the melanin yield of the mutant strainGomphidiussp.DB-3 was stable and there was no obvious back mutation after nine generations.

Gomphidiussp.；melanin；mutation breeding；genetic stability

TQ921

0254-5071（2016）09-0068-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.016

2016-03-16

浙江省科技計劃項目（Z201119605）

戴德慧（1976-），男，副教授，博士，主要從事生物工程方面的教學和科研工作。