NEK2對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2遷移侵襲的影響及其機(jī)制的研究

張東強(qiáng)　　徐細(xì)明　　張美霞

武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北武漢　430060

NEK2對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2遷移侵襲的影響及其機(jī)制的研究

張東強(qiáng)徐細(xì)明▲張美霞

武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北武漢430060

目的 探討NEK2基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞株HepG2遷移侵襲能力的影響及其機(jī)制。方法 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot法檢測(cè)4種人肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7、SMMC、7402中NEK2的表達(dá)水平，并選用正常肝細(xì)胞株LO2作為參考。設(shè)計(jì)siRNA序列轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，將HepG2細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組（細(xì)胞未做任何處理）、陰性對(duì)照組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染無義序列）及干擾組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA序列）。觀察轉(zhuǎn)染前后HepG2細(xì)胞中的NEK2表達(dá)水平變化。利用Transwell小室觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞遷移及侵襲能力的改變。應(yīng)用蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)MMP2、MMP9、TIMP-1蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果5種細(xì)胞株中，NEK2在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)量最高，與LO2細(xì)胞比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA后，與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，干擾組NEK2的表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移，空白對(duì)照、陰性對(duì)照的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（415.00±6.36）、（411.75±9.90），與干擾組比較（99.50±7.07），差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（220.50±6.40）、（219.75± 3.54），與干擾組（38.50±3.54）比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA 48 h后，HepG2細(xì)胞中TIMP-1蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組明顯上調(diào)，而MMP2及MMP9蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論NEK2可能通過TIMP-1、MMP2及MMP9調(diào)控人肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

NEK2；siRNA；遷移；侵襲

［Abstract］Objective To identify the effects of NEK2 on migration and invasion and the related mechanism in human liver cancer cells of HepG2.Methods Real-time PCR and Western blotwere used to detect the NEK2 expression in HepG2，Huh7，SMMC，7402 cell lines and LO2 as the control.To design siRNA sequence to transfect into the HepG2 cells.The experimentwas divided into three groups：blank control（cells with no disposes）；negative control（cellswere transfected withmeaningless sequence）and interference group（cellwere transfected with NEK2-siRNA sequence）.The expression level of NEK2 was observed before and after transfection.The transwell chamberswas employed to detect ability of migration and invasion of HepG2 cells.Western blot approach was used to detect the expression levels of MMP2，MMP9 and TIMP-1.Results In the five kinds of cell lines，the expression of NEK2 was the highest in HepG2 cells，compared with the LO2 cell the difference was significant（P＜0.01）.After transfection of HepG2 cells with NEK2-siRNA，the expression level of NEK2 was attenuated，compared with blank control group and negative control group，the differences were statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Transwell chamber was used to detect cell migration capacity，the transmembrane cell numbers in the blank control group，negative control group were（415.00± 6.36），（411.75±9.90），compared with the NEK2-siRNA group（99.50±7.07），the differenceswere statistically significant（P＜0.01）.Transwell chamber was used to detect cell invasion capacity，the transmembrane cell numbers in the blank control group，negative control group were（220.50±6.40），（219.75±3.54），compared with the NEK2-siRNA group（38.50±3.54），the differenceswere statistically significant（P＜0.01）.The protein expression of TIMP-1 in the NEK2-siRNA group was increased significantly，and the protein expression of MMP2 and MMP9 was decreased，compared with that in the blank control group and negative control group，the differenceswere significant（P＜0.05）.Conclusion NEK2 may regulate invasion and migration of HepG2 cells via TIMP-1，MMP2 and MMP9.

［Key words］NEK2；siRNA；Transference；Invasion

原發(fā)性肝癌是中國(guó)常見的消化系惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增加，每年有超過600 000人死于肝癌［1］。目前對(duì)于肝癌的治療方法仍以早期手術(shù)切除為主，結(jié)合化療、介入、射頻消融等手段［2］，雖可顯著改善患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生命，但對(duì)于肝癌患者，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是常見的死亡原因［3-4］。而現(xiàn)階段對(duì)于肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移這一死亡原因的分子機(jī)制研究并不清楚，前期實(shí)驗(yàn)中，本研究組利用基因芯片發(fā)現(xiàn)mRNA NEK2在原發(fā)性肝癌組織中表達(dá)明顯升高（文章待發(fā)），因此，本研究擬通過小RNA干擾技術(shù)，探討NEK2對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2侵襲遷移的影響及作用機(jī)制的研究。

1　對(duì)象與方法

1.1肝癌細(xì)胞及主要試劑

由武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供HepG2、Huh7、SMMC、7402人肝癌細(xì)胞株及正常細(xì)胞株LO2。從美國(guó)Hyclone公司購(gòu)買胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶EDTA；脂質(zhì)體（LipofectaminerM2000）及Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRRPremix ExTaqTMI均購(gòu)自Takara公司，GAPDH抗體、MMP2、MMP9、TIMP-1抗體、羊抗兔多克隆抗體等蛋白質(zhì)印記法所用相關(guān)抗體購(gòu)自Abcam公司，NEK2及GAPDH引物序列均由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，NEK2上游引物序?yàn)?'-TGTCAGAAGATTCGGAGGAA-3'，下游引物序列為5'-TAACGGACGATGTTTGGATG-3'；GAPDH上游引物序列為5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物序列為5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。根據(jù)NEK2的基因序列，實(shí)驗(yàn)所需的3條NEK2-siRNA序列及陰性對(duì)照siRNA序列 （將目的siRNA序列打亂后重新組合所得的陰性對(duì)照組）均由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。針對(duì)NEK2的靶序列如下：

表1　設(shè)計(jì)的NEK2引物序列

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1肝癌細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞從-70℃低溫冰箱復(fù)蘇后，用含10%FBS的高塘培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2適宜條件下培養(yǎng)。取指數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞用胰蛋白酶消化，離心制成細(xì)胞懸液，以40%～50%接種于6孔板，培養(yǎng)過夜待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。SiRNA制備：245μL無血清無雙抗的高糖培養(yǎng)液稀釋5μL的siRNA，輕輕混勻，室溫靜置5 min；轉(zhuǎn)染試劑制備：245μL無血清無雙抗的高糖培養(yǎng)液稀釋5μL的Lipofectamine2000，輕輕混勻，室溫靜置5min。然后將兩種液體混勻，總體積500μL，室溫下靜止20～30min。吸盡培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，PBS清洗，每孔加入1500μL無血清無雙抗的高糖培養(yǎng)基，再加入500μL siRNA/Lipofectamine 2000的混合物每孔，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，充分混勻，4～6 h后更換成含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)至48 h，用胰蛋白酶消化采集細(xì)胞，繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞提取總RNA，對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量PCR。將實(shí)驗(yàn)分為3組：轉(zhuǎn)染siRNA的HepG2細(xì)胞為干擾組，轉(zhuǎn)染無義序列的HepG2細(xì)胞為陰性對(duì)照組，未經(jīng)任何處理的HepG2細(xì)胞為空白對(duì)照組。

1.2.2Rea l-t ime PCR檢測(cè)NEK2 mRNA的表達(dá) 待HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染至48 h，按照RNA提取的步驟進(jìn)行NEK2 RNA的提取，并用紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度與純度，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用Applied Biosystems@7500 real-time PCR Systems熒光定量PCR儀檢測(cè)NEK2基因的表達(dá)，反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 10μL，cDNA 1μL，DyeⅡ0.4μL，上游引物及下游引物0.8μL，無酶水（RNase Free H2O）7μL，每孔共20μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：95℃10min，95℃15 s，53℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)，根據(jù)SDS軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算 2-ΔΔCt（ΔCt=Ct目的引物-Ct內(nèi)參引物），以 2-ΔΔCt分析NEK2mRNA的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本在相同條件下重復(fù)3次。

1.2.3細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)采用24孔Transwell小室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，孔徑為8.0μm。在24孔板下室中加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基600μL。轉(zhuǎn)染24 h后消化收集細(xì)胞，用PBS洗3次，用無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在小室內(nèi)加入200μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×105/mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。拿出Transwell小室，用棉球擦掉未穿過微孔膜的HepG2細(xì)胞，PBS洗后用4%預(yù)冷多聚甲醛固定10 min，DAPI避光染色5 min，在200倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)同樣采用孔徑為8.0μm 24孔Transwell小室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)區(qū)別的是，需要提前預(yù)冷實(shí)驗(yàn)所需Matrigel膠、槍頭及離心管等，用預(yù)冷的無血清無雙抗培養(yǎng)基按1∶6的體積比稀釋Martrigel膠，取50μL鋪在預(yù)冷的Transwell小室底部膜的表面上，37℃孵育2 h使Matrigel膠凝固。消化收集轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞，PBS洗3次，消化后用無血清無雙抗的高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度為1×105/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入小室，將600μL含10%FBS的高糖培養(yǎng)基加在24孔板下室，于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。拿出小室，用棉球擦掉未穿過微孔膜的HepG2細(xì)胞，PBS洗后用4%預(yù)冷多聚甲醛固定10min，DAPI避光染色5min，在200倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)干擾后相關(guān)蛋白的表達(dá)siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48 h后，加入蛋白裂解液冰上裂解5 min，冷凍離心提取蛋白，進(jìn)行定量，經(jīng)BCA法檢測(cè)蛋白濃度。將每個(gè)蛋白樣品40μg加樣后進(jìn)行8%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PDVF膜上，在含5%脫脂奶粉的TBST中封閉1 h后，然后TBST洗3次，每次10min。分別加入一抗：NEK2一抗（1∶1000稀釋）、MMP2一抗（1∶1000稀釋）、TIMP-1一抗（1∶2000稀釋）、MMP9一抗（1∶1000稀釋）、GAPDH一抗（1∶10 000稀釋）4℃溫育過夜。次日TBST洗3次，再與稀釋1∶10 000羊抗鼠多克隆二抗作用30min，TBST洗3次。最后用ECL顯影液化學(xué)發(fā)光顯影，AlphaEaseFC凝膠圖像軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肝癌細(xì)胞系中NEK2水平的測(cè)定

在4種人肝癌細(xì)胞株HepG2、Huh7、SMMC、7402及正常細(xì)胞株LO2中利用Real-time PCR檢測(cè)NEK2的表達(dá)量，結(jié)果可知：在LO2、Huh7、SMMC、HepG2、7402這5種細(xì)胞株中，NEK2的表達(dá)量在HepG2細(xì)胞中最高，與LO2細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）（圖1A）。Western blot同樣在5種細(xì)胞株中檢測(cè)了NEK2的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞中NEK2的表達(dá)量也是最高（P＜0.01）（圖1B），與Real-time PCR的檢測(cè)結(jié)果一致。因此，選取表達(dá)量最高的HepG2細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

圖1　肝癌細(xì)胞及正常細(xì)胞中NEK2的表達(dá)

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果觀察

2.2.1Rea l-t ime PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞中NEK2 mRNA的表達(dá)量采用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞中NEK2 mRNA的表達(dá)量，檢測(cè)結(jié)果提示：在轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA后，HepG2細(xì)胞中NEK2的表達(dá)量較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組明顯降低，尤其是NEK2-siRNA-2組的NEK2表達(dá)量最低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）（圖2A）。提示siRNA干擾NEK2的效率較高，能顯著降低HepG2細(xì)胞中NEK2的表達(dá)水平。

圖2　分別轉(zhuǎn)染三條干擾序列后HepG2細(xì)胞中NEK2的表達(dá)

2.2.2Wes te rn b l ot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞中NEK2蛋白的表達(dá)量采用Western blot同樣檢測(cè)在轉(zhuǎn)染48 h后HepG2細(xì)胞中NEK2的表達(dá)量，其結(jié)果提示，將灰度值掃描分析，NEK2在轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)量空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組明顯降低，其中在NEK2-siRNA-2組的NEK2表達(dá)量最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2B）。根據(jù)Real-time PCR與Western blot的檢測(cè)結(jié)果可以看出，NEK2-siRNA序列2的轉(zhuǎn)染效果最好，能最大程度地抑制HepG2細(xì)胞中NEK2表達(dá)。因此，本研究挑選NEK2-siRNA-2序列為干擾序列。

2.3 siRNA干擾NEK2后對(duì)HepG2細(xì)胞遷移侵襲能力的影響及其機(jī)制

為了探討NEK2對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，本研究分別進(jìn)行了鋪或不鋪Matrigel膠的Transwell實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA 48 h后，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示：干擾組、空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組穿過微孔膜細(xì)胞數(shù)分別為 （99.5±7.07）、（415.00±6.36）、（411.75±9.9），與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，干擾組中HepG2細(xì)胞的遷移能力降低較為顯著，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖3A：a～c；B：a）。提示NEK2基因?qū)epG2細(xì)胞的遷移具有促進(jìn)作用。

轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA 48 h后，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾組、空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組穿過微孔膜細(xì)胞數(shù)分別為（38.50±3.54）、（220.50±6.40）、（219.75±3.54），與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，干擾組中HepG2細(xì)胞的侵襲能力下降較為顯著，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖3A：d～f；B：b）。提示NEK2基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的侵襲也具有促進(jìn)作用。

為進(jìn)一步說明NEK2對(duì)HepG2細(xì)胞遷移及侵襲的具體影響，后續(xù)還觀察了遷移侵襲相關(guān)因子蛋白水平的變化，Western blot及蛋白定量分析顯示抑制NEK2的表達(dá)后，對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用的蛋白MMP2及MMP9表達(dá)下調(diào)，而抑制轉(zhuǎn)移的相關(guān)蛋白TIMP-1表達(dá)則上調(diào)，與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3C）。說明抑制NEK2的表達(dá)后，MMP2及MMP9蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，TIMP-1蛋白的表達(dá)則上調(diào)，這二者的共同作用導(dǎo)致了HepG2細(xì)胞的遷移侵襲能力的顯著降低。

圖3　轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA-2序列后HepG2細(xì)胞遷移侵襲的影響及其相關(guān)蛋白因子的變化

3　討論

NEK2是一類絲氨酸-蘇氨酸激酶，是重要的中心體蛋白，參與細(xì)胞周期調(diào)控，是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白激酶家族成員之一［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，NEK2高表達(dá)于乳腺癌［6-7］、卵巢癌［8］、結(jié)腸癌［9］、骨髓瘤［10］的細(xì)胞系中，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后均有促進(jìn)作用。體外研究也表明，干擾NEK2基因能增強(qiáng)化療對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制，并促進(jìn)其凋亡［11］。

為了探討NEK2的表達(dá)是否對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2也有影響，本研究采用siRNA技術(shù)干擾NEK2表達(dá)后觀察其對(duì)HepG2細(xì)胞遷移侵襲及其相關(guān)機(jī)制的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Real-time PCR及Western blot檢測(cè)證實(shí)轉(zhuǎn)染效果較成功，能有效地降低干擾組NEK2的表達(dá)水平。早期研究結(jié)果表明［12-13］，通過siRNA技術(shù)發(fā)現(xiàn)下調(diào)NEK2的表達(dá)后，腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移能力降低甚為明顯。基于此，本研究利用Transwell小室觀察轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞的遷移及侵襲能力的改變。Transwell結(jié)果顯示干擾組中穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)量明顯比空白對(duì)照及陰性對(duì)照少，提示對(duì)NEK2基因功能進(jìn)行抑制后，HepG2細(xì)胞的遷移及侵襲能力被抑制。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特征，也是其復(fù)發(fā)和致死的主要原因［14］，而據(jù)我們所知，惡性腫瘤的有著復(fù)雜的侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，大致可歸納為以下幾種：

①腫瘤細(xì)胞之間黏附性降低；②腫瘤細(xì)胞的黏附性增加，與細(xì)胞外基質(zhì)不易分離；③腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生蛋白水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)及血管基底膜，侵犯進(jìn)入血管或淋巴管內(nèi)，癌細(xì)胞可在遠(yuǎn)處增殖形成轉(zhuǎn)移灶［15］。金屬蛋白酶是一組具有降解細(xì)胞外基質(zhì)和血管基底膜能力的蛋白酶，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用［16］。其中MMP2、MMP9是MMPs家族的重要成員，能溶解基底膜的重要組成部分Ⅳ膠原［17］，對(duì)惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移起著正向調(diào)控作用［18］。而金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）是一類能與MMPs形成復(fù)合物，阻止MMPs的水解基底膜作用的分子家族，包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3及TIMP-4四個(gè)分子［19］?；诖耍狙芯窟M(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)染后侵襲相關(guān)蛋白的變化：Western blot結(jié)果提示，沉默NEK2的表達(dá)后，干擾組HepG2細(xì)胞中的MMP2、MMP9的表達(dá)降低，TIMP-1的表達(dá)則升高。從分子水平說明NEK2對(duì)HepG2遷移及侵襲的調(diào)控是通過上調(diào)MMP2、MMP9，下調(diào)TIMP-1實(shí)現(xiàn)的。因此，可推測(cè)NEK2基因在促進(jìn)HepG2細(xì)胞遷移侵襲中有著正向調(diào)控作用，NEK2可能通過上調(diào)MMP9及MMP2，下調(diào)TIMP-1調(diào)控細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

Kokuryo等［20］利用siRNA技術(shù)對(duì)種植于裸鼠體內(nèi)的膽管上皮癌細(xì)胞進(jìn)行NEK2基因沉默，發(fā)現(xiàn)膽管上皮癌的腹膜播散受到明顯抑制。Tsunoda等［12］也用siRNA干擾乳腺癌細(xì)胞株中NEK2基因的表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力也明顯減低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國(guó)外研究者在膽管癌和乳腺癌上關(guān)于NEK2對(duì)惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用一致，這可證實(shí)NEK2對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移確實(shí)起促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究通過siRNA靶向干擾HepG2細(xì)胞中NEK2表達(dá)后，可以有效降低該細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

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Effects of NEK 2 on migration and invasion of HepG2 in hepatoma cells and the related mechanism

ZHANG Dongqiang XU Ximing▲ZHANGMeixia
Cancer Center，Renmin Hospital ofWuhan University，Hubei Province，Wuhan430060，China

R735.7

A

1673-7210（2016）09（b）-0013-05

2016-05-05本文編輯：任念）

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012FKC14301）。

張東強(qiáng)（1969.11-），男，武漢大學(xué)第一臨床學(xué)院2013級(jí)腫瘤專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：消化道腫瘤。